具有葡糖淀粉酶活性的變體的制作方法
【專利說明】
[0001] 序列表的引用
[0002] 所附的是包括SEQ ID NO :1-31的序列表，其全文以引用的方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的變體，并且涉及包含適用于 例如生產(chǎn)食品、飲料（例如啤酒）、飼料、生物化學(xué)品或者生物燃料的這些變體的組合物。本 發(fā)明還公開了編碼所述變體的DNA構(gòu)建體以及在宿主細(xì)胞中生成所述葡糖淀粉酶變體的 方法。此外，公開了例如在釀造工藝中與根據(jù)本發(fā)明的葡糖淀粉酶有關(guān)的不同方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4- α -葡糖水解酶，EC 3. 2. 1. 3)是淀粉水解外切作用糖 酶，其催化從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子的非還原末端移除連續(xù)的葡萄糖單元。葡糖淀 粉酶可水解淀粉（例如，直鏈淀粉和支鏈淀粉）的直鏈的和分支的糖苷鍵。
[0005] 葡糖淀粉酶由多種細(xì)菌、真菌、酵母和植物的株系產(chǎn)生。受到特別關(guān)注并具有 重要商業(yè)價(jià)值的是，葡糖淀粉酶是胞外產(chǎn)生的真菌酶，例如來自以下各屬的菌株：曲霉屬 (Aspergillus)(Svensson et al. , Carlsberg Res. Commun. 48 :529-544(1983)(Svensson 等人，《嘉士伯研究通訊》，第48卷，第529-544頁，1983年）；Boel et al·，EMBO J. 3: 1097-1102(1984) (Boel等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第3卷，第1097-1102頁， 1984 年）；Hayashida et al.，Agric. Biol. Chem. 53 :923-929(1989) (Hayashida 等人， 《農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)》，第53卷，第923-929頁，1989年）；美國專利No. 5, 024, 941 ;美國專 利 No. 4, 794, 175 和 W088/09795);籃狀菌屬（Talaromyces)(美國專利 No. 4, 247, 637 ; 美國專利 No. 6, 255, 084 ;和美國專利 No. 6, 620, 924);根霉屬（Rhizopus) (Ashikari et al.，Agric. Biol. Chem. 50 :957-964(1986) (Ashikari 等人，農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)》，第 50 卷， 第 957-964 頁，1986 年）；Ashikari et al·，App. Microbio· Biotech. 32 :129-133 (1989) (Ashikari等人，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》，第32卷，第129-133頁，1989年）和美國專利 No. 4, 863, 864);腐質(zhì)霉屬（Humicola)(W) 05/052148 和美國專利 No. 4, 618, 579);以及毛 霉屬（Mucor) (Houghton-Larsen et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 :210-217(2003) (Houghton-Larsen等人，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》，第62卷，第210-217頁，2003年））。 已對(duì)編碼這些酶的多個(gè)基因進(jìn)行了克隆，并已使這些基因在酵母、真菌和/或細(xì)菌細(xì)胞中 表達(dá)。在商業(yè)上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，且已被用于許多需要水解淀粉（例如用于從 淀粉產(chǎn)生葡萄糖和其他單糖）的應(yīng)用中。葡糖淀粉酶用于生產(chǎn)高果糖玉米甜味劑，高果糖 玉米甜味劑占據(jù)超過美國50 %的甜味劑市場。
[0006] 通常，在淀粉水解工藝中葡糖淀粉酶可與且通常與α-淀粉酶一起使用，以將淀 粉水解為糊精，然后水解為葡萄糖。然后可將葡萄糖由其他酶（例如葡萄糖異構(gòu)酶）轉(zhuǎn)化 為果糖；結(jié)晶；或用于發(fā)酵以產(chǎn)生多種終產(chǎn)物（例如乙醇、檸檬酸、乳酸、琥珀酸鹽、抗壞血 酸中間體、谷氨酸、甘油和1，3_丙二醇）。通過在含淀粉和/或纖維素的材料的發(fā)酵中使用 葡糖淀粉酶而產(chǎn)生的乙醇可用作燃料來源或用于酒精消費(fèi)。
[0007] 在商業(yè)上用于高葡萄糖玉米糖漿（HGCS)和高果糖玉米糖漿（HFCS)生產(chǎn)的 高固形物濃度下，葡糖淀粉酶通過縮合反應(yīng)合成二糖、三糖和四糖。這是由于淀粉中 α - (1-6)-D-葡萄糖苷鍵的水解緩慢以及由D-葡萄糖形成多種積聚的縮合產(chǎn)物（主要是異 麥芽糖）而引起的。因此，許多常規(guī)工藝中葡萄糖的產(chǎn)率不超過理論產(chǎn)率的95%，全世界通 過該工藝生產(chǎn)的糖漿量是非常大的，即使每噸淀粉的葡萄糖產(chǎn)率有十分小的增加在商業(yè)上 都是重要的。
[0008] 若干葡糖淀粉酶在例如 W0/2008/045489、W0/2009/048488、W0/2009/048487、 US8058033、W0/2011/022465、W02011/020852 和 W02012/001139 中進(jìn)行了描述。
[0009] 在淀粉衍生的碳水化合物的水解中使用葡糖淀粉酶在釀造工業(yè)中越來越重要，特 別是用于生產(chǎn)高發(fā)酵度（有時(shí)稱為低卡路里）啤酒。葡萄糖很容易由酵母轉(zhuǎn)化為醇，從而 使得啤酒廠有可能由發(fā)酵獲得十分高的醇產(chǎn)率并且同時(shí)獲得啤酒，其在殘留碳水化合物方 面是十分低的。將發(fā)酵物用水稀釋至所需的醇百分比，且最終的啤酒作為"低碳水化合物 (low carb)"出售。出于與產(chǎn)品穩(wěn)定性和法規(guī)相關(guān)的原因，使添加的酶活性在最終的啤酒中 除去/失活很重要。遺憾的是，當(dāng)葡糖淀粉酶源自通常來源，例如曲霉屬（Aspergillus)物 種，例如黑曲霉（A. niger)和泡盛曲霉（A. awamori);腐質(zhì)霉屬（Humicola)物種；籃狀菌屬 (Talaromyces)物種，諸如埃默森籃狀菌（T. emersonii);阿太菌屬（Athelia)物種，諸如羅 氏阿太菌（A.rolfsii);青霉屬（Penicillium)物種，諸如產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum)，并且 所述酶在釀造過程中被添加到發(fā)酵容器（FV)中時(shí)，由于所述酶的熱穩(wěn)定性，該要求難以滿 足。
[0010] 雖然將葡糖淀粉酶添加到淀粉糖化容器中，或在麥芽汁煮沸前的任何階段添加， 可以避免該問題，但是這引入了其他實(shí)際困難。美國專利No. 4, 666, 718描述了采用包括釀 造酶葡糖淀粉酶的反應(yīng)器的釀造工藝，該釀造酶葡糖淀粉酶固定在固體載體上，由此可從 產(chǎn)物回收酶。美國專利No. 5, 422, 267A描述了采用表達(dá)重組葡糖淀粉酶的基因工程酵母的 釀造工藝，但是其中該酶由酵母分泌。
[0011] 因此，仍然需要例如具有葡糖淀粉酶活性的組合物形式的葡糖淀粉酶，其可添加 到使用常規(guī)設(shè)備來制備發(fā)酵飲料（諸如啤酒）的常規(guī)工藝中的任何階段，并且其活性可從 最終產(chǎn)物安全地除去。
[0012] 將例如組合物形式的具有水解活性的葡糖淀粉酶變體添加到在制備發(fā)酵飲料中 使用的發(fā)酵容器（FV)中是特別有效的。益處為例如酶劑量降低、淀粉向可發(fā)酵碳水化合物 的轉(zhuǎn)化增加，以及酵母應(yīng)激降低。這種方法并不常用的原因是，活性酶于是可存在于最終產(chǎn) 物中，如上所述這是不期望的。市售葡糖淀粉酶一般是熱穩(wěn)定的，并且在發(fā)酵飲料的巴氏滅 菌過程中施加的能量不足以使酶失活。因此，還需要不耐熱的葡糖淀粉酶，其可在發(fā)酵之后 通過巴氏滅菌來滅活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明涉及葡糖淀粉酶變體，其包含由SEQ ID NO :2的殘基29、43、48、116和502 或親本葡糖淀粉酶中的等價(jià)位置組成的界面氨基酸組中的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸置換；以及由 SEQ ID N0:2的殘基97、98、147、175、483和484或親本葡糖淀粉酶中的等價(jià)位置組成的催 化核心氨基酸殘基組中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸置換。
[0014] 本發(fā)明還涉及能夠編碼本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的核酸。
[0015] 本發(fā)明還涉及能夠表達(dá)本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的核酸。本發(fā)明還涉及質(zhì)?；虮?達(dá)載體，諸如包含核酸或能夠表達(dá)本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還涉 及具有本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的異源表達(dá)的宿主細(xì)胞，以及包含如上定義的質(zhì)粒或表達(dá) 載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及分離、制備和/或表達(dá)本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的方法。
[0016] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的一種或多種葡糖淀粉酶變體的組合物。
[0017] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體或組合物在發(fā)酵中的用途，其中在發(fā)酵步 驟之前或期間添加所述葡糖淀粉酶變體或組合物。
[0018] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的不耐熱葡糖淀粉酶變體用于提高釀造工藝的發(fā)酵步驟中 可發(fā)酵糖的產(chǎn)量的用途。
[0019] 本發(fā)明還涉及包括在發(fā)酵步驟之前或期間添加本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體或組合 物的方法。
[0020] 本發(fā)明還涉及發(fā)酵飲料，其中該發(fā)酵飲料由本發(fā)明的方法制得。
[0021] 本發(fā)明還涉及生產(chǎn)食品、飼料或飲料產(chǎn)品（諸如醇飲料或無醇飲料，例如像啤酒 或威士忌的基于谷類或麥芽的飲料，例如葡萄酒、蘋果酒、醋、米酒、醬油或果汁）的方法， 所述方法包括用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體或組合物來處理含有淀粉和/或糖的植物材料 的步驟。
[0022] 本發(fā)明還涉及生產(chǎn)第一代或第二代生物燃料（諸如生物乙醇）的方法，所述方法 包括用如本文所述的葡糖淀粉酶變體來處理含有淀粉的材料的步驟，以及由這種方法獲得 的產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)生物化學(xué)品（諸如生物基異戊二烯）的方法，所述方法包括用如 本文所述的葡糖淀粉酶變體來處理含有淀粉的材料的步驟，以及由這種方法獲得的產(chǎn)物。 本發(fā)明還涉及如本文所公開的葡糖淀粉酶變體或組合物用于生產(chǎn)第一代或第二代生物燃 料（諸如生物乙醇）或用于生產(chǎn)生物化學(xué)品（諸如生物基異戊二烯）的用途。
[0023] 本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體或組合物；以及所述葡糖 淀粉酶變體或組合物的使用說明。
[0024] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)是在本發(fā)明中不涵蓋任何先前已知的產(chǎn)品、生產(chǎn)所述產(chǎn)品的 工藝或使用所述產(chǎn)品的方法，使得申請人保留該權(quán)利并特此公開放棄對(duì)任何先前已知的 產(chǎn)品、工藝和方法的權(quán)利。還應(yīng)該注意，本發(fā)明無意于在本發(fā)明的范圍內(nèi)涵蓋任何不符合 USPT0(35U.S.C. §112,第一段）或EP0(EPC的第83款）的書面說明和可實(shí)施性要求的產(chǎn) 品、所述產(chǎn)品的制備工藝或使用所述產(chǎn)品的方法，使得申請人保留權(quán)利并特此公開放棄對(duì) 任何先前描述的產(chǎn)品、制備所述產(chǎn)品的工藝或使用所述產(chǎn)品的方法的權(quán)利。
[0025] 應(yīng)該注意，在本公開中，特別是在權(quán)利要求書和/或?qū)嵤├?，諸如"包含"等之類 的術(shù)語可具有的含義是其在美國專利法中的含義；如，它們可意指"包括"等。并且諸如"基 本上由...組成"之類的術(shù)語具有的含義是其在美國專利法中的含義，例如，它們允許沒有 被明確敘述的元素，但排除現(xiàn)有技術(shù)中存在的或影響本發(fā)明的基本特征或新特征的元素。
[0026] 這些以及其他實(shí)施例在下面的【具體實(shí)施方式】中公開或根據(jù)下面的【具體實(shí)施方式】 顯而易見并且為下面的【具體實(shí)施方式】所涵蓋。
【附圖說明】
[0027] 下面的以舉例的方式給出但無意于將本發(fā)明只局限于所描述的具體實(shí)施例的具 體實(shí)施方式可結(jié)合附圖得到更好地理解，其中：
[0028] 圖 1 是入門載體：A)pEntry_GA CS4 和 B)pEntry_GA wt 的示意圖。
[0029] 圖 2 是表達(dá)載體：A) pTTT-pyrG13-GACS4 和 B) pTTTpyr2-GACS4 的示意圖。
[0030] 圖3描繪了 TrGA變體的SDS-PAGE分析結(jié)果。上圖為里氏木霉（Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶變體：R_C_1、R_C_2、R_C_5、R_C_12、R_C_7、R_D_2、R_D_3 和 R_D_5 ;下 圖為變體 R_C_13、R_C_22、R_A_1、R_A_2、R_A_6、R_A_7 和 TrGA(wt)。對(duì)于每個(gè)變體而言， 在括號(hào)中示出的是葡糖淀粉酶活性（GAU/mL)。
[0031] 圖4描繪了 TrGA變體的SDS-PAGE分析結(jié)果。在上圖中，如圖中所繪那樣示出了 里氏木霉葡糖淀粉酶變體CPS3-B01至CPS2-E08,以及空載體和TrGA-CS4的發(fā)酵產(chǎn)物。對(duì) 于每個(gè)變體而言，在括號(hào)中示出的是葡糖淀粉酶活性（GAU