專利名稱：麥芽低聚糖苷衍生物，用于測定α-淀粉酶活性的試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的麥芽低聚糖苷衍生物、含有該衍生物作為有效成分用于測定α-淀粉酶活性的試劑和用該衍生物有效而精確地測定α-淀粉酶活性的方法。
迄今，測定體液如血清、尿、胰液和唾液中α-淀粉酶活性對臨床診斷是很重要的，并且在診斷急性或慢性疾病如肝炎、胰腺炎、胰腺癌和流行性腮腺炎中是必要的項目。
迄今已知有多種測定α-淀粉酶活性的方法。其中之一方法包括目前已被廣泛采用的、用一化合物(對偶合酶的水解具有抗性(穩(wěn)定性))作為底物的方法，該化合物中的取代苯基麥芽低聚糖苷之非還原末端葡萄糖被多種取代基所修飾。所說的方法是用α-淀粉酶裂解該化合物，并用偶合酶處理裂解產(chǎn)物，隨后直接或(若有必要)在調(diào)節(jié)pH之后，或在苯酚的縮合之后對得到的取代苯酚進行定量的比色測定。
在上述方法中所用的底物一般需具有這樣的特性，即底物的D-葡糖苷鍵只有一個被水解，水解的作用方式和反應(yīng)速度不隨兩種α-淀粉酶(同功酶)而變化，水解產(chǎn)物不再被α-淀粉酶進一步水解，底物對α-淀粉酶具有高親和力(即，Km值小)并具有高水解率，同時底物具有極好的水溶性。然而，迄今尚未發(fā)現(xiàn)完全滿足這些要求的具有修飾的非還原末端的底物。
本發(fā)明的目的在于克服測定α-淀粉酶活性的常規(guī)試劑和用這些試劑的測定方法存在的上述缺點，并提供一種適用于有效而精確地測定α-淀粉酶活性的新化合物和一種用該化合物作為試劑測定α-淀粉酶活性的新方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明已進行了認真的研究。結(jié)果，他們已發(fā)現(xiàn)一種全新的麥芽低聚糖苷衍生物作為測定α-淀粉酶活性的試劑是非常適用的并且用該試劑測定α-淀粉酶活性可達到上述目的。
也就是說，本發(fā)明提供了式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物;一種含有式(Ⅰ)所示化合物作為有效成分用于測定α-淀粉酶活性的試劑;一種測定α-淀粉酶活性的方法，該方法包括將式Ⅰ化合物的α-異頭物和α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶，或它們的混合物加到含有α-淀粉酶的樣品中，以進行酶促反應(yīng)，并定量測定釋放出的芳香發(fā)色化合物;以及一種測定α-淀粉酶活性的方法，該方法包括將式Ⅰ所示化合物的β-異頭物或其α-異頭物和β-異頭物的混合物，α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶和β-葡糖苷酶加到含有α-淀粉酶的樣品中，以進行酶促反應(yīng)并定量測定釋放出的芳香發(fā)色化合物，
其中n代表整數(shù)3～5，R代表芳香發(fā)色團，X代表≥CHCH2N3或≥C＝CH2，Y代表氫原子，取代或未取代的烴基或烷磺酰基或芳磺?；?br>
作為本發(fā)明式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物的麥芽低聚糖部分，可使用所有相應(yīng)于α-和β-D-麥芽戊糖至α-和β-D-麥芽庚糖范圍內(nèi)的糖。
式(Ⅰ)中的X代表≥CHCH2N3或≥C＝CH2，在≥CHCH2N3中CH的H具有在環(huán)平面下方成鍵的構(gòu)象。
另一方面，Y代表氫原子，取代或未取代的烴基或烷磺酰基或芳磺?；?。作為取代或未取代的烴基，可提及的有直鏈，支鏈或環(huán)狀烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丁基或環(huán)己基，芳烷基，例如芐基，和芳基，例如苯基、甲苯基和萘基。這些烷基、芳烷基和芳基可被官能團如酰基、烷氧基、羧基、硝基、鹵原子、烷基甲硅烷基和磺?；〈?，并且烷基可以是不飽和基團如乙烯基和烯丙基。
作為上述烷磺酰基或芳磺?；?，可提及的有例如甲磺?；⒓妆交酋；蜞酋；?。
此外，式(Ⅰ)所示麥芽低聚糖苷衍生物中，作為取代還原末端葡萄糖1位上羥基的芳香發(fā)色團R，可使用任何能進行光學(xué)測定的基團。例如，可提及的有下式所示的基團
其中R1-R5可以相同或不同，可以代表氫原子、鹵原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，或R1和R2或R2和R3可鍵合起來形成一個稠合的芳環(huán)，
其中R6代表氫原子或烷基，
其中R7代表氫或鹵原子，和
其中R8-R15可以相同或不同，可以代表氫原子、鹵原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，R8和R9或R10和R11可鍵合起來形成一個稠合的芳環(huán)，R9和R10和/或R13和R14可分別代表一個共用氧原子以形成一個稠合的醚環(huán)，Z代表氮原子或N→O。
此外，式(Ⅰ)麥芽低聚糖苷衍生物既可以是α-異頭物(α-葡糖苷)，也可以是β-異頭物(β-葡糖苷)。
上述式(Ⅰ)所示的化合物包括，例如，2-氯-4-硝基苯基66-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲磺?；?β-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-β-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺?；?β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基67-疊氮基-67-脫氧-α-D-麥芽庚糖苷，2，4-二氯苯基67-疊氮基-67-脫氧-47-O-甲苯磺?；?β-D-麥芽庚糖苷，靛酚基(phenolindo)-31-氯苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲基-β-D-麥芽戊糖苷，4-甲基繖形酮基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷，刃天青基56-烯醇式-α-D-麥芽己糖苷，熒光素基67-疊氮基-67-脫氧-47-O-烯丙基-β-D-麥芽庚糖苷，或靛酚基-31-氯苯基55-烯醇式-45-O-(2-甲氧基)乙氧基甲基-β-D-麥芽戊糖苷。
在這方面，上述符號如65-，67-，45-和47意指從構(gòu)成麥芽低聚糖的葡萄糖單位之還原末端側(cè)起第5個和第7個葡萄糖(即，具有非還原末端的葡萄糖單位)的6位和4位上的羥基被取代。
迄今，在對麥芽三糖的非還原末端上化學(xué)修飾的研究中，已知1，6-脫水-61-疊氮基-61-脫氧-β-麥芽三糖八乙酸鹽可作為修飾的麥芽三糖的中間體〔“Carbohydrate Research”，51，73-84(1976)〕。該化合物相當(dāng)于其中n等于1的式(Ⅰ)化合物，但不同點在于該已知化合物具有分子內(nèi)醚結(jié)構(gòu)，無發(fā)色團，是乙酰衍生物。而且，其中n等于1的式(Ⅰ)化合物幾乎不能被α-淀粉酶作用，因此不適于用作測定α-淀粉酶活性的底物，以致它不能被用于本發(fā)明的目的。
本發(fā)明式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物是一種尚未見文獻記載的新化合物，并且能夠不受特殊限制地使用任何制備方法。
也就是說，式(Ⅱ)所示的D-麥芽低聚糖苷
其中R和n的定義同上，是市場上可買到的或可用熟知的生產(chǎn)方法得到，例如應(yīng)用2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基α-D-麥芽庚糖苷和靛酚基-31-氯苯基β-D-麥芽戊糖苷作為起始原料，并且使式(Ⅲ)所示的羰基化合物或它的縮醛或縮酮與D-麥芽低聚糖苷反應(yīng)，得到式(Ⅳ)所示的4，6-O-烷氧基亞甲基化麥芽低聚糖苷衍生物
式Ⅲ中R16代表氫原子，甲氧基、乙氧基、烷基或芳基，R17代表甲氧基或乙氧基，
式Ⅳ中R16和R17，R和n的定義同上，例如2-氯-4-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亞甲基-β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基47，67-O-(1-甲氧基)亞乙基-α-D-麥芽庚糖苷和靛酚基-31-氯苯基45，65-O-(1-乙氧基)亞乙基-β-D-麥芽戊糖苷。
作為式(Ⅲ)所示的羰基化合物或它的縮醛或縮酮，可提及的有例如四甲氧基甲烷，原乙酸三乙酯或原乙酸三甲酯。
制備式(Ⅳ)所示的4，6-O-烷氧基亞甲基化麥芽低聚糖苷衍生物的反應(yīng)一般是在非質(zhì)子傳遞極性溶劑如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，二甲亞砜(DMSO)或六甲基磷酸三酰胺(HMPA)中，在催化劑如對甲苯磺酸，氯化氫，硫酸，無水氯化鋅和強酸性離子交換樹脂存在下進行。
如此得到的式(Ⅳ)所示的4，6-O-烷氧基亞甲基化麥芽低聚糖苷衍生物可被酰化為4，6-O-烷氧基亞甲基化?；溠康途厶擒昭苌?，例如2-氯-4-硝基苯基十四烷-O-乙酰-45，65-O-二甲氧基亞甲基-β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基十二烷-O-苯甲酰-47，67-O-(1-甲氧基)亞乙基-α-D-麥芽庚糖苷和靛酚基-31-氯苯基十四烷-O-丁酰-45，65-O-(1-乙氧基)亞乙基-β-D-麥芽戊糖苷。在這種情況下，作為?；瘎?，可使用羧酸如乙酸，一氯乙酸丙酸、正丁酸和苯甲酸，或其反應(yīng)衍生物如酸酐，酰氯和酯。?；臈l件不是關(guān)鍵性的，可使用常用于?；臈l件。
接著對如此制得的4，6-O-烷氧基亞甲基化?；溠康途厶擒昭苌镞M行脫烷氧基亞甲基化反應(yīng)，以制備式(Ⅴ)所示部分?；柠溠康途厶擒昭苌?
其中R18代表酰基，R和n的定義同上，例如2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙?；?α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖苷和4-硝基苯基O-(2，3-二-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3 6-三-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡糖苷。上述脫烷氧基亞甲基化的條件不是關(guān)鍵性的，并且該反應(yīng)可用熟知的方法進行，例如使乙酸和甲酸與4，6-烷氧基亞甲基化?；溠康途厶擒昭苌锓磻?yīng)(例如見J.Am.Chem.soc.，84，430(1962)〕。
接著使如此制得的式(Ⅴ)所示部分酰化的麥芽低聚糖苷衍生物與大量的烷磺酰氯或芳磺酰氯(如甲苯磺酰氯和萘磺酰氯)反應(yīng)，以只對6-位上的羥基進行烷磺酰化或芳磺?；?，然后修飾4一位上的羥基，以制備式(Ⅵ)所示?；酋｛溠康途厶擒昭苌?
其中n，R和R18的定義同上，W1代表烷磺酰基或芳磺?；?，W2代表酰基，取代或未取代的烴基或烷磺?；蚍蓟酋；?，例如2-氯-4-硝基苯基十五烷-O-乙?；?65-O-甲苯磺?；?β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基十四烷-O-丁?；?45-O-乙?；?65-O-萘磺酰-α-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基十二烷-O-苯甲酰-47-O-甲磺?；?67-O-甲苯磺?；?β-麥芽庚糖苷，和靛酚基-31-氯苯基十四烷-O-氯乙?；?65-O-(2，4-二甲基)苯磺酰-45-O-甲基-β-D-麥芽戊糖苷。
上述6-位上羥基的烷磺酰化或芳磺?；?W1的引入)條件不是關(guān)鍵性的，并且該反應(yīng)通常按下法進行在吡啶或在非極性溶劑如二氯甲烷和甲苯中，在堿例如三乙胺和二氮雜雙環(huán)十一烷(DBU)存在下，不經(jīng)加熱，用3-30摩爾當(dāng)量的大量烷基-或芳基磺酰鹵處理部分酰化的麥芽低聚糖苷衍生物。
此外，為了將取代基W2引入到4-位羥基上，?；窃谑?Ⅰ)中Y代表氫原子的情況下進行的，而烴基的引入，例如烷基化或芳烷基化或烷磺?；蚍蓟酋；潜匾獣r在其它情況下進行的。這些反應(yīng)可按以下方法進行，例如在?；闆r下按以上列舉的方法進行，烷基化是在氫氧化鉀存在下，于DMSO中用烷基鹵進行處理〔例如，Tetrahedron，35，2169(1979)〕芳烷基化是在氫化鈉存在下，于苯中與芳烷基鹵進行反應(yīng)〔例如，J.Chem.Soc.88，82(1966)〕，烷磺酰化或芳磺?；窃谶拎ぶ信c磺酰氯進行反應(yīng)〔例如Methods of Carbohydrate Chem.，63，99(1978)〕。當(dāng)Y為烷磺酰基或芳磺?；鶗r，4-位和6-位上的羥基可同時被磺?；缤ㄟ^延長反應(yīng)時間，或提高反應(yīng)溫度或使用非大量的烷磺?；蚍蓟酋；瘎┤缂谆酋Ｂ?。
當(dāng)X代表＞CHCH2N3時，用碘化鈉或溴化鈉處理如上制得的式(Ⅵ)所示的?；酋；溠康途厶擒昭苌?，以形成6-碘代或6-溴代衍生物，然后與例如疊氮化鈉反應(yīng)，以制備式(Ⅶ)所示的?；B氮基麥芽低聚糖苷衍生物
其中n，R，R18和W2的定義如上，例如，2-氯-4-硝基苯基十五烷-O-乙?；?65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基十四烷-O-丁?；?45-O-乙?；?65-疊氮基-65-脫氧-α-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基十二烷-O-苯甲酰基-67-疊氮基-67-脫氧-47-O-甲磺?；?β-D-麥芽戊糖苷或靛酚基-31-氯苯基十四烷-O-氯乙酰基-65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲基-β-D-麥芽戊糖苷。
6-位上羥基的碘化、溴化或疊氮化條件不是關(guān)鍵性的，并且該反應(yīng)通常按下法進行在非質(zhì)子傳遞溶劑如DMSO，DMF，HMPA和甲乙酮中，將上述酰基磺?；溠康途厶擒昭苌锛訜岬匠Ｓ玫臏囟龋⒂?-50摩爾當(dāng)量的碘化鈉，溴化鈉或疊氮化鈉處理。在這一方面，不需要逐步進行碘化或溴化，然后在得到6-碘代或6-溴代衍生物之后再進行疊氮化反應(yīng)，這些反應(yīng)可在同一反應(yīng)系統(tǒng)中連續(xù)地進行。6-溴代衍生物也可通過用NBS處理上述的4，6-O-烷氧基亞甲基化酰基麥芽低聚糖苷衍生物來制備。在這種情況下，W2代表?；?。
當(dāng)X代表＞C＝CH2時，可用碘化鈉或溴化鈉處理如此制得的式(Ⅵ)所示的?；酋；溠康途厶擒昭苌?，以形成6-碘代或6-溴代衍生物，接著用脫鹵化氫劑如氟化銀處理該衍生物，以制備?；?不飽和-麥芽低聚糖苷衍生物(Ⅶ′)
其中n，R，R18和W2的定義同上，例如，2-氯-4-硝基苯基十四烷-O-乙酰-55-烯醇式-45-O-甲磺酰基-β-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基十四烷-O-丁酰基-45-O-乙酰-55-烯醇式-α-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基二十一烷-O-苯甲酰-57-烯醇式-β-D-麥芽庚糖苷或靛酚基-3′-氯苯基十四烷-O-氯乙酰-55-烯醇式-45-O-甲基-β-D-麥芽戊糖苷。
6位上羥基進行碘化或溴化的條件不是關(guān)鍵性的，并且該反應(yīng)例如可按上述方法進行。脫去鹵化氫的條件也不是關(guān)鍵性的，并且該反應(yīng)可按下法進行在吡啶中用2-20摩爾當(dāng)量的氟化銀處理上述6-碘代或6-溴代衍生物至常用的溫度，或在上述極性非質(zhì)子傳遞溶劑中在加熱或不加熱情況下用5-50摩爾當(dāng)量的堿(如DBU)處理。
最后，脫去式(Ⅶ)或(Ⅶ′)所示的酰基麥芽低聚糖苷衍生物的酰基，得到式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物的優(yōu)選化合物，其中當(dāng)W2代表?；鶗r，Y代表氫原子，而當(dāng)W2代表取代或未取代的烴基或烷磺?；蚍蓟酋；鶗r，Y代表與W2相同的基團。脫?；臈l件也不是關(guān)鍵性的，例如可在醇如甲醇中，用堿如碳酸鉀、氨水和氰化鉀處理?；溠康途厶擒昭苌铩惨姟癙rotective Groups in Organic Synthesis by Theodora W.Greene，pp.50-55，1980，JOHN WILEY & SONS，New York〕。
制備式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物的另一方法，可提及的有例如通過用熟知的環(huán)狀糊精酶〔例如見日本專利公開3-86701〕處理按熟知的方法〔例如見Carbohyd.Res.，18，29-37(1971)〕制備的6-疊氮基-6-脫氧環(huán)狀糊精，然后用外型糖化酶如葡糖淀粉酶處理，以得到其中在非還原末端葡萄糖的6位羥基被疊氮基所取代的麥芽低聚糖，并按熟知的方法〔例如見日本專利公開60-78994〕將芳香發(fā)色團引入到該麥芽低聚糖上來制備上述衍生物，或通過將上述6-疊氮基-6-脫氧環(huán)狀糊精加到市售的或熟知的具有芳香發(fā)色團作為糖苷配基的葡萄糖苷中，用熟知的酶，環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶處理，最后用外型糖化酶如葡糖淀粉酶處理來制備上述衍生物。
如此制得的麥芽低聚糖苷衍生物(Ⅰ)對于測定α-淀粉酶活性是非常有用的，因此可用麥芽低聚糖苷衍生物測定α-淀粉酶活性。
如上所述，式(Ⅰ)的麥芽低聚糖苷衍生物具有α-異頭物和β-異頭物。當(dāng)在測定α-淀粉酶活性中只使用α-異頭物時，需要α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶作為偶合酶系統(tǒng)。當(dāng)只用β-異頭物或α-異頭物和β-異頭物的混合物時，除需要α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶或二者之外還需要β-葡糖苷酶，必要的話，也可用β-淀粉酶。
作為一種有利于測定α-淀粉酶活性的系統(tǒng)值得一提的是pH4-10的系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有0.1-10mM式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物，2-300mM緩沖劑，作為偶合酶的濃度為5-1000單位/ml的α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶，當(dāng)使用β-葡糖苷酶時，其濃度為0.5-30單位/ml。在該系統(tǒng)中所用的緩沖劑包括，例如，磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、Good氏緩沖劑、硼酸鹽、檸檬酸鹽或二甲基戊二酸鹽。
α-葡糖苷酶可得自于任何來源，例如動物、植物和微生物，以得自于酵母者為宜。同樣，葡糖淀粉酶也可得自于任何來源，以得自于Rizopus種的酶為宜。再者，β-葡糖苷酶也可得自于任何來源，例如可使用得自于杏仁的β-葡糖苷酶。
β-淀粉酶也可得自于任何來源，例如可使用得自于細菌或植物的β-淀粉酶。
除上述成分之外，若有必要還可向這一系統(tǒng)中加入各種常規(guī)添加劑如甘油、牛血清白蛋白、α-或β-環(huán)狀糊精和Triton X-100作為助溶劑或穩(wěn)定劑，但它們不應(yīng)削弱本發(fā)明的目的。作為α-淀粉酶活化劑，也可加入Cl-，Ca2+或Mg3+離子，它們可以NaCl，MgCl2，MgSo4，CaCl2或CaCl2·H2O的形式應(yīng)用。在制備上述系統(tǒng)的合適步驟中，以上添加劑可以單獨地應(yīng)用，或者合并使用上述二種或二種以上的添加劑。
本發(fā)明的試劑可以干燥產(chǎn)品或溶液形式或以膜載體如薄片形式使用，或使用其中該試劑已浸漬到紙中的浸漬紙形式。通過使用本發(fā)明的試劑，可用簡便的方法以高靈敏度精確地測定各種樣品中所含α-淀粉酶的活性。
在附圖中
圖1是用于在實施例5中測定α-淀粉酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
圖2是用于在實施例6中測定α-淀粉酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
圖3是在實施例9的測定系統(tǒng)中本發(fā)明的底物和參照底物之穩(wěn)定性的圖示;
圖4是在實施例10的測定系統(tǒng)中本發(fā)明的底物和參照底物之穩(wěn)定性的圖示。
現(xiàn)參照優(yōu)選實施方案來說明本發(fā)明的方法。
首先，將5-1000單位/ml，優(yōu)選10-500單位/ml的α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶或二者作為偶合酶加到含有α-淀粉酶的樣品中。當(dāng)式(Ⅰ)的麥芽低聚糖苷衍生物含有β-異頭物時，還要加入0.5-30單位/ml，優(yōu)選1-15單位/mlβ-葡糖苷酶，與此同時或在此之后，連同緩沖劑一起加入0.1-10mM，優(yōu)選0.3-5mM的麥芽低聚糖苷衍生物。隨后在溫度為25-45℃，優(yōu)選35-40℃，pH為4-10，優(yōu)選6-8的條件下使混合物經(jīng)歷酶反應(yīng)至少1分鐘，優(yōu)選2-10分鐘。生成的芳香發(fā)色團的吸光度變化，可直接或在調(diào)節(jié)pH之后或以常用方法進行縮合之后，在合適的波長下連續(xù)或間歇進行測定，樣品中α-淀粉酶的活性可通過將上述吸光度與預(yù)先測定的標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶樣品的吸光度進行比較來計算。α-淀粉酶的活性也可根據(jù)芳香發(fā)色團的吸光系數(shù)計算。
雖然用于本發(fā)明的含有α-淀粉酶的樣品可以是具有α-淀粉酶活性的樣品，但這不是關(guān)鍵性的，可專門使用微生物培養(yǎng)液，植物提取物，或動物的體液或組織及其提取物。當(dāng)含有α-淀粉酶的樣品是固體時，最好將它事先溶解或懸浮于純化水或如上所述的緩沖劑中。另外，可通過象過濾操作除去不溶物。
本發(fā)明式(Ⅰ)所示的麥芽低聚糖苷衍生物是一種符合作為底物所有要求的新化合物，它非常適合用作測定α-淀粉酶活性的試劑。通過使用上述衍生物，對存在于樣品中的葡萄糖、麥芽糖、膽紅素或血紅蛋白無任何影響的情況下，可用自動分析的方法或人工操作的方法在短時間內(nèi)精確而容易地測定α-淀粉酶活性。
本發(fā)明的化合物在一段長時間內(nèi)是穩(wěn)定的并且還具有增加作為底物效用的另外的優(yōu)點。
參照實施例可進一步詳述本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
在各個實施例中，除另外規(guī)定外，最大吸光度的波長是在甲醇中測定的，并且旋光度是在25℃下用鈉光譜中D線測定的。
實施例12-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺?；?β-D-麥芽戊糖苷的制備(1)2-氯-4-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亞甲基-β-D-麥芽戊糖苷的制備將15.0g(15.2mmol)市售2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽戊糖苷溶于75ml無水DMF中，并進一步加入15.0ml(113mmol)四甲氧基甲烷和7.5gAmberlyst(15E)商標(biāo)(日本ORGANO公司產(chǎn)品)?；旌衔镉?5℃攪拌4小時使進行反應(yīng)。接著，在攪拌和冰冷卻條件下將反應(yīng)混合物緩慢滴加到2.01的100mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中。所得混合物經(jīng)ODS(十八烷基硅膠)柱層析純化，用乙腈-水混合溶液(體積比為3∶7)洗脫所需級分，濃縮并用異丙醇-甲醇重結(jié)晶，得到10.7g2-氯-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亞甲基-β-D-麥芽戊糖苷(10.1mmol，產(chǎn)率66.5%)。
熔點(℃)93.0-95.0(同時分解)紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔(λmax〕(nm)＝295(logε＝3.95)，227(sh)，209(logε＝4.17)。
紅外光譜(cm-1)3420，2940，1648，1588，1524，1490，1352，1276，1246，1154，1082，1050，1026，930，898.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.25-3.85(m)，3.23(3H，s)，3.30(3H，s)，3.89(1H，d，J＝3.9 Hz)，4.30-4.70(m)，5.04(2H，d，J＝3.2 Hz)，5.10(1H，d，J＝3.7 Hz)，5.12(1H，d，J＝3.4 Hz)，5.27(1H，d，J＝7.6 Hz)，5.25-5.70(m)，7.47(1H，d，J＝9.3 Hz)，8.19(1H，dd，J＝9.3 Hz，2.7 Hz)，8.31(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Lnc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝1∶4(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝10.2分鐘。
旋光度〔α〕(C0.50，50mM磷酸鹽緩沖劑)+86.7°。
元素分析C39H58ClNO30C H N計算值(％) 44.35 5.53 1.33實測值(％) 44.55 5.43 1.34(2)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將實施例1步驟(1)中得到的2-氯-4-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亞甲基-β-D-麥芽戊糖苷(3.00g，2.84mmol)溶于60ml吡啶中。將乙酸酐(30ml，384mmol)加到該溶液中，并將混合物于室溫攪拌2天使進行反應(yīng)。然后在減壓下濃縮反應(yīng)混合物以除去吡啶、乙酸酐和乙酸。將得到的油狀乙酰衍生物不經(jīng)純化溶于100ml乙酸中，向該溶液中加入25ml水，混合物于30℃攪拌3天。在攪拌下使反應(yīng)混合物慢慢滴入600ml冰一水中，用600ml二氯甲烷提取混合物三次。二氯甲烷層用600ml水洗三次并用無水硫酸鈉干燥。過濾后，減壓濃縮濾液以除去二氯甲烷。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為66∶2.5∶33)洗脫的所需級分進行濃縮，得到2.08g2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.32mmol，兩步的總產(chǎn)率為46.5%)。
熔點(℃)126.0-130.0紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax(CH3CN)〕(nm)＝282(logε＝3.94)。
紅外光譜(cm-1)3480，2970，1752，1588，1530，1486，1432，1372，1350，1236，1030，944，898.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)1.81-2.12(ca.40H，each s)，3.50-4.74(m)，5.05(m)，7.22(1H，d，J＝9.0 Hz)，8.09(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz)，8.22(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔NaCalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝7∶3(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝4.2分鐘。
旋光度〔α〕(C0.25，1，4-二噁烷)+88.0°。
(3)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-4，6-二-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將按實施例1步驟(2)相同方法得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(11.0g，7.00mmol)溶于500ml吡啶中，并將4.9ml甲磺酰氯(63.3mmol)和20.0g分子篩加到該溶液中?；旌衔镉谑覝財嚢?6小時使進行反應(yīng)。接著通過硅藻土床過濾反應(yīng)混合物，并減壓蒸發(fā)除去濾液中所含吡啶。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為100∶1∶200)洗脫的所需級分進行濃縮，得到11.6g2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-4，6-二-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(6.67mmol，產(chǎn)率95.3%)。
熔點(℃)116.0-119.0紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝283(logε＝3.98)，226(sh)，209(logε＝4.23)。
紅外光譜(cm-1)2950，1752，1586，1528，1368，1350，1238，1176，1032，896，826.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)2.00-2.19(ca.40H，each s)，3.08(3H，s)，3.10(3H，s)，3.85-4.85(m)，5.15-5.50(m)，7.29(1H，d，J＝9.2 Hz)，8.16(1H，dd，J＝9.2 Hz，2.7 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝4.0分鐘。
旋光度〔α〕(C0.674，1，4-二噁烷)+85.5°。
元素分析C66H86ClNO46S2
C H N計算值(％) 45.85 5.01 0.81實測值(％) 46.05 5.09 0.78(4)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將實施例1步驟(3)得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-4，6-二-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷(11.6g，6.67mmol)溶于1000ml甲乙酮中，并將30.2g碘化鈉(201mmol)加到該溶液中?；旌衔?5℃攪拌6小時使進行反應(yīng)。接著通過硅藻土床過濾反應(yīng)混合物，并減壓蒸發(fā)除去濾液中的甲乙酮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為100∶1∶200)洗脫的所需級分進行濃縮，得到10.3g2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(5.85mmol，產(chǎn)率87.7%)。
熔點(℃)127.0-129.0紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝283(logε＝3.98)，227(sh)，209(logε＝4.22)。
紅外光譜(cm-1)3550，2960，1750，1586，1528，1486，1430，1372，1350，1234，1180，1040，960，898，828.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)2.00-2.19(ca.40H，each s)，3.06(3H，s)，3.30(1H，dd，J＝11.5 Hz，5.4 Hz)，3.50(1H，dd，J＝11.5 Hz，1.5 Hz)，3.68(1H，ddd，J＝8.8 Hz，5.4 Hz，1.5 Hz)，3.85-4.85(m)，5.15-5.50(m)，7.28(1H，d，J＝9.0Hz)，8.16(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑∶乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝5.6分鐘。
旋光度〔α〕(C0.674，1，4-二噁烷)+80.7°。
元素分析C65H83ClNO43SC H N計算值(％) 44.34 4.75 0.80實測值(％) 44.34 4.82 0.82(5)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-4-O-甲磺酰-α-D-木己-5-烯醇式吡喃糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將實施例1步驟(4)得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2 3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三-〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(2.84g，1.61mmol)溶于170ml吡啶中，并將2.05g氟化銀(16.1mmol)，28.4mg N，N-二甲氨基吡啶(0.232mmol)和5.7g分子篩加到該溶液中?；旌衔镉?5℃攪拌15小時使進行反應(yīng)。接著通過硅藻土床過濾反應(yīng)混合物，并減壓蒸發(fā)除去濾液中的吡啶。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為100∶1∶400)洗脫的所需級分進行濃縮，得到1.89g 2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-4-O-甲磺酰-α-D-木己-5-烯醇式吡喃糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.16mmol，產(chǎn)率72.0%)。
熔點(℃)113.0-115.0紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝283(logε＝3.99)，227(sh)，209(logε＝4.25)。
紅外光譜(cm-1)3490，2970，2110，1748，1586，1532，1488，1434，1372，1350，1236，1182，1030，896.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)1.99-2.18(ca.40H，each s)，3.10(3H，s)，3.80-4.95(m)，5.05-5.50(m)，7.28(1H，d，J＝9.0 Hz)，8.16(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝4.5分鐘。
旋光度〔β〕(C0.504，1，4-二噁烷)+75.3°元素分析C65H82ClNO43SC H N計算值(％) 47.81 5.06 0.86實測值(％) 47.42 5.08 0.86(6)2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷的制備向1.52g實施例1步驟(5)得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-4-O-甲磺酰-α-D-木己-5-烯醇式吡喃糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(0.931mmol)中加入150ml甲醇和193mg無水碳酸鉀(1.40mmol)，并將混合物于25℃攪拌15小時使進行反應(yīng)。接著減壓濃縮反應(yīng)混合物以除去混合物中所含的甲醇。殘余物經(jīng)ODS柱層析純化，并將乙腈-水混合溶液(體積比為25∶75)洗脫的所需級分進行濃縮并凍干，得到746mg2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷(0.715mmol，產(chǎn)率76.8%)。
熔點(℃)175.0-180.0(同時分解)紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝289(logε＝4.01)，228(Sh)，209(logε＝4.43)。
紅外光譜(cm-1)3400，2930，1644，1584，1520，1486，1350，1274，1250，1152，1078，1020，928，890.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.25-3.85(m)，3.29(3H，s)，4.05(1H，br s)，4.30-4.60(m)，4.56(2H，d，J＝2.0 Hz)，5.05(2H，d，J＝3.4 Hz)，5.11(1H，d，J＝3.7 Hz)，5.19(1H，d，J＝2.2 Hz)，5.26(1H，d，J＝7.3 Hz)，5.25-5.65(m)，7.47(1H，d，J＝9.3 Hz)，8.18(1H，dd，J＝9.3 Hz，2.7 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Tosoh Corp.生產(chǎn)，TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑∶乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝5.2分鐘。
旋光度〔α〕(C0.512，H2O)+84.5°。
元素分析C37H54ClNO29SC H N計算值(％) 42.55 5.21 1.34實測值(％) 42.23 5.28 1.40實施例22-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷的制備(1)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-疊氮基-6-脫氧-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將按實施例1步驟(4)相同的操作方法得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-((2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.50g，0.852mmol)溶于130ml DMSO中，并將831mg疊氮化鈉(12.8mmol)加到該溶液中?；旌衔镉?0℃攪拌3小時使進行反應(yīng)。接著，將700ml甲苯加到反應(yīng)混合物中，用3%(重量)NaCl水溶液洗滌混合物三次，每次300ml，然后用無水硫酸鈉干燥甲苯層并通過棉塞過濾，減壓除去濾液中的甲苯。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為100∶1∶400)洗脫的所需級分進行濃縮，得到1.27g 2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-疊氮基-6-脫氧-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(0.758mmol，產(chǎn)率89.0%)。
熔點(℃)115.0-117.0。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax(CH3CN)〕(nm)＝283(logε＝3.97)，227(Sh)，209(logε＝4.22)。
紅外光譜(cm-1)3490，2960，2110，1754，1532，1372，1350，1236，1188，1032，958，898.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)2.00-2.19(ca.40H，each s)，3.04(3H，s)，3.43-3.60(2H，ABlike)，3.85-4.85(m)，5.15-5.50(m)，7.28(1H，d，J＝9.0 Hz)，8.16(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz)，8.30(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝7.8分鐘。
旋光度〔α〕(C0.500，1，4-二噁烷)+92.6°。
元素分析C65H83ClN4O43SC H N計算值(％) 46.59 4.99 3.34實測值(％) 46.43 5.01 3.38(2)2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷的制備除了使用1.22g實施例2步驟(1)中得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-疊氮基-6-脫氧-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(0.728mmol)作為起始原料之外，重復(fù)實施例1步驟(6)中的方法，得到687mg所需產(chǎn)物2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷(0.632mmol，產(chǎn)率86.8%)。
熔點(℃)170.0-172.0(同時分解)。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝289(logε＝3.96)，227(logε＝3.98)209(logε＝4.18)。
紅外光譜(cm-1)3400，2930，2110，1632，1584，1522，1486，1350，1276，1250，1172，1152，1080，1026，958，896.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.20-3.85(m)，3.24(3H，s)，3.85-3.95(1H，ddd like)，4.28(2H，br t，J＝7.2 Hz)，4.40-4.60(m)，5.05(2H，d，J＝3.2 Hz)，5.10(1H，d，J＝5.4Hz)，5.25(1H，d，J＝3.9Hz)，5.27(1H，d，J＝7.3 Hz)，5.30-5.70(m)，7.47(1H，d，J＝9.3 Hz)，8.19(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz)，8.31(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Tosoh Corp.生產(chǎn)，TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝4.6分鐘。
旋光度〔α〕(C0.516，H2O)+86.1°。
元素分析C37H55ClN4O29SC H N計算值(％) 40.87 5.10 5.15實測值(％) 40.62 4.92 5.05實施例32-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷的制備(1)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三-〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將按實施例1步驟(2)相同方法得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(11.6g，7.38mmol)溶于300ml吡啶，并將21.1g(110mmol)甲苯磺酰氯加到該溶液中?；旌衔镉谑覝財嚢?小時使進行反應(yīng)。然后，通過減壓蒸發(fā)除去反應(yīng)混合物中所含的吡啶，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷(體積比為50∶1∶100)洗脫的所需級分進行濃縮，得到6.43g2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(3.72mmol，產(chǎn)率50.5%)。
熔點(℃)109.0-113.5。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax(CH3CN)〕(nm)＝281(logε＝3.95)，272(Sh)。
紅外光譜(cm-1)3490，2970，1752，1586，1528，1486，1430，1372，1350，1240，1178，1034，942.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)1.99-2.17(ca.40H，each s)，2.45(3H，s)，3.50-4.80(m)，5.10-5.50(m)，7.27(1H，d，J＝9.0 Hz)，7.33(2H，d，J＝8.5 Hz)，7.79(2H，d，J＝8.5 Hz)，8.15(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝7∶3(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝8.3分鐘。
旋光度〔α〕(C0.650，1，4-二噁烷)+88.0°。
元素分析C71H88ClNO44SC H N計算值(％) 49.38 5.14 0.81實測值(％) 49.14 5.10 0.79(2)2-氯-4-硝基苯基O-(2，3，4-三-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三-〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備將實施例3步驟(1)得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(4.24g，2.46mmol)溶于20ml吡啶，并將10ml乙酸酐加到該溶液中?；旌衔镉谑覝財嚢?5分小時使進行反應(yīng)。減壓蒸發(fā)除去反應(yīng)混合物中的吡啶。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并將乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為40∶1∶100)洗脫的所需級分進行濃縮，得到2.90g2-氯-4-硝基苯基O-(2，3，4-三-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.64mmol，產(chǎn)率66.6%)。
熔點(℃)116.5-118.0。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax(CH3CN)〕(nm)＝284(logε＝3.97)，226(logε＝4.34)。
紅外光譜(cm-1)3490，2960，1754，1584，1528，1486，1432，1372，1352，1238，1180，1040，994，940，898.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)1.93-2.19(ca.40H，each s)，2.45(3H，s)，3.80-4.80(m)，4.96(1H，t like)，5.10-5.50(m)，7.28(1H，d，J＝9.0 Hz)，7.35(2H，d，J＝8.2 Hz)，7.78(2H，d，J＝8.2 Hz)，8.16(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.4 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.4 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝6.7分鐘。
旋光度〔α〕(C0.692，1，4-二噁烷)+92.6°。
元素分析C73H90ClNO45SC H N計算值(％) 49.56 5.13 0.79實測值(％) 49.43 5.17 0.84(3)2-氯-4-硝基苯基-O-(2，3，4-三-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制備除用實施例3步驟(2)得到的2.00g 2-氯-4-硝基苯基O-(2，3，4-三-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三-〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.13mmol)作為起始原料之外，重復(fù)實施例1步驟(4)的方法，得到1.94g2-氯-4-硝基苯基O-(2，3，4-三-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.13mmol，產(chǎn)率99.9%)。
熔點(℃)127.0-129.0。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax(CH3CN)〕(nm)＝284(logε＝4.10)，227(Sh)，214(logε＝4.25)。
紅外光譜(cm-1)3500，2970，1754，1586，1530，1486，1434，1374，1354，1238，1040，946，900.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)1.99-2.19(ca.40H，each s)，3.13(1H，dd，J＝11.2 Hz，6.2 Hz)，3.28(1H，dd，J＝11.2 Hz，1.5 Hz)，3.68(1H，ddd，J＝8.8 Hz，6.2 Hz，1.5 Hz).3.85-4.85(m)，5.15-5.50(m)，7.28(1H，d，J＝9.2 Hz)，8.16(1H，dd，J＝9.2 Hz，2.8 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.8 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝6.0分鐘。
旋光度〔α〕(C0.634，1，4-二噁烷)+91.0°。
元素分析C66H83ClNO42C H N計算值(％) 45.96 4.85 0.81實測值(％) 45.87 4.84 0.68(4)2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷的制備除使用2.16g實施例3步驟(3)得到的2-氯-4-硝基苯基O-(2，3，4-三-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-三〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-O-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷(1.26mmol)作為起始原料之外，用2.04g按實施例2步驟1相同方法得到的起始原料2-氯-4-硝基苯基十五烷-O-乙酰-65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷(1.20mmol，產(chǎn)率95.2%)重復(fù)實施例1步驟6的方法，得到876mg所需產(chǎn)物2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷(0.868mmol，產(chǎn)率72.3%)。
熔點(℃)130.0-135.5(同時分解)。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝290(logε＝3.98)，227(logε＝3.99)209(logε＝4.20)。
紅外光譜(cm1)3410，2930，2110，1584，1520，1484，1274，1150，1078，1024.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.05-3.90(m)，4.20-4.55(m)，4.74(1H，br d，J＝4.8 Hz)，4.96(1H，br d，J＝5.4 Hz)，5.05(2H，d，J＝3.7 Hz)，5.10(2H，d，J＝3.7 Hz)，5.25(1H，d，J＝7.6 Hz)，5.25-5.60(m)，7.47(1H，d，J＝9.3 Hz)，8.19(1H，dd，J＝9.3 Hz，2.7 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Tosoh Corp.生產(chǎn)，TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝6.7分鐘。
旋光度〔α〕(C0.516，H2O)+92.4°。
元素分析C36H53ClN4O27
C H N計算值(％) 42.84 5.29 5.55實測值(％) 42.88 5.31 5.59實施例44-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D麥芽庚糖苷的制備(1)4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷的制備將15.0g(11.8mmol)市售的4-硝基苯基α-D-麥芽庚糖苷溶于75ml無水DMF中，并將15.0ml(113mmol)四甲氧基甲烷和7.5g Amberlyst(15E)商標(biāo)加到該溶液中?；旌衔镉?5℃攪拌4小時使進行反應(yīng)。接著，使反應(yīng)混合物緩慢滴入冰冷卻下的2.01 100mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中。得到的混合物經(jīng)ODS(十八烷基硅膠)柱層析純化，并濃縮用乙腈-水混合溶液(體積比為35∶65)洗脫的所需級分。除用10.0g得到的油狀4-硝基苯基47，67-二甲氧基亞甲基-α-D-麥芽庚糖苷(7.43mmol，產(chǎn)率63.0%)作為起始原料之外，重復(fù)實施例1步驟(2)的方法，得到6.70g 4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷(3.17mmol，兩步的總產(chǎn)率42.6%)。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝290(logε＝3.98)，227(Sh)，209(logε＝4.27)。
紅外光譜(cm-1)3640，2970，1752，1612，1594，1526，1496，1432，1370，1350，1236，1038，948，898.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)2.00-2.20(Ca.60H，each s)，3.65-4.85(m)，5.15-5.55(m)，7.08(2H，d，J＝9.1 Hz)，8.22(2H，d，J＝9.1 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝7∶3(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝5.3分鐘。
(2)4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲氧基甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷的制備除用實施例4步驟(1)得到的4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-((2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷(6.70g，3.17mmol)作為起始原料之外，重復(fù)實施例3步驟(1)的方法，得到5.57g 4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷(2.46mmol，產(chǎn)率77.6%)。將該甲苯磺酰衍生物溶于40ml乙腈，并將1.93g甲氧基甲基氯(24mmol)和3.10g N，N-二異丙基-N-乙胺(24mmol)加到該溶液中。將混合物在回流下攪拌3小時使進行反應(yīng)，并減壓蒸發(fā)除去溶劑和胺。殘余物溶于500ml甲乙酮中，并將15.1g碘化鈉(100mmol)加到該溶液中，混合物于85℃攪拌6小時使進行反應(yīng)。然后通過硅藻土床過濾反應(yīng)混合物，并減壓蒸發(fā)除去濾液中所含的甲乙酮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，并濃縮用乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液(體積比為100∶1∶100)洗脫的所需級分，得到3.58g4-硝基苯基O-2，3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲氧基甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷(1.58mmol，兩步的總產(chǎn)率64.2%)，為油狀產(chǎn)物。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝290(logε＝3.98)，227(Sh)，209(logε＝4.22)。
紅外光譜(cm-1)3630，2960，1750，1610，1592，1526，1494，1430，1370，1350，1234，1040，960，898.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(CDCl3)2.00-2.19(ca.60H，each s)，3.22(1H，dd，J＝11.0 Hz，6.5 Hz)，3.36(3H，s)，3.46(1H，dd，J＝11.0 Hz，1.5Hz)，3.68(1H，ddd，J＝8.8 Hz，6.5 Hz，1.5 Hz)，3.85-4.85(m)，5.15-5.50(m)，7.08(2H，d，J＝9.0 Hz)，8.22(2H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Nacalai Tesque Inc.生產(chǎn)，COSMOSIL C18柱(4.6mmID×150mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝7∶3(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝10.8分鐘。
元素分析C90H118INO58C H N計算值(％) 47.64 5.24 0.62實測值(％) 47.34 5.42 0.55(3)4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D-麥芽戊糖苷的制備除用3.64g實施例4步驟(2)得到的4-硝基苯基O-(2，3-二-O-乙酰-6-脫氧-6-碘代-4-O-甲氧基甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-五〔O-(2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷(1.58mmol)作為起始原料之外，重復(fù)實施例1步驟(5)和(6)的方法，得到1.15g4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D-麥芽庚糖苷(0.897mmol，兩步的總產(chǎn)率56.8%)。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝289(logε＝4.01)，228(Sh)，209(logε＝4.25)。
紅外光譜(cm-1)3410，2930，1644，1612，1592，1520，1500，1346，1250，1152，1080，1020，934，876.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.15-3.80(m)，3.25(3H，s)，4.25-4.60(m)，4.56(2H，d，J＝2.0 Hz)，4.70-4.90(m)，5.05(2H，d，J＝3.4 Hz)，5.11(1H，d，J＝3.7 Hz)，5.19(3H，d，J＝2.2 Hz)，5.23(1H，d，J＝3.4 Hz)，5.25-5.65(m)，7.23(2H，d，J＝9.2 Hz)，8.23(2H，d，J＝9.2 Hz).
高效液相色譜〔Tosoh Corp.生產(chǎn)，TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝65∶35(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝8.8分鐘。
元素分析C50H77NO37C H N計算值(％) 46.77 6.04 1.09實測值(％) 46.50 6.28 1.01實施例5 測定α-淀粉酶活性(1)(1)制備底物溶液將按實施例1得到的2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲苯磺酰-β-D-麥芽戊糖苷(分子量1044)溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，制成濃度為1.14mM的底物溶液。
(2)制備偶合酶溶液使市售的從酵母得到的α-葡糖苷酶和市售的從杏仁得到的β-葡糖苷酶溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中制成濃度為117單位/ml和13單位/ml的偶合酶溶液。作為市售的α-和β-葡糖苷酶，可使用購自Toyobo有限公司的商品。
(3)制備標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液使市售的人α-淀粉酶(P∶S＝1∶1)溶于純化水中，制成濃度分別為0，148，284，401和525IU/1的標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液。作為市售的人α-淀粉酶，可使用國際試劑公司生產(chǎn)的Calibzyme.AMY。至于α-淀粉酶的活性，在37℃下分解1μmol(市售的)2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽戊糖苷1分鐘的酶量被定義為1國際單位(IU)。
(4)制備樣品溶液當(dāng)用于測定α-淀粉酶活性的樣品為液體時，其本身即可被用作樣品溶液。當(dāng)為固體時，精確稱取500mg樣品并將純化水加到該樣品中，使總體積達5ml制成樣品溶液。若有必要，在使用前通過過濾等操作方法除去樣品溶液中不溶性物質(zhì)。
(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線在攪拌下將1.0ml偶合酶溶液加到250μl標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液中，并于37℃加熱該混合物1分鐘。然后，在攪拌下將2.0ml底物溶液加到混合物中，并于37℃加熱混合物2分鐘，然后在400nm下測定吸光度變化2分鐘。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液的活性與吸光度變化之間的關(guān)系繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用下式表示U＝8.34·△A×103+11.2其中U酶活性(IU/l)，△A每分鐘的吸光度變化。
標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。
(6)測定樣品溶液中α-淀粉酶活性在攪拌下將1.0ml偶合酶加到250μl樣品溶液中，并于37℃加熱混合物1分鐘。在攪拌下將2.0ml底物溶液加到混合物中，并于37℃加熱混合物2分鐘，然后在400nm下測定吸光度變化2分鐘。根據(jù)測定結(jié)果和在步驟(5)中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算可測得樣品溶液中α-淀粉酶的活性。當(dāng)樣品中酶活性超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用范圍(O-525IU/l)時，可在重測之前用純化水將樣品溶液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取?br>
實施例6 測定α-淀粉酶活性(2)(1)制備底物溶液將實施例3中得到的2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷(分子量1009)溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，制成濃度為2.28mM的底物溶液。
(2)制備偶合酶溶液(3)制備標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液(4)制備樣品溶液(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線按照實施例5步驟(2)-(5)相同的方法制備偶合酶溶液，標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液，樣品溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用下式表示U＝8.66·△A×103-6.7標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。
(6)測定樣品溶液中α-淀粉酶活性按照實施例5步驟(6)相同的方法測定樣品溶液中α-淀粉酶的活性。
實施例7用α-淀粉酶對前面提到的63-疊氮基-63-脫氧麥芽三糖苷衍生物和本發(fā)明新化合物65-疊氮基-65-脫氧麥芽戊糖苷衍生物進行水解，比較它們的水解速度。
(1)2-氯-4-硝基苯基63-疊氮基-63-脫氧-β-D-麥芽三糖苷的制備除使用市售的2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽三糖苷(10.0g，15.2mmoles)作為起始原料之外，按照實施例3相同的方法制備2-氯-4-硝基苯基63-疊氮基-63-脫氧-β-D-麥芽三糖苷。所得63-疊氮基-63-脫氧-麥芽三糖苷的產(chǎn)率為1.14g(1.67mmol，八步的總產(chǎn)率11.0%)，該產(chǎn)物具有下列特性熔點(℃)100.5-103.5(同時分解)。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長〔λmax〕(nm)＝290(logε＝3.99)，227(logε＝4.00)209(logε＝4.22)。
紅外光譜(cm-1)3410，2940，2112，1586，1522，1486，1274，1156，1078，1024，924，896.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.05-3.90(m)，4.25-4.55(m)，4.72(1H，br d，J＝5.0 Hz)，4.96(1H，br d，J＝5.5 Hz)，5.08(1H，d，J＝3.1 Hz)，5.11(1H，d，J＝3.8 Hz)，5.26(1H，d，J＝7.6 Hz)，5.25-5.60(m)，7.48(1H，d，J＝9.2 Hz)，8.20(1H，dd，J＝9.2 Hz，2.7 Hz)，8.30(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Tosoh Corp.生產(chǎn)，TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝3.9分鐘。
元素分析C24H33ClN4O17C H N計算值(％) 42.08 4.86 8.18實測值(％) 42.01 4.99 8.29(2)制備底物溶液(a)使實施例3中得到的2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷(在下文中稱為本發(fā)明的底物)溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，制成濃度為3.00mM的底物溶液(a)。
(3)制備底物溶液(b)使步驟(1)中得到的2-氯-4-硝基苯基63-疊氮基-63-脫氧-β-D-麥芽三糖苷(在下文中稱為參照底物)溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，制成濃度為3.00mM的底物溶液(b)。
(4)制備偶合酶溶液按照實施例5步驟(2)相同的方法制備偶合酶溶液。
(5)制備α-淀粉酶溶液使市售的人α-淀粉酶(P∶S＝1∶1)溶于純化水中，按照實施例5步驟(3)相同的方法制成濃度分別為0.250和500IU/l的α-淀粉酶溶液。
(6)α-淀粉酶水解在攪拌下，將1.0ml偶合酶溶液加到250μlα-淀粉酶溶液中，并于37℃加熱混合物1分鐘。在攪拌下，將底物溶液各2.0ml加到混合物中，并于37℃加熱混合物2分鐘，然后在400nm下測定吸光度變化2分鐘。結(jié)果示于表1中。
從表1可知，參照底物幾乎不能被α-淀粉酶水解，而本發(fā)明的底物可令人滿意地被α-淀粉酶水解。
實施例8比較α-淀粉酶對53-烯醇式麥芽三糖苷衍生物和本發(fā)明的55-烯醇式麥芽戊糖苷衍生物進行水解的速度。
(1)2-氯-4-硝基苯基53-烯醇式-43-O-甲苯磺酰-β-D-麥芽三糖苷的制備除使用市售的2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽三糖苷(10.0g，15.2mmol)作為起始原料之外，按照實施例1相同的方法制備麥芽三糖苷衍生物，所得產(chǎn)物的產(chǎn)率為1.23g(1.71mmol，七步的總產(chǎn)率11.3%)，該產(chǎn)物具有下列特性熔點(℃)142.0-145.0(同時分解)。
紫外-可見吸收光譜最大吸收波長(λmax)(nm)＝289(logε＝4.00)，228(sh)，209(logε＝4.44)。
紅外光譜(cm-1)3400，2920，1642，1584，1518，1488，1348，1276，1250，1152，1080，1020，928，892.
核磁共振波譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)3.25-3.85(m)，3.30(3H，s)，4.04(1H，br s)，4.30-4.60(m)，4.58(2H，br d，J＝2.2 Hz)，5.11(1H，d，J＝3.8 Hz)，5.19(1H，d，J＝3.2 Hz)，5.26(1H，d，J＝7.4 Hz)，5.25-5.65(m)，7.47(1H，d，J＝9.0 Hz)，8.18(1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7 Hz).
高效液相色譜〔Tosoh Corp生產(chǎn)，Tsk凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，UV280nm檢測，洗脫劑乙腈/水＝4∶1(V/V)，流速1.0ml/分鐘〕tR＝4.6分鐘。
元素分析C25H34ClNO19SC H N計算值(％) 41.70 4.76 1.95實測值(％) 41.53 4.88 1.90(2)制備底物溶液(a)將實施例1得到的2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲苯磺酰-β-D-麥芽戊糖苷(在下文中稱為本發(fā)明的底物溶于含有40mMNaCl和2mMMgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，使?jié)舛冗_3.00mM。
(3)制備底物溶液(b)
將前面步驟(1)得到的2-氯-4-硝基苯基53-烯醇式-43-O-甲苯磺酰-β-D-麥芽三糖苷(在下文中稱為參照底物)溶于含有40mMNaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，使?jié)舛冗_3.00mM。
(4)制備偶合酶溶液按照實施例5步驟(2)相同的方法制備偶合酶溶液。
(5)制備α-淀粉酶溶液按照實施例7步驟(5)相同的方法制備α-淀粉酶溶液。
(6)α-淀粉酶酶水解按照實施例7步驟(6)相同的方法測定吸光度的變化。結(jié)果示于表2中。
從表2可知，參照底物幾乎不能被α-淀粉酶水解，而本發(fā)明的底物可相當(dāng)順利地被α-淀粉酶水解。
實施例9 偶合酶抗性試驗(1)(1)制備底物溶液(a)將實施例1中得到的2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲苯磺酰-β-D-麥芽戊糖苷(分子量1044;在下文中稱為本發(fā)明的底物)溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中使?jié)舛冗_3.0mM。
(2)制備底物溶液(b)將用常規(guī)方法得到的2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽戊糖苷(分子量984;在下文中稱為參照底物)溶于含有40mMNaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，使?jié)舛冗_3.0mM。
(3)制備偶合酶溶液使市售的得自于酵母的α-葡糖苷酶和市售的得自于杏仁的β-葡糖苷酶溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中制成濃度分別為1053單位/ml和15.5單位/ml的偶合酶溶液。作為市售的α-和β-葡糖苷酶，可使用購自Toyobo有限公司的商品。
(4)偶合酶反應(yīng)于37℃加熱偶合酶溶液5分鐘，然后使它與2.0ml本發(fā)明的底物溶液或參照底物溶液充分混合，并于37℃加熱3分鐘。然后在400nm處測定吸光度的變化5分鐘。
結(jié)果見圖3。在圖3中，符號▽表示底物溶液(a)的測定值在圖中的標(biāo)出點，□表示底物(b)的測定值在圖中的標(biāo)出點。從圖3可知，本發(fā)明的底物不能被偶合酶水解，在測定系統(tǒng)中是穩(wěn)定的。
實施例10 偶合酶抗性試驗(2)除使用實施例3中得到的2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷(分子量1009;在下文中稱為本發(fā)明的底物)作為底物(a)之外，按照實施例9相同的方法進行試驗。結(jié)果見圖4，在圖4中，符號△表示底物溶液(a)的測定值在圖中的標(biāo)出點，□表示底物溶液(b)的測定值在圖中的標(biāo)出點。從圖4可知，本發(fā)明的底物不能被偶合酶水解，在測定系統(tǒng)中是穩(wěn)定的。
實施例11 用于測定的試劑(1)(1)試劑的制備將下列成分溶于純化水中配制成一定的濃度，得制試劑。
成分 濃度2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷 0.70mMα-葡糖苷酶 40單位/mlβ-葡糖苷酶 5.0單位/ml
β-甘油磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0) 20mM牛血清白蛋白 0.05%(2)測定方法當(dāng)待測樣品是液體時，可直接以樣品溶液形式應(yīng)用。當(dāng)樣品是固體時，精確稱取500mg樣品并將純化水加到樣品中，使總體積達5ml制備樣品溶液。將試劑(3.0ml)于37℃預(yù)熱2分鐘，在攪拌下將其加到250μl樣品溶液中，并將混合物于37℃加熱2分鐘，在400nm處測定吸光度的變化2分鐘。根據(jù)測定值和預(yù)先制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算可測定樣品溶液中α-淀粉酶的活性。當(dāng)樣品中的酶活性超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用范圍(0-525IU/l)時，可在重測之前用純化水將樣品溶液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取?br>
實施例12 用于測定的試劑(2)制備試劑和測定方法除了用2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷代替2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷之外，重復(fù)實施例11的方法并且使用濃度為2.00mM。
實驗實施例按照下列方法檢驗實施例中得到的本發(fā)明底物2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麥芽戊糖苷(EMG5CNP)和2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽戊糖苷(ADG5CNP)的Km值，水解速度，水溶性和水解作用的方式。結(jié)果見表3和4。
作為參照底物，可使用市售的2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽戊糖苷(G5CNP)。
(1)Km值(ⅰ)制備底物溶液(a)使底物溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，分別制成0.16，0.32，0.48，0.64，0.80和0.96mM的底物溶液。
(ⅱ)Km值的粗略計算按照與下述測定水解速度相同的方法測定底物的水解速度，并粗略計算Lineweaver-Burk氏倒數(shù)(見“Tanpaku-Kohso no Jikken-hou”，ed Takelchi Horio & Jinpei Yamashita，Nanko-do，1981)得到各底物溶液的Km值。
(ⅲ)制備底物溶液(b)將每種底物溶于含有40mM NaCl和2mMMgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，制成濃度為上述(ⅱ)中粗略計算出的Km值的0.8-1.6倍的三種底物溶液，和濃度為上述(ⅱ)中粗略計算出的Km值的1.6-3.2倍的三種底物溶液。
(ⅳ)測定Km值按照上述(ⅱ)相同的方法計算Km值。
(2)水解速度(ⅰ)制備底物溶液將各底物溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中，使得底物溶液的濃度為Km值的7-9倍。該濃度大約相當(dāng)于下述與α-淀粉酶反應(yīng)中人α-淀粉酶Km值的5倍，因此底物溶液中底物的量足以達到最大水解速度。
(ⅱ)制備偶合酶溶液按照實施例5步驟(2)相同的方法制備偶合酶溶液。
(ⅲ)制備α-淀粉酶溶液按照實施例5步驟(3)相同的方法制備濃度大約為500IU/l的市售人P型和S型α-淀粉酶溶液。
(ⅳ)測定水解速度(α-淀粉酶反應(yīng))將1.0ml偶合酶與250μl(ⅲ)中制得的α-淀粉酶溶液混合。將混合物于37℃加熱1分鐘，并在攪拌下將2.0ml底物溶液加到混合物中。于37℃加熱該混合物2分鐘，然后測定400nm處的吸光度變化2分鐘。
3mMG5CNP(參照底物)水解速度的相對數(shù)值被定義為10，以此表示各底物的水解速度，即每單位時間變化的吸光度。
(3)水溶性向100ml水中加入20g底物，觀察溶解狀態(tài)，(4)作用方式將各底物溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中使底物溶液的濃度為0.5mM。向1.0ml底物溶液中加入100μl在(ⅲ)中制得的用于測定水解速度的α-淀粉酶溶液，充分攪拌之后，使混合物于37℃反應(yīng)20分鐘。通過反應(yīng)混合物的高效液相色譜定量測定水解產(chǎn)物。
注釋Am2兩種人α-淀粉酶(同功酶)P2得自于人胰液的α-淀粉酶S3得自于人唾液的α-淀粉酶從表3和4可知，本發(fā)明的底物基本上在單一的D-葡糖苷鍵處水解，兩種α-淀粉酶的作用方式和水解速度是相同的，并且它們對α-淀粉酶具有高度親和力和良好的水解速度及水溶性，因此它們作為用于測定α-淀粉酶活性的底物是相當(dāng)好的。
權(quán)利要求
1.一種下列通式所示的麥芽低聚糖苷衍生物
其中n代表整數(shù)3-5，R代表芳香發(fā)色團，X代表＞CHCH2N3或＞C=CH2，Y代表氫原子、取代或未取代的烴基，或烷磺?；蚍蓟酋；?br>
2.根據(jù)權(quán)利要求1的麥芽低聚糖苷衍生物，其中芳香發(fā)色團R以下式表示
其中R1-R5，可以相同或不同，可以代表氫原子、鹵原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，或R1和R2或R2和R3可鍵合起來形成一個稠合的芳環(huán)，
其中R6代表氫原子或烷基，
其中R7代表氫原子或鹵原子，
其中R8-R15，可以相同或不同，可以代表氫原子、鹵原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，R8和R9或R10和R11可以鍵合起來形成一個稠合的芳環(huán)，R9和R10和/或R13和R14可分別代表一個共用氧原子，以形成一個稠合的醚環(huán)，Z代表氮原子或N→O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的麥芽戊糖苷衍生物，該衍生物是2-氯-4-硝基苯基65疊氮基-65-脫氧-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲磺酰-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-D-麥芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-D-麥芽戊糖苷，4-硝基苯基67-疊氮基-67-脫氧-D-麥芽庚糖苷，2，4-二氯苯基67-疊氮基-67-脫氧-47-O-甲磺酰-D-麥芽庚糖苷，靛酚基-31-氯苯基65-疊氮基-65-脫氧-45-O-甲基-D-麥芽戊糖苷4-甲基繖形酮基65-疊氮基-65-脫氧-D-麥芽戊糖基，刃天青基56-烯醇式-D-麥芽己糖苷，熒光素基67-疊氮基-67-脫氧-47-O-烯丙基-D-麥芽庚糖苷或靛酚基-31-氯苯基55-烯醇式-45-O-(2-甲氯基)乙氧基-甲基-D-麥芽戊糖苷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的麥芽戊糖苷衍生物，該衍生物是2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-D-麥芽戊糖苷或2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-D-麥芽戊糖苷。
5.一種用于測定α-淀粉酶活性的試劑，該試劑含有根據(jù)權(quán)利要求1的麥芽低聚糖苷衍生物作為有效成分。
6.一種用于測定α-淀粉酶活性的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的麥芽低聚糖苷衍生物的α-異頭物和α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶加到含有α-淀粉酶的樣品中進行酶促反應(yīng)，并定量測定生成的芳香發(fā)色化合物。
7.一種用于測定α-淀粉酶活性的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的麥芽低聚糖苷衍生物的β-異頭物或其α-異頭物和β-異頭物的混合物，α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶和β-葡糖苷酶加到含有α-淀粉酶的樣品中進行酶促反應(yīng)，并定量測定生成的芳香發(fā)色化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種上式所示的麥芽低聚糖苷衍生物，其中n，R，X和Y的定義詳見說明書。一種含有所述的麥芽低聚糖苷衍生物作為有效成分的用于測定α-淀粉酶活性的試劑，和一種用于測定α-淀粉酶活性的方法。
文檔編號C12Q1/40GK1067896SQ9210509
公開日1993年1月13日 申請日期1992年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月26日
發(fā)明者德武昌一, 富倉正, 小谷一夫, 齊藤和典, 戶辺光一朗 申請人:龜甲萬株式會社, 第一化學(xué)藥品株式會社, 盛進制藥株式會社