專利名稱：定量測定人體α－淀粉酶活性的干化學試紙的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于體外臨床診斷試劑技術領域，具體涉及一種適用于測定人體血液、尿液等的α-淀粉酶活性、膽堿酯酶等生化指標的干化學試紙。
背景技術：
急性胰腺炎是臨床上常見的急腹癥之一，多見于青壯年。死亡率達5-10％，誤診率也高達60-90％。當發(fā)生急性胰腺炎時，胰腺中的淀粉酶進入血液當中，引起血液淀粉酶的升高。一般急性胰腺炎發(fā)作后8-12小時，血液中的淀粉酶顯著升高。升高持續(xù)24-72小時。血液淀粉酶達到正常值3倍以上有診斷價值。尿液中的α-淀粉酶升高較遲，在12-24小時后，持續(xù)時間3-5天，達到正常值的2倍以上有診斷意義。盡管測定α-淀粉酶缺乏特異性，但臨床上仍然把測定α-淀粉酶的活性作為診斷急性胰腺炎的重要定性指標而普遍應用。
目前測定α-淀粉酶的方法按試劑類型可以分為液體試劑和干化學試劑兩種方法。干化學試劑主要應用于急診室。同液體試劑相比，干化學試劑具有方便、靈活、污染小、操作方便等特點。
目前，臨床急診生化所使用的干化學產品都為國外公司生產，有三種類型的產品。一種是強生公司為代表的多涂層薄膜干片的干化學技術，利用感光膠片的涂層技術將擴散層、反射層、試劑層等試劑涂在透明的支持層上，從支持層的反面測定光密度的變化。
第二類為日本京都公司的干化學技術，其組成為一塑料支持層，一端為反應區(qū)包括樣品層和試劑層，試劑層為某種織物作為試劑的載體。加樣和測試同在上部進行。
第三類為羅氏公司的干化學產品，U.S Pat.No4,604,264它將試劑涂層在多絲的纖維或織物上，全血通過玻璃纖維橫向過濾后與上試劑層接觸反應，通過上部覆蓋一透明的薄膜測定光密度的變化。U.S Pat 6,036,919發(fā)明了測定全血的干化學試紙，在一透明的支持層上涂上試劑層和反射層，最上部覆蓋一層合成纖維網布作為加樣層。
上述這些產品，有的生產工藝復雜，對材料設備要求高，有的可能產生某些缺陷，如在加樣端容易產生一定的氣泡、過量液體等，加樣和測定在同一側樣品可能造成干擾。而且目前應用的干式生化測定儀為大型設備，將所有的生化項目集中在一臺機器上測定。如強生VITROS系列(VITROS-250，VITROS-950)半自動及全自動干式生化儀及生化試劑；VITROS-250，950在醫(yī)院應用較多。當送檢的樣本數量少時開機不方便。而急診項目如急腹癥需要馬上測定，如果有單獨的小型機和試紙可以滿足急需。這對一些缺乏大型干式生化儀的中小醫(yī)院意義更大。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種可減少測量干擾，使用方便的定量測定人體α-淀粉酶的干化學試紙及定量測定設備。
本發(fā)明提供的定量測定人體α-淀粉酶的干化學試紙，為長條形，一端為手持區(qū)，另一端為測試區(qū)，其結構如圖1、圖2、圖3所示。它由上支持層1、下支持層2、擴散層4、試劑層6組成。其中，上支持層1和下支持層2通過自帶的膠層粘合在一起；在測試區(qū)上支持層1開有加樣孔3，下支持層2的對應位置開有測試孔7；擴散層4和試劑層6迭合，設置于加樣孔3和測試孔7處的上支持層1和下支持層2之間。
上述結構的干化學試紙，主要用于樣品為血清或尿樣的測定。如果是全血樣品，則在上述的擴散層4和試劑層6之間還設置一過濾層5，以便濾去紅細胞。
本發(fā)明中，上支持層和下支持層可采用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纖維等。其中以聚酯材料為最好。單片支持層的厚度為50-300μm。上下兩層規(guī)格相同為40×8mm-120×12mm。上、下支持層上的加樣孔和測試孔可為圓形孔，直徑相同，直徑大小為4-10mm。加樣孔3用于滴加樣品，測試孔7可用于觀察測試區(qū)顏色的變化和測定光密度的變化。
本發(fā)明中，通過加樣孔3可將樣品直接加到擴散層4中。擴散層4的作用是將測試的樣品均一的滲透到下一層中去。適合做擴散層的材料包括各種濾紙、玻璃纖維、無紡布、尼龍膜、合成纖維等。優(yōu)選合成纖維材料。其中最合適的材料為聚酯纖維或尼龍纖維材料。擴散層4做成網布形式，網布的孔徑大小為50-200目，纖維直徑為50-400μm。擴散層的材料一般為親水性質的，這樣有利于樣品的擴散，也可用表面活性劑進行預處理。
本發(fā)明中，過濾層5的作用是過濾紅細胞并避免溶血，其材料可以是各種過濾性的膜、高分子材料等，例如各種玻璃纖維材料和專用濾血膜。優(yōu)選非對稱性合成膜，膜的孔徑為0.15-10μm。
本發(fā)明中，試劑層6稱為反應層。加樣后，樣品中的α-淀粉酶滲透到試劑層發(fā)生反應而逐漸顯色。適合做試劑層的材料有各種濾紙、無紡布、合成膜或纖維織物。膜類以非對稱的膜系列為好。α-淀粉酶分解底物釋放的色原標記物直接滲透到膜的測試孔7一側，在測試孔7一側進行測定。
本發(fā)明中，試劑層6中的試劑包括緩沖體系、底物、輔助酶、激活劑、保護劑、穩(wěn)定劑等。通常，緩沖體系為HEPES緩沖液或磷酸鹽緩沖液，濃度為0.05-1.0M。底物可選用麥芽七糖衍生物，優(yōu)選人工合成的限定性麥芽七糖衍生物，標記有對硝基苯酚(PNP)，非還原端進行了封閉。底物濃度為1-20mM。添加的輔助酶為α-糖苷酶和/或糖化酶，濃度為0.5-10.0萬IU/L。添加的激活劑為氯離子或鈣離子，氯離子的濃度為70-150mM，鈣離子的濃度為1-10mM。酶的穩(wěn)定劑為各種多糖類或雙糖類，如蔗糖、海藻糖等，重量濃度為0.5-2.0％。保護劑為海藻膠，重量濃度為0.5-2.0％。
為定量測定α-淀粉酶的活性，發(fā)明人還研制了反射式分光光度計(另案申請專利)，與本發(fā)明干化學試紙配套使用。用該光度計測定試紙反應后在405nm波長下反射光密度的變化。該儀器可以將反應溫室內的溫度控制在37±0.3℃。計算方法采用速率法，測定在180秒內完成。自動報告和儲存實驗結果，并打印。
本發(fā)明根據淀粉酶作用于底物生成小分子產物對硝基苯酚PNP的特點，采用不對稱的膜作為反應層，在孔徑大的一端加樣，在相反的一面測定，顯色的強度高、均勻度好，減少了加樣端測定產生的氣泡、過量液體、濁度等而造成的干擾，同時制作工藝又比較簡單。試紙單獨配備一臺小型反射式分光光度計，方便測定，適合急診應用。
圖1為本發(fā)明的干化學試紙圖示。
圖2為本發(fā)明的干化學試紙剖面圖示(測血清或血漿)。
圖3為本發(fā)明的干化學試紙剖面圖示(測全血樣本)。
圖4為實施例1的測定結果的回歸直線方程。
圖5為實施例2的測定結果的回歸直線方程。
圖6為實施例6的測定結果的回歸直線方程。
圖中標號1為上支持層，2為下支持層，3為加樣孔，4為擴散層，5為過濾層，6為測試層，7為測試孔。
具體實施例方式
實施例1上、下支持層采用PVC片，用打孔機打出加樣孔3和測試孔7，孔直徑為4mm，孔距為8mm，擴散層4采用尼龍網布，試劑層6采用纖維織物，寬度均為8mm，將擴散層4和試劑層6分別粘貼在兩塊PVC片上，位于加樣孔3和測試孔7的處，然后將兩塊PVC片對合粘貼在一起，加樣孔和測試孔的位置對準。將配制好的試劑(酶反應液)用BIO-DOT噴點儀點樣，每孔6μl。
酶反應液試劑的配方如下HEPES緩沖液 0.5mM麥芽七糖衍生物10mM
α-糖苷酶5000IU/LNaCl 70mMCa2+5mM海藻膠 2％蔗糖 0.5％將噴點后的試紙放入35-45℃干燥箱中，30-35分鐘后取出。用滾刀機將試紙切成8mm寬的紙條，即可用于測定。加樣孔3處于試紙的中間位置，測定的樣品為用人胰淀粉酶配置的標準品。使用反射式分光光度計進行測定，以反應的斜率回歸直線方程，考察線性范圍。
所得直線回歸方程為Y＝89788x-128.16，R2＝0.9913，在79-1250IU/L之間呈線性。如圖4所示。
實施例2上、下支持層采用PET塑料片，用實例1同樣方式打出加樣孔和測試孔，孔直徑為4mm，孔距為8mm，擴散層4采用聚酯網布，試劑層6采用濾紙材料，寬度均為8mm，將它們分別粘貼在兩塊PET片上，然后兩塊PET片對合粘貼在一起，加樣孔和測試孔位置對準。將事先配制好的試劑(酶反應液)用BIO-DOT噴點儀點樣，每孔6μl。
試劑的配方如下磷酸鹽緩沖液 0.2mM麥芽七糖衍生物10mMα-糖苷酶 5000IU/L糖化酶10000IU/LNaCl 150mMCa2+5mM海藻膠0.5％蔗糖 2％
將噴點試劑后的試紙放入40℃真空干燥箱中，20分鐘后取出。用滾刀機將試紙切成8mm寬的紙條即可用于測定。加樣孔位于紙條的中間位置。測定的樣品為用人胰淀粉酶配置的標準品，用稀釋液倍比稀釋。使用反射式分光光度計進行測定。以反應的斜率回歸直線方程。
所得直線回歸方程為y＝96342x+21.7，R2＝0.9959，線性范圍在76-1205IU/L，如圖5所示。
實施例3全血樣品的測定。選擇底板材料及加工規(guī)格同實例1。將試劑層材料和濾血材料玻璃纖維按實例1的規(guī)格和方式粘貼。兩支持層貼好后在玻璃纖維端的加樣孔上方的外側貼擴散層材料尼龍網布。尼龍網的寬度為15mm，兩端寬各3mm用聚乙烯膠布貼于支持層上，使網布中央位于加樣孔正上方。全血樣品在加樣孔網布處加入。試劑的配方及試條的加工同實例1。
取定值的高值(2645IU)臨床全血樣品，用稀釋液倍比稀釋，每次加樣量為12μl，測定反應斜率，計算直線回歸方程。
所得直線回歸方程為Y＝173571X-224.31，R2＝0.9952.在166-2645IU/L范圍內呈線性。如圖6所示。
權利要求
1.一種定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，為長條形，一端為手持區(qū)，另一端為測試區(qū)，其特征在于由上支持層(1)、下支持層(2)、擴散層(4)、過濾層(5)、試劑層(6)組成，其中，上支持層(1)和下支持層(2)通過自帶的膠層粘合在一起；在測試區(qū)上支持層(1)開有加樣孔(3)，下支持層(2)的對應位置開有測試孔(7)；擴散層(4)和試劑層(6)迭合，設置于加樣孔(3)和測試孔(7)處的上支持層(1)和下支持層(2)之間。試劑層(6)中的試劑包括緩沖體系、底物、輔助酶、激活劑、保護劑、穩(wěn)定劑；其中，緩沖體系為HEPES或磷酸鹽緩沖液，濃度為0.05-1.0M；底物為麥芽七糖衍生物，還原端標記有對-硝基苯酚，非還原端進行了封閉，底物濃度為1-20mM；輔助酶為α-糖苷酶和/或糖化酶，濃度為0.5-10.0萬IU/L；激活劑為氯離子或鈣離子，氯離子的濃度為70-150mM，鈣離子的濃度為1-10mM；穩(wěn)定劑為多糖類或雙糖類，重量濃度為0.5-2.0％。保護劑為海藻膠，重量濃度為0.5-2.0％。
2.根據權利要求1所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于所述的擴散層(4)與試劑層(6)之間還設有過濾層(5)。
3.根據權利要求1或2所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于所述的上、下支持層材料為聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯，長條形，厚度為50-300μm，兩支持層規(guī)格相同，長40-120mm，寬8-12mm；所述加樣孔(3)和測試孔(7)為圓孔，直徑相同為4-10mm。
4.根據權利要求1或2所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于擴散層(4)的材料為尼龍膜、無紡布、玻璃纖維、濾紙或合成纖維材料。
5.根據權利要求4所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于所述的擴散層(4)采用合成纖維網布形式，網布的孔徑為50-400μm，纖維直徑為50-400μm。
6.根據權利要求1或2所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于所述的試劑層(6)材料為濾紙、纖維織物、無紡布或非對稱性合成膜。
7.根據權利要求2所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于所述過濾層(5)的材料為玻璃纖維或濾過膜。
8.根據權利要求1或2所述的定量測定人體α-淀粉酶活性的干化學試紙，其特征在于所述的底物采用人工合成的限定性麥芽七糖衍生物。
全文摘要
本發(fā)明屬于體外臨床診斷試劑技術領域，具體為一種定量測定人體α－淀粉酶活性的干化學試紙。試紙由長條形的上下兩支持層及中間各測試層組成，分為手持區(qū)和測試區(qū)。測試區(qū)從上至下依次為擴散層、過濾層、試劑層。擴散層可選用各種合成纖維材料的網格材料，過濾層可選用各種濾血的濾過性材料，試劑層可選用非對稱性的合成膜。上支持層上開一加樣孔，樣品從加樣孔進入擴散層后滲透進過濾層和試劑層，在試劑層發(fā)生化學反應而發(fā)生顏色的改變，通過下支持層的測試孔即可測定反應過程的光密度的變化。該試紙用于定量測定人體樣品中的α－淀粉酶活性，為急性胰腺炎的診斷提供依據。
文檔編號G01N21/78GK101082622SQ20071004346
公開日2007年12月5日 申請日期2007年7月5日 優(yōu)先權日2007年7月5日
發(fā)明者朱世成, 王縵, 田漪 申請人:上海科華生物工程股份有限公司