在原核細胞周質(zhì)中產(chǎn)生多肽的方法
【專利說明】在原核細胞周質(zhì)中產(chǎn)生多肽的方法
[0001] 本文報道了在原核細胞中產(chǎn)生多肽的方法，其中使用存在螯合劑的緩沖系統(tǒng)中的 孵育步驟，在確定PH值和溫度值下，從原核細胞周質(zhì)中回收重組產(chǎn)生的多肽。
【背景技術】
[0002] 具有合適的信號序列時，重組產(chǎn)生的多肽可以被分泌到大腸桿菌細胞的周質(zhì)間 隙中（J〇ly，J.C.和 Laird, M.W·，Periplasm 編著，Ehrmann，M. ,ASM 印制，Washington D. C.，（2007)345-360)。在化學氧化環(huán)境中二硫鍵形成，由此有利于多肽在功能上的正確折 疊。這些多肽從周質(zhì)間隙中的選擇性分離是所希望的，以避免來自大腸桿菌的宿主細胞蛋 白（HCP)的污染。由此，有利于隨后的多肽純化。
[0003] 示例性分離方法是如 Ren, G.等，J. of Bacteriology 189 (2007) 2777-2786 所描 述的滲壓沖擊。使用該方法，溶解于TRIS緩沖液（pH為7. 2)中的EDTA使原核細胞外膜去 穩(wěn)定，這使得蔗糖滲透到周質(zhì)間隙。蔗糖是不能透過內(nèi)膜的。之后通過離心除去TRIS-EDTA 緩沖液中，將細胞迅速重懸于冰冷的蒸餾水中。由此水浸入充滿蔗糖的周質(zhì)間隙，通過周質(zhì) 體積的增加使不穩(wěn)定的外膜崩解。添加氯化鎂重新穩(wěn)定外膜。
[0004] 可以在 Humphreys, D. P. (The Periplasm(編著）Ehrmann，M.，第 361-388 頁，Washington, D.C. :ASM 印制（2007))和 Middelberg，A. P. (Biotechnol. Adv. 13(1995)491-551)中找到其他方法。
[0005] 根據(jù)Joly和LaircK見上文），"當培養(yǎng)體積達到或高于10升時，以小規(guī)模分離周 質(zhì)級分（fraction)的常規(guī)方法（如原生質(zhì)體或滲壓沖擊處理）實際上不能完成"。"從外 部介質(zhì)回收蛋白或在僅破壞外膜和肽聚糖后回收蛋白仍然是尚未在大規(guī)模上付諸實踐的 一個目標"（第354頁）。
[0006] 在W02012/013930中報道了，從表達重組蛋白和二硫化物異構酶DsbC的革蘭氏陰 性細菌宿主細胞的樣品或提取物純化重組蛋白，包括調(diào)節(jié)樣品或提取物的PH值以沉淀和 分離DsbC。在W001/94585中報道了特異于人腫瘤壞死因子（TNF)-a的新型抗體對于治 療TNF-α介導的疾病是有用的，例如，充血性心力衰竭、敗血癥或內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)和 成人呼吸窘迫綜合癥。在美國2005/048056中報道了制備具有重鏈和輕鏈的腫瘤壞死因 子-α抗體，包括發(fā)酵細胞混合物、形成細胞沉淀、并允許沉淀持續(xù)放置一段時間。
[0007] 在WO 2007/106120中報道了調(diào)節(jié)肽分子組織，分布包括向組織施用包含血清白 蛋白結(jié)合肽的綴合物分子。在W001/45746中報道了對免疫球蛋白（Ig)G、IgM和/或人血清 白蛋白具有親和性的肽配體可被綴合，并用于延長活性劑從循環(huán)中清除的半衰期。在美國 2004/001827中報道了調(diào)節(jié)肽分子的組織分布，用于增強治療功效并減少副作用，其包括向 組織施用包含肽的配體結(jié)構域和活性結(jié)構域的綴合物分子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在室溫下使細胞接觸pH值約為8的含有緩沖劑（如 Tris)和螯合劑（如EDTA)的溶液、或孵育細胞與pH值約為8的含有緩沖劑（如Tris)和 螯合劑（如EDTA)的溶液，可以從原核細胞的周質(zhì)中分離重組產(chǎn)生的多肽。該方法能夠在 大規(guī)模生產(chǎn)過程中以高產(chǎn)率和純度分離重組產(chǎn)生的多肽。分離的多肽對下游處理（例如純 化）顯示出良好的可行性。
[0009] 如本文中所報道的一個方面是用于產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括在溶液中孵育 原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的緩沖劑和約0. 5mM 至約9. 5mM的螯合劑，所述溶液的pH值約7至約10。
[0010] 在一個實施方案中，螯合劑選自乙二胺、次氮基三乙酸（NTA)、乙二醇四乙酸 (EGTA)、二亞乙基三胺五乙酸（DTPA)、1，2-雙（鄰-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N'，N'_四乙酸 (BAPTA)、乙二胺-N，Ν' -二琥珀酸（EDDS)、膦酸鹽（如乙二胺四（亞甲基膦酸）EDTMP或二 亞乙基五（亞甲基膦酸）DTPMP)、檸檬酸、卩卜啉類化合物（如血紅素、葉綠素或維生素 Β12)。 在一個實施方案中，螯合劑是乙二胺四乙酸（EDTA)。
[0011] 如本文所報道的一個方面是用于產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括在約25°C在溶液 中孵育（重懸）原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的 Tris-HCl和約2mM至約6mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。
[0012] 如本文所報道的一個方面是用于產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括在約25°C在溶液 中孵育（重懸）原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的 Tris-HCl和約2mM至約4mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。
[0013] 在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約ImM至約6mM。在一個實施方案中，螯合劑 的濃度為約ImM至約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約ImM至約3mM。在一個實 施方案中，螯合劑的濃度為約2mM至約6mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM至 約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為 約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約6mM。
[0014] 在一個實施方案中，EDTA的濃度為約0. 5mM至9. 5mM。在一個實施方案中，EDTA 的濃度為約ImM至約3mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約2mM。在一個實施方案中， EDTA的濃度為約4mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約6mM。
[0015] 在一個實施方案中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約2mM。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約4mM。
[0017] 在一個實施方案中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約6mM。
[0018] 在一個實施方案中，溶液具有約7. 5至約8. 5的pH值。在一個實施例中，本發(fā)明 所報道的方法的特征在于，PH值約為8。
[0019] 在一個實施方案中，孵育時間為約20分鐘至約3. 5小時。在一個實施例中，本發(fā) 明所報道的方法的特征在于，孵育時間是約30分鐘。
[0020] 在一個實施方案中，緩沖劑是與原核細胞外膜相互作用的物質(zhì)。
[0021] 在一個實施方案中，緩沖劑是一價有機胺。在一個實施方案中，緩沖劑是三（羥甲 基）氨基甲烷（Tris)或其鹽。
[0022] 在一個實施方案中，緩沖劑選自磷酸或其鹽、嗎啉或其鹽（MOPS)、3_{[三（羥甲 基）甲基]氨基}丙磺酸（TAPS)、N，N-雙（2-羥乙基）甘氨酸（Bicine)、N-三（羥甲基） 甲基甘氨酸（Tricine)、3-[N-三（羥甲基）甲基氨基]-2-羥基丙磺酸（TAPSO)、4-2_羥乙 基-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)、2-{[三（羥甲基）甲基]氨基}乙磺酸（TES)、組氨酸或其鹽、甘 氨酸或其鹽，或三（羥甲基）氨基甲烷（Tris)或其鹽。在一個實施方案中，鹽是Tris-HCl。
[0023] 在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約IOmM至約95mM。在一個實施方案中， Tris-HCl的濃度為約15mM至約50mM。在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約20mM至 約60mM。在一個實施例中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于！Tris-HCl的濃度為約20mM。 在一個實施方案中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于：Tris-HCl的濃度為約40mM。在一個 實施方案中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于：Tris-HCl的濃度為約60mM。
[0024] 在一個實施方案中，在室溫下進行該方法。在一個實施方案中，在20°C至33°C下 進行如本文所報道的方法。在一個實施方案中，在約25°C下進行如本文所報道的方法。
[0025] 在一個實施方案中，用于產(chǎn)生多肽的方法包括在約25°C在溶液中孵育（重懸）原 核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的Tris-HCl和約2mM 的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。
[0026] 在一個實施例中，本發(fā)明所報道的方法的特征在于，所述原核細胞是革蘭氏陰性 細胞。
[0027] 在一個實施方案中，所述原核細胞是重懸細胞。
[0028] 在一個實施方案中，所述原核細胞選自具有外膜的革蘭氏陰性細菌。在一個 實施方案中，所述原核細胞選自醋桿菌屬（Acetobacter)、擬桿菌屬（Bacteroides)、 疏螺旋體（Borrelia)、Bortadella、伯克霍爾德桿菌屬（Burkholderia)、彎曲桿菌 屬（Campylobacter)、衣原體屬（Chlamydia)、梓檬酸細菌屬（Citrobacter)、腸桿菌 屬（Enterobacter)、埃希氏菌屬（Escherichia)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、幽門螺 桿菌屬（Helicobacter)、嗜血桿菌屬（Hemophilus)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、軍團 菌屬（Legionella)、鉤端螺旋體屬（Leptospiria)、奈瑟氏球菌屬（Neisseria)、硝化 桿菌屬（Nitrobacter)、變形菌屬（Proteus)、假單胞桿菌屬（Pseudomonas)、立克次氏 體屬（Rickettsia)、沙門氏菌屬（Salmonella)、沙雷氏菌屬（Serratia)、志賀氏菌屬 (Shigella)、硫桿菌屬（Thiobacter)、密螺旋體屬（Treponema)、弧菌屬（Vibrio)、黃單胞 菌屬（Xanthomonas)或耶爾森氏菌屬（Yersinia)。在一個實施例中，本發(fā)明所報道的方法 的特征在于，所述原核細胞是大腸桿菌細胞。
[0029] 在一個實施方案中，多肽是非糖基化多肽。
[0030] 在一個實施方案中，多肽是抗體或抗體片段。在一個實施方案中，抗體片段選自 Fv、Fab、Fab'、Fab' _SH、F(ab'）2;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);和由抗體 片段形成的多特異性抗體。
[0031] 在一個實施例中，本發(fā)明所報道的方法中使用的溶液基本上不含肽聚糖水解酶。 在一個實施方案中，肽聚糖水解酶選自溶菌酶（胞壁酸酶）、裂解的轉(zhuǎn)糖基酶、N-乙酰 基-β -D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶或