綿羊肺炎支原體多表位融合抗原MO-meAg5及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種綿羊肺炎支原體多表位融合抗原MO?meAg5及其制備方法和應(yīng)用，通過MO基因組的提取、表達(dá)文庫的構(gòu)建、篩選，MO多表位融合抗原基因的構(gòu)建和在大腸桿菌中的表達(dá)，得到具有良好免疫原性的抗原蛋白，即本發(fā)明的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原MO?meAg5，為進(jìn)一步研制開發(fā)安全、高效的綿羊支原體肺炎多表位蛋白疫苗奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】
綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5及其制備方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5及其制備方法和應(yīng)用， 屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，在我國(guó)新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、青海、陜西、寧夏、遼寧、江蘇、四川、云南等多 個(gè)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的省區(qū)均有綿羊支原體肺炎的發(fā)生和流行的報(bào)道，該病嚴(yán)重影響著養(yǎng)羊業(yè)的 健康發(fā)展，危害日趨加重，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)屬于柔膜體綱，支原體目，支原 體科，支原體屬的一種。
[0004] MO是一種缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器的最小原核細(xì)胞型微生物。MO 基因組比多數(shù)微生物小，為環(huán)狀雙股DNA，大小約為WOOkbX+C含量在25~35%之間。
[0005] 由于其基因組較小，生物合成及代謝能力有限，細(xì)胞需要的很多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要從 外界攝取，因此對(duì)培養(yǎng)基的要求較高。
[0006] 疫苗接種是預(yù)防MO感染的重要手段之一。目前，綿羊肺炎支原體疫苗的研制基礎(chǔ) 還比較薄弱，尚未取得突破。國(guó)內(nèi)雖然有利用MO SC02地方分離株制備滅活疫苗的報(bào)道，但 由于MO存在遺傳多樣性和抗原異質(zhì)性，加上MO菌株培養(yǎng)條件要求高，菌體抗原含量不足，導(dǎo) 致菌體滅活疫苗成本較高，免疫效果不理想。因此，有必要開展綿羊支原體肺炎新型疫苗的 研制，為該病的科學(xué)防治提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0007] 尋找具有良好免疫原性的MO抗原蛋白是研發(fā)MO新型疫苗的關(guān)鍵。由于MO的抗原結(jié) 構(gòu)比較復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外至今尚未篩選和鑒定出具有良好免疫保護(hù)的抗原，嚴(yán)重制約著綿羊支 原體肺炎新型疫苗的研發(fā)。
[0008] 因此，一種為綿羊支原體肺炎多表位蛋白疫苗的研發(fā)奠定良好的前期基礎(chǔ)的綿羊 肺炎支原體多表位融合抗原M0_meAg5及其制備方法和應(yīng)用就應(yīng)運(yùn)而生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5及其制備方 法和應(yīng)用，通過構(gòu)建MO基因組表達(dá)文庫，采用抗MO陽性血清對(duì)構(gòu)建的MO基因組表達(dá)文庫進(jìn) 行篩選，獲得具有免疫原性的抗原基因，然后通過生物信息學(xué)對(duì)篩選出的抗原基因所編碼 氨基酸的優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行分析，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證;通過采用柔性氨基酸對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原表位 進(jìn)行串聯(lián)，構(gòu)建MO多表位融合抗原基因并進(jìn)行原核表達(dá)，將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，進(jìn)一 步分析其免疫原性，為MO多表位蛋白疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
[0010] 本發(fā)明的主要過程如下：
[0011] I .MO基因組的提取。
[0012] 2.MO基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建。
[0013] 3.MO基因組表達(dá)文庫的鑒定。
[0014] 4.MO抗原基因的免疫學(xué)篩選。
[0015] 5.M0抗原蛋白線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的預(yù)測(cè)分析。
[0016] 6. MO線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的鑒定。
[0017] 7 .MO-多表位融合抗原基因的構(gòu)建方法。
[0018] 8. MO多表位融合抗原基因在大腸桿菌中的表達(dá)。
[0019] 9.MO多表位融合抗原的免疫原性分析。
[0020] 其要點(diǎn)在于通過構(gòu)建綿羊肺炎支原體基因組表的文庫，篩選具有免疫原性的抗原 基因，利用生物信息學(xué)手段分析抗原基因編碼蛋白的B細(xì)胞抗原表位，將抗原表位按照一定 順序串聯(lián)，構(gòu)建含有多表位融合抗原基因 M0-meAg5,并在大腸桿菌中表達(dá)，得到具有亞疫苗 研究?jī)r(jià)值的強(qiáng)免疫原性抗原蛋白M0-meAg5,為綿羊肺炎支原體的亞單位疫苗研究奠定基 礎(chǔ)。
[0021 ] 其具體過程如下：
[0022] I .MO基因組的提取
[0023] 將純化后的菌株轉(zhuǎn)接于(30~50ml)培養(yǎng)基中，于36~38°C、濃度為4~6%的⑶2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~9天，當(dāng)生長(zhǎng)滴度達(dá)到IO9CClVml及以上時(shí)，10000~16000r/min離心10~ 20min，收集菌體，棄上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit(BI0MIGA，USA)提取試劑盒 提取得到綿羊肺炎支原體的總DNA。
[0024]所述培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BD，USA)。
[0025]培養(yǎng)基優(yōu)選組成如下：至少含有
[0026] 熱滅活特級(jí)馬血清(Biotopped，China)15~20% (v/v)，
[0027] 酸紅（Sigma，USA)0.004~0.06% (w/v)，
[0028] 氨芐西林(OMEGA，USA) 25 ~30μg/ml。
[0029] 2.MO基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建
[0030] 用Sau3A I酶（TaKaRa，Japan)對(duì)MO總DNA進(jìn)行酶切，使酶切的基因組片段集中于 0 · 5~3kb，然后按照酶切體系：0 · 2~0 · 3ul的Sau3A I酶（0 · 5~1 · 5U/ul)于36~38°C，酶切 0.5~1.5呢基因組0嫩2~2.511進(jìn)行酶切。
[0031] 將酶切的片段通過T4DNA連接酶（Promega，USA)連接于經(jīng)BamH I (TaKaRa，Japan) 酶切并去磷酸化處理的PET28(a/b/c) (Invitrogen，USA)表達(dá)載體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 于DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終 濃度為l〇ug/ml~50ug/ml，以滿足篩選重組質(zhì)粒的需要）的LB平板上，于36~38°C培養(yǎng)12~ 14h。按照分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，同樣涂布于含 有卡那霉素抗性(卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終濃度為l〇ug/ml~50ug/ml)的LB平板上，于 36~38°C培養(yǎng)12~14h。
[0032] 得到含有綿羊肺炎支原體基因片段的大腸桿菌，既綿羊肺炎支原體基因組表達(dá)文 庫。
[0033] 3.MO基因組表達(dá)文庫的鑒定
[0034]從已轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌的平板上隨機(jī)挑選80~120個(gè)菌落，通過pET28 (a/b/c)的 通用引物<210>4(T7)和<210>5(T7ter)對(duì)所構(gòu)建文庫的容量及插入片段的大小進(jìn)行菌液 PCR擴(kuò)增。
[0035] PCR反應(yīng)條件為：93~95°C變性3-5min; 52~56 °C退火40~50s，70~72°C延伸2min ~3min;共30~35個(gè)循環(huán);70~72°C終延伸10~15min，3~5°C時(shí)結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn) 物經(jīng)10~15g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像后對(duì)插入片段的大小及插入片段的成功率進(jìn)行 分析。
[0036] 4.MO抗原基因的免疫學(xué)篩選
[0037]將基因組文庫等份稀釋，涂于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終 濃度為l〇ug/ml~50ug/ml，以防止雜菌的污染）的LB平板上36~38°C培養(yǎng)7~8h。將克隆菌 復(fù)制于硝酸纖維素膜上置于一個(gè)新的含卡那霉素（卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終濃度為 10ug/ml~50ug/ml)LB平板上培養(yǎng)2~3h后，再將此含菌的NC膜置于含有1~1.2mM的IPTG的 LB瓊脂板，36~38°C培養(yǎng)4~6h.然后將有細(xì)菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15~ 25min，于空氣中干燥。將NC膜放入裂解液（IOOmM Tris-HCl PH7.8，150mM MgCl2,1.0~ 2.0%854(111/￥)，0.5~1.5呢/1111胰0嫩酶，30~501^/1111溶菌酶）中于室溫緩慢搖動(dòng)14~1611 ; 然后將NC膜放入TBST緩沖液（40'60mM Tr i s，150mM NaCl，0 · 04 % ~0 · 06 % Tween-20，PH7 · 5 ~7.7)中漂洗3~5次，每次20~30min;將NC膜再放入膜封閉液(TIANGEN)中室溫緩慢晃動(dòng)I ~1.5h.再用TBST緩沖液漂洗2~4次，每次10~20分鐘;再將NC膜放入用封閉緩沖液按1: 2500~1: 3500稀釋被處理過的陽性血清中，室溫孵育1~1.5h，分別用含0.05~0.15 % BSA 的TBST緩沖液、含有0 · 05~0 · 15 %BSA和0 · 05~0 · 15%Tween-20的TBST緩沖液、含0 · 05~ 0.15%BSA的TBST緩沖液各洗滌3~5min。最后將NC膜放入用封閉緩沖液按1:4500~1:5500 稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG溶液中，室溫孵育1~1.5h后，用TBST緩沖液洗滌3~5次，每 次30~40min。用TMB顯色液覆蓋于NC膜上，挑取NC膜上顏色較深的陽性斑點(diǎn)反復(fù)進(jìn)行篩選 驗(yàn)證。
[0038] 挑選出陽性克隆菌在10ug/ml~50ug/ml的卡那霉素的LB液體中培養(yǎng)，當(dāng)其OD600nm 達(dá)到0.6~0.8時(shí)，加入終濃度為1~1.2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在36~38°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)6~ 8h〇
[0039] 得到表達(dá)的綿羊肺炎支原體相關(guān)蛋白。
[0040] 分別用SDS-PAGE和Western blot對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
[0041] 5.MO抗原基因編碼蛋白線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的預(yù)測(cè)分析
[0042]采用Novasygen質(zhì)粒小量提取試劑盒對(duì)篩選出的陽性菌落提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒進(jìn) 行測(cè)序，獲得其序列。
[0043]對(duì)篩選出抗原基因所編碼氨基酸序列的線性優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合三 種不同的預(yù)測(cè)方法尋找出存在共同優(yōu)勢(shì)抗原表位的序列。
[0044] 6.MO線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的鑒定
[0045]取BALB/c小鼠進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。
[0046] 7.MO多表位融合抗原基因的構(gòu)建
[0047]通過編碼柔性氨基酸(GPG)的核苷酸GGCCCGGGC將具有編碼線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的 單個(gè)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)建一個(gè)具有多表位融合抗原基因的串聯(lián)體(命名為M0-meAg5)<jp〈 210>1〇
[0048]對(duì)融合基因中的大腸桿菌稀有密碼子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用編碼相同氨基酸的核苷 酸的大腸桿菌偏愛密碼子替換稀有密碼子，通過基因體外合成的方式合成MO多表位融合基 因。即〈210>2。
[0049] 810多表位融合抗原10-1^485基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0050] 通過常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pMD19-T-M0-meAg5重組質(zhì)粒，采用EcoR I和Xhol I分 別對(duì)pMD19-T-M0-meAg5質(zhì)粒和pET32a( + )質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，采用T4DNA連接酶構(gòu)建一個(gè) pET32a( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp抗性的 固體LB平板上，36~38 °C培養(yǎng)11~14h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽性菌落測(cè)序， 同時(shí)提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，得到pET32a( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒。
[0051 ] 上述含有Amp抗性為Amp在培養(yǎng)基中的工作終濃度為25ug/ml~50ug/ml，可以篩選 出含有Amp抗性的重組菌。
[0052] 將鑒定正確的pET32a( + )-M0-meAg5重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌BL21E.coli 中，36~38°C培養(yǎng)12~14h，挑選菌落并用PCR進(jìn)行篩選，將篩選到的陽性菌轉(zhuǎn)接到含有Amp (氨芐青霉素）抗性(Amp在培養(yǎng)基中的工作終濃度為25ug/ml~50ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基 中，36~38°C培養(yǎng)至OD??(吸光度)為0.6~0.8，加入終濃度為0.5~1.5mmol/L的IPTG進(jìn)行 誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6~IOh后收集菌液，同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照和未加 IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照，然 后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，同時(shí)用抗MO陽性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗羊?yàn)槎惯M(jìn)行 Western blot分析。結(jié)果在IPTG的誘導(dǎo)下，可表達(dá)出33.5kDa的重組蛋白條帶；純化后進(jìn)行 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白M〇-meAg5表現(xiàn)出較強(qiáng)的反應(yīng)原性。按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)說明書進(jìn)行蛋白的純化。將最終純化的蛋白溶液 稀釋為1~1.5mg/ml。
[0053 ]得到本發(fā)明的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M〇-me Ag5。
[0054] 9 .MO多表位融合抗原M0-meAg5的免疫原性分析
[0055] 將小鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組:M0-meAg5重組蛋白溶液+弗氏 完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合。采用皮內(nèi) 多點(diǎn)分部注射方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為4-~60ul。在首次免疫10~20天后，制備MO-meAg5重組蛋白溶液+弗氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗 氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混合。同樣采用皮內(nèi)多點(diǎn)分部注射方式進(jìn)行二次免 疫，免疫劑量為l〇〇ul。在二次免疫6~10天后，采血，離心分離血清，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0056] 將2月齡的羔羊分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組:M0-meAg5重組蛋白溶液+弗氏完全 佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合。采用肌肉注射 方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為400~600ul。在首次免疫10~20天后，制備M0-meAg5重組蛋 白溶液+弗氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏不完全佐劑 按體積比1:0.8~1:1.2混合。同樣采用相同的注射方式進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為400~ 600ul。在二次免疫6~10天后，采血，分離血清，-20°C~_70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0057]參照綿羊支原體肺炎間接血凝診斷試劑盒（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)說 明書，取96孔V型反應(yīng)板，從第1孔開始至第8孔分別滴加 PBS緩沖液20~30uL，吸取被檢血清 20~30uL于第1孔中，充分混勻后再吸取20~30uL加于第2孔，依次做對(duì)倍稀釋至第8孔，每 孔滴加0.5~1.5%抗原致敏紅細(xì)胞20~30uL，放在微量震蕩器上震蕩2min以上，直至診斷 液中的血球分布均勻，從震蕩器上取下反應(yīng)板，蓋上一塊與反應(yīng)板大小相近的玻璃板，置36 ~38°C2~3h，進(jìn)行結(jié)果判定。陽性對(duì)照血清效價(jià)在1:128(第7孔）以上凝集，陰性對(duì)照凝集 效價(jià)小于1:4?？乖瓕?duì)照無自凝現(xiàn)象的前提下，被檢血清效價(jià)1:8以上凝集者判為陽性，效價(jià) 小于1:4者判為陰性。測(cè)定小鼠和羔羊(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)血清樣品的抗體效價(jià)。
[0058]結(jié)果M0-meAg5多表位融合抗原免疫小鼠后血清中MO特異性間接血凝抗體效價(jià)在 ~2〃之間，M0-meAg5多表位融合抗原免疫羔羊后血清中MO特異性間接血凝抗體效價(jià)在2 -5~2- 6之間。
[0059]本發(fā)明通過構(gòu)建綿羊肺炎支原體基因組表達(dá)文庫，并利用抗MO陽性血清對(duì)文庫進(jìn) 行篩選以期獲得具有免疫原性的抗原基因，通過生物學(xué)軟件對(duì)免疫原性基因所編碼氨基酸 的序列進(jìn)行分析，將具有優(yōu)勢(shì)抗原表位的氨基酸序列與柔性氨基酸串聯(lián)，通過生物信息學(xué) 軟件尋找出與其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，在不改變氨基酸序列的前提下將大腸桿菌的稀有密碼 子替換為偏愛密碼子，構(gòu)建一個(gè)多表位融合抗原基因，并采用原核表達(dá)工程菌對(duì)該融合基 因進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)其免疫保護(hù)進(jìn)行驗(yàn)證與分析，以獲得具有良好免疫原性的抗原蛋白， 為進(jìn)一步研制開發(fā)安全、高效的綿羊支原體肺炎多表位蛋白疫苗奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0060] 圖 1 為實(shí)施例1 重組載體pMD19-T-M0-meAg5的PCR鑒定（Fig identification of pMD19-T-M0-meAg5 by PCR)〇
[0061] 圖中：M:DNA Marker(DL2000) I !Negative control，2~7:Amplification of MO-meA5gene〇
[0062 ] 圖2為實(shí)施例1重組表達(dá)載體pET32a( + )-M0ieA5的雙酶切鑒定 (Fig2.Identification of pET32a(+)-M〇-MElplasmid by double enzyme digestion)〇
[0063] 圖中：M:DNA Marker DL_5000;1 ~3:The products from pET32a( + )-M0_meA5
[0064] by double enzyme digestion。
[0065] 圖3表達(dá)M0_meAg5多表位融合抗原蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析 (Fig3.SDS-PAGE and Western blot analysis of expressed recombinant protein M〇-meAg5)〇
[0066] 圖中：M:molecular mass standard ; Lane I: PET32a( + ) ; Lane 2，3，4，5，6 ; pET32a-M〇-meAg5plasmid induced 0，10,8,6,4h by IPTG；Lane 7: The purified recombinant protein；Lane 8:ffestern blot analysis of recombinant protein M〇-meAg5〇
[0067] 圖4為實(shí)施例lM0-meAg5多表位融合抗原免疫羔羊后血清MO特異性抗體水平檢測(cè) (Fig4.The specific antibody level of lamb post vaccination)。
[0068] 圖5為表1 :M0基因組表達(dá)文庫中篩選出的抗原基因編碼氨基酸序列的線性優(yōu)勢(shì)抗 原表位預(yù)測(cè)分析表。
【具體實(shí)施方式】 [0069] 實(shí)施例1:
[0070] I. MO基因組的提取
[0071]將純化后的一株純菌轉(zhuǎn)接于30~50ml含有15~20 %熱滅活特級(jí)馬血清 (Biotopped,China) (v/v)，0 ·004~O ·06%酸紅（Sigma,USA) (w/v)，25~30μg/ml氨節(jié)西林 (OMEGA，USA)的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BD，USA)中，于36~38°C，濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)5~8天，當(dāng)生長(zhǎng)滴度達(dá)到10 9(XU/ml時(shí)，12000r/min離心15min，收集菌體，棄上清，然后采 用Mycoplasma gDNA Mini Kit(BIOMIGA，USA)提取試劑盒提取綿羊肺炎支原體的總DNA。 [0072] 2.MO基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建
[0073] 用Sau3A I酶(TaKaRa，Japan)對(duì)MO總DNA進(jìn)行酶切，通過酶切預(yù)實(shí)驗(yàn)掌握好最佳酶 切用量及酶切時(shí)間，使酶切的基因組片段集中于0.5~3kb，然后按照適當(dāng)?shù)拿盖畜w系： 0.25ul的Sau3A頂每（lU/ul)于37°C，酶切Iug基因組DNA 2~2.5h進(jìn)行酶切。
[0074] 將酶切的片段通過T4DNA連接酶（Promega，USA)連接于經(jīng)BamH I (TaKaRa，Japan) 酶切并去磷酸化處理PET28(a/b/c)(Invitrogen,USA)表達(dá)載體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于 DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，于36~38°C培養(yǎng)12~ 14h。按照分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，同樣涂布于含 有卡那霉素抗性的LB平板上，于36~38°C培養(yǎng)12~14h。
[0075] 3.MO基因組表達(dá)文庫的鑒定
[0076] 從已轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌的平板上隨機(jī)挑選100個(gè)菌落，通過pET28(a/b/c)的通用 引物T7和T7ter對(duì)所構(gòu)建文庫的容量及插入片段的大小進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。
[0077] PCR反應(yīng)條件為：93~95°C變性3-5min; 52~56 °C退火40~50s，70~72°C延伸2min ~3min;共30~35個(gè)循環(huán);70~72°C終延伸10~15min，4°C結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物經(jīng)10 ~15g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像后對(duì)插入片段的大小及插入片段的成功率進(jìn)行分析。 [0078] 4.MO抗原基因的免疫學(xué)篩選
[0079]將基因組文庫等份稀釋，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板上36~38°C培養(yǎng)7~8h。 將克隆菌復(fù)制于硝酸纖維素膜上置于一個(gè)新的含卡那霉素 LB平板上培養(yǎng)2~3h后，再將此 含菌的NC膜置于含有1~1.2mM的IPTG的LB瓊脂板，36~38 °C培養(yǎng)4~6h.然后將有細(xì)菌菌落 的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15~25min，于空氣中干燥。
[0080]將NC膜放入裂解液（IOOmM Tris-HCl PH7.8，150mM MgCl2，1.5%BSA(m/V)，lug/ ml胰DNA酶，40ug/ml溶菌酶）中于室溫緩慢搖動(dòng)14~16h;然后將NC膜放入TBST緩沖液(50mM Tr i s，150mM NaCl，0 · 05 % Tween-20，PH7 · 6)中漂洗3~5次，每次20~30min;將NC膜再放入 膜封閉液(TIANGEN)中室溫緩慢晃動(dòng)1~1.5h.再用TBST緩沖液漂洗2~4次，每次10~20分 鐘;再將NC膜放入用封閉緩沖液按1:3000稀釋被處理過的陽性血清中，室溫孵育1~1.5h， 分別用含〇. I %BSA的TBST緩沖液、含有0.1 %BSA和0.1 %Tween-20的TBST緩沖液、含0.1 % BSA的TBST緩沖液各洗滌3~5min。最后將NC膜放入用封閉緩沖液按1:5000稀釋的HRP標(biāo)記 的兔抗綿羊IgG溶液中，室溫孵育1~1.5h后，用TBST緩沖液洗滌3~5次，每次30~40min。用 TMB顯色液覆蓋于NC膜上，挑取NC膜上顏色較深的陽性斑點(diǎn)反復(fù)進(jìn)行篩選驗(yàn)證。
[0081 ] 挑選出陽性克隆菌在含有卡那霉素的40~50ml LB液體中培養(yǎng)，當(dāng)其OD6QQnm達(dá)到 0.6~0.8時(shí)，加入終濃度為1~1.2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在36~38°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)6~8h。分 別用SDS-PAGE和Western blot對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
[0082] 5.MO抗原基因編碼蛋白線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的預(yù)測(cè)分析
[0083]采用Novasygen質(zhì)粒小量提取試劑盒對(duì)篩選出的陽性菌落提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒進(jìn) 行測(cè)序，獲得其序列。
[0084]利用生物在線軟件ABCPred(http: //www. imtech · res · in/raghava/abcpred/)、 BepiPred I · 0Server(http: //www· cbs · dtu· dk/services/BepiPred/)及DNAStar軟件對(duì)篩 選出抗原基因（表1)所編碼氨基酸序列的線性優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合三種不同 的預(yù)測(cè)方法尋找出存在共同優(yōu)勢(shì)抗原表位的序列。
[0085] 6.MO線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的鑒定
[0086] 取BALB/c小鼠50只，隨機(jī)分為10組，每組5只，9個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組。將合成的9 個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位肽與BSA偶聯(lián)后，與弗氏佐劑按照1:1乳化制成9組疫苗分別皮下注射9個(gè)實(shí) 驗(yàn)組，同時(shí)，使用同等體積的PBS作為對(duì)照。第一次乳化采用弗氏完全佐劑，第二、三次采用 弗氏不完全佐劑。每隔14天免疫一次，每次免疫前都進(jìn)行采血，三免14天后進(jìn)行斷尾采血， 分離血清用ELISA檢測(cè)血清抗體。
[0087] 7 .MO多表位融合抗原基因的構(gòu)建方法
[0088]通過編碼柔性氨基酸(GPG)的核苷酸GGCCCGGGC將具有編碼線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的 單個(gè)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)建一個(gè)具有多表位融合抗原基因的串聯(lián)體(命名為M0-meAg5)。運(yùn) 用稀有密碼子在線軟件(http://nihserver .mbi .ucla. edu/RACC/)對(duì)融合基因中的大腸桿 菌稀有密碼子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用編碼相同氨基酸的核苷酸的大腸桿菌偏愛密碼子替換稀 有密碼子，通過基因體外合成的方式合成MO多表位融合基因。
[0089] 810多表位融合抗原10-1^485基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0090] 通過常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pMD19-T-M0-meAg5重組質(zhì)粒（圖1)，采用EcoR I和 Xhol I分別對(duì)pMD19-T-M0-meAg5質(zhì)粒和pET32a( + )質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，采用T4 DNA連接酶構(gòu) 建一個(gè) pET32a( + )-M0-meAg5 重組質(zhì)粒。
[0091] 將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp抗性的固體LB平板上，36~38°C 培養(yǎng)11~14h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽性菌落測(cè)序，同時(shí)提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn) 行雙酶切驗(yàn)證，得到pET32a( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒(圖2)。
[0092] 將鑒定正確的pET32a( + )-M0-meAg5重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌BL21E.coli 中，36~38°C培養(yǎng)12~14h，挑選菌落并用PCR進(jìn)行篩選，將篩選到的陽性菌轉(zhuǎn)接到含有Amp 抗性的液體LB培養(yǎng)基中，36~38°C培養(yǎng)至0D6QQr?為0.6~0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6~IOh后收集菌液，同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照和未加 IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì) 照，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，同時(shí)用抗MO陽性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗羊?yàn)槎?進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果在IPTG的誘導(dǎo)下，可表達(dá)出33.5kDa的重組蛋白條帶；純化后 進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白M0-meAg5表現(xiàn)出較強(qiáng)的反應(yīng)原性（圖3)。
[0093]按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)說明書進(jìn)行蛋白的純化。 將最終純化的蛋白溶液稀釋為1~1.5mg/ml。
[0094] 9 .MO多表位融合抗原M0-meAg5的免疫原性分析
[0095] 將20只25日齡的昆明（KM)小鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組:M0-meAg5 重組蛋白溶液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏完全佐劑按體積 比1:1混合。采用皮內(nèi)多點(diǎn)分部注射方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為50ul。在首次免疫14天 后，制備M0-meAg5重組蛋白溶液+弗氏不完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗 氏不完全佐劑按體積比1:1混合。同樣采用皮內(nèi)多點(diǎn)分部注射方式進(jìn)行二次免疫，免疫劑量 為100ul。在二次免疫7天后，采血，離心分離血清，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0096] 將10只2月齡的羔羊分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組:M0-meAg5重組蛋白溶 液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合。 采用肌肉注射方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為500ul。在首次免疫14天后，制備M0-meAg5重 組蛋白溶液+弗氏不完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏不完全佐劑按體 積比1:1混合。同樣采用相同的注射方式進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為500ul。在二次免疫7天 后，米血，分尚血清， _20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0097] 參照綿羊支原體肺炎間接血凝診斷試劑盒（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)說 明書，取96孔V型反應(yīng)板，從第1孔開始至第8孔分別滴加 PBS緩沖液25uL，吸取被檢血清25uL 于第1孔中，充分混勻后再吸取25uL加于第2孔，依次做對(duì)倍稀釋至第8孔，每孔滴加1 %抗原 致敏紅細(xì)胞25uL，放在微量震蕩器上震蕩2min，直至診斷液中的血球分布均勻，從震蕩器上 取下反應(yīng)板，蓋上一塊與反應(yīng)板大小相近的玻璃板，置37°C2~3h，進(jìn)行結(jié)果判定。
[0098]陽性對(duì)照血清效價(jià)在1:128(第7孔）以上凝集，陰性對(duì)照凝集效價(jià)小于1:4?？乖瓕?duì) 照無自凝現(xiàn)象的前提下，被檢血清效價(jià)1:8以上凝集者判為陽性，效價(jià)小于1:4者判為陰性。 測(cè)定小鼠和羔羊(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)血清樣品的抗體效價(jià)。結(jié)果M0-meAg5多表位融合抗原免 疫小鼠后血清中MO特異性間接血凝抗體效價(jià)在2- 6~2-7之間，M0-meAg5多表位融合抗原免 疫羔羊后血清中MO特異性間接血凝抗體效價(jià)在爐~2_ 6之間（圖4)。
[0099] 實(shí)施例2:
[0100] I.MO基因組的提取
[0101] 將純化后的菌株轉(zhuǎn)接于30~50ml培養(yǎng)基中，于36~38°C、濃度為4~6%的CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)5~9天，當(dāng)生長(zhǎng)滴度達(dá)到IO9CClVml及以上時(shí)，10000~16000r/min離心10~ 20min，收集菌體，棄上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit(BIOMIGA，USA)提取試劑盒 提取得到綿羊肺炎支原體的總DNA。
[0102]所述培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BD，USA)。
[0103]培養(yǎng)基優(yōu)選組成如下:含有
[0104] 熱滅活特級(jí)馬血清(Biotopped，China)15~20% (v/v)，
[0105] 酸紅（Sigma，USA)0.004~0.06% (w/v)，
[0106] 氨芐西林(〇MEGA，USA)25 ~30μg/ml。
[0107] 2.MO基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建
[0108] 用Sau3A I酶（TaKaRa，Japan)對(duì)MO總DNA進(jìn)行酶切，使酶切的基因組片段集中于 0 · 5~3kb，然后按照酶切體系：0 · 2~0 · 3ul的Sau3A I酶（0 · 5~1 · 5U/ul)于36~38°C，酶切 0.5~1.5呢基因組0嫩2~2.511進(jìn)行酶切。
[0109] 將酶切的片段通過T4DNA連接酶（Promega，USA)連接于經(jīng)BamH I (TaKaRa，Japan) 酶切并去磷酸化處理的PET28(a/b/c) (Invitrogen，USA)表達(dá)載體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 于DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終 濃度為l〇ug/ml~50ug/ml，以滿足篩選重組質(zhì)粒的需要）的LB平板上，于36~38°C培養(yǎng)12~ 14h。按照分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，同樣涂布于含 有卡那霉素抗性(卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終濃度為l〇ug/ml~50ug/ml)的LB平板上，于 36~38°C培養(yǎng)12~14h。
[0110] 得到含有綿羊肺炎支原體基因片段的大腸桿菌，既綿羊肺炎支原體基因組表達(dá)文 庫。
[0111] 3.MO基因組表達(dá)文庫的鑒定
[0112] 從已轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌的平板上隨機(jī)挑選80~120個(gè)菌落，通過pET28(a/b/c)的 通用引物<210>4(T7)和<210>5(T7ter)對(duì)所構(gòu)建文庫的容量及插入片段的大小進(jìn)行菌液 PCR擴(kuò)增。
[0113] PCR反應(yīng)條件為：93~95°C變性3-5min; 52~56 °C退火40~50s，70~72°C延伸2min ~3min;共30~35個(gè)循環(huán);70~72°C終延伸10~15min，3~5°C時(shí)結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn) 物經(jīng)10~15g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像后對(duì)插入片段的大小及插入片段的成功率進(jìn)行 分析。
[0114] 4.MO抗原基因的免疫學(xué)篩選
[0115] 將基因組文庫等份稀釋，涂于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終 濃度為l〇ug/ml~50ug/ml，以防止雜菌的污染）的LB平板上36~38°C培養(yǎng)7~8h。將克隆菌 復(fù)制于硝酸纖維素膜上置于一個(gè)新的含卡那霉素（卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終濃度為 10ug/ml~50ug/ml)LB平板上培養(yǎng)2~3h后，再將此含菌的NC膜置于含有1~1.2mM的IPTG的 LB瓊脂板，36~38°C培養(yǎng)4~6h.然后將有細(xì)菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15~ 25min，于空氣中干燥。
[0116] 將NC膜放入裂解液（IOOmM Tris-HCl PH7.8,150mM MgCl2,1.0~2.0%BSA(m/V)， 0.5~1.5ug/ml胰DNA酶，30~50ug/ml溶菌酶）中于室溫緩慢搖動(dòng)14~16h;然后將NC膜放入 TBST緩沖液（40'60mM Tr i s，150mM NaCl，0 · 04 % ~0 · 06 % Tween-20，PH7 · 5~7 · 7)中漂洗3 ~5次，每次20~30min;將NC膜再放入膜封閉液(TIANGEN)中室溫緩慢晃動(dòng)1~1.5h.再用 TBST緩沖液漂洗2~4次，每次10~20分鐘;再將NC膜放入用封閉緩沖液按1:2500~1:3500 稀釋被處理過的陽性血清中，室溫孵育1~1.5h，分別用含0.05~0.15%BSA的TBST緩沖液、 含有 0 · 05 ~0 · 15%BSA和 0 · 05 ~0 · 15 %Tween-20 的 TBST 緩沖液、含 0 · 05 ~0 · 15 %BSA的 TBST 緩沖液各洗滌3~5min。最后將NC膜放入用封閉緩沖液按1:4500~1:5500稀釋的HRP標(biāo)記的 兔抗綿羊IgG溶液中，室溫孵育1~1.5h后，用TBST緩沖液洗滌3~5次，每次30~40min。用 TMB顯色液覆蓋于NC膜上，挑取NC膜上顏色較深的陽性斑點(diǎn)反復(fù)進(jìn)行篩選驗(yàn)證。
[0117] 挑選出陽性克隆菌在10ug/ml~50ug/ml的卡那霉素的LB液體中培養(yǎng)，當(dāng)其OD600nm 達(dá)到0.6~0.8時(shí)，加入終濃度為1~1.2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在36~38°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)6~ 8h〇
[0118] 得到表達(dá)的綿羊肺炎支原體相關(guān)蛋白。
[0119] 分別用SDS-PAGE和Western blot對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
[0120] 5.MO抗原基因編碼蛋白線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的預(yù)測(cè)分析
[0121 ]采用Novasygen質(zhì)粒小量提取試劑盒對(duì)篩選出的陽性菌落提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒進(jìn) 行測(cè)序，獲得其序列。
[0122] 利用生物在線軟件ABCPred(http: //www. imtech · res · in/raghava/abcpred/)、 BepiPred I · 0Server(http: //www· cbs · dtu· dk/services/BepiPred/)及DNAStar軟件對(duì)篩 選出抗原基因（表1)所編碼氨基酸序列的線性優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合三種不同 的預(yù)測(cè)方法尋找出存在共同優(yōu)勢(shì)抗原表位的序列。
[0123] 6.MO線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的鑒定
[0124] 取BALB/c小鼠40~60只，隨機(jī)分為8~12組，每組4~6只，7~11個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì) 照組。將合成的7~11個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位肽與BSA偶聯(lián)后，與弗氏佐劑按照1:1乳化制成7~11 組疫苗分別皮下注射7~11個(gè)實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)，使用同等體積的PBS作為對(duì)照。第一次乳化采用 弗氏完全佐劑，第二、三次采用弗氏不完全佐劑。每隔10~20天免疫一次，每次免疫前都進(jìn) 行米血，二免10~20天后進(jìn)彳丁斷尾米血，分尚血清用ELI SA檢測(cè)血清抗體。
[0125] 7.MO多表位融合抗原基因的構(gòu)建
[0126] 通過編碼柔性氨基酸(GPG)的核苷酸GGCCCGGGC將具有編碼線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的 單個(gè)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)建一個(gè)具有多表位融合抗原基因的串聯(lián)體(命名為M0-m eAg5)<jp〈 210>1〇
[0127] 用在線軟件(]11^口://11；[11861^61'.1]113；[.11(313.6(111/1^(^/)對(duì)融合基因中的大腸桿菌 稀有密碼子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用編碼相同氨基酸的核苷酸的大腸桿菌偏愛密碼子替換稀有 密碼子，通過基因體外合成的方式合成MO多表位融合基因。即〈210>2。
[0128] 8.10多表位融合抗原10-1^485基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0129] 通過常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pMD19-T-M0-meAg5重組質(zhì)粒（圖1)，采用EcoR I和 Xhol I分別對(duì)pMD19-T-M0-meAg5質(zhì)粒和pET32a( + )質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，采用T4DNA連接酶構(gòu)建 一個(gè)pET32a( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp抗性 的固體LB平板上，36~38 °C培養(yǎng)11~Hh，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽性菌落測(cè) 序，同時(shí)提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，得到pET32a( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒(圖2)。 [0130] 上述含有Amp抗性為Amp在培養(yǎng)基中的工作終濃度為25ug/ml~50ug/ml，可以篩選 出含有Amp抗性的重組菌。
[0131] 將鑒定正確的pET32a( + )-M0-meAg5重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌BL21E.coli 中，36~38°C培養(yǎng)12~14h，挑選菌落并用PCR進(jìn)行篩選，將篩選到的陽性菌轉(zhuǎn)接到含有Amp (氨芐青霉素）抗性(Amp在培養(yǎng)基中的工作終濃度為25ug/ml~50ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基 中，36~38°C培養(yǎng)至OD??(吸光度)為0.6~0.8，加入終濃度為0.5~1.5mmol/L的IPTG進(jìn)行 誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6~IOh后收集菌液，同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照和未加 IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照，然 后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，同時(shí)用抗MO陽性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗羊?yàn)槎惯M(jìn)行 Western blot分析。結(jié)果在IPTG的誘導(dǎo)下，可表達(dá)出33.5kDa的重組蛋白條帶;純化后進(jìn)行 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白M〇-meAg5表現(xiàn)出較強(qiáng)的反應(yīng)原性（圖3)。
[0132] 按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)說明書進(jìn)行蛋白的純化。將 最終純化的蛋白溶液稀釋為1~1.5mg/ml。
[0133]得到本發(fā)明的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5。
[0134] 9 .MO多表位融合抗原M0-meAg5的免疫原性分析
[0135] 將16~24只25日齡的昆明（KM)小鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組:MO-meAg5重組蛋白溶液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏完全佐劑按 體積比1:1混合。采用皮內(nèi)多點(diǎn)分部注射方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為4-~60ul。在首次 免疫10~20天后，制備M0-meAg5重組蛋白溶液+弗氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混 合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混合。同樣采用皮內(nèi)多點(diǎn)分 部注射方式進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為IOOul。在二次免疫6~10天后，采血，離心分離血 清，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0136] 將8~15只2月齡的羔羊分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組:M0-meAg5重組蛋 白溶液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混合;對(duì)照組:PBS緩沖液+弗氏完全佐劑按體積比1:1混 合。采用肌肉注射方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為400~600ul。在首次免疫10~20天后，制 備M0-meAg5重組蛋白溶液+弗氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混合;對(duì)照組:PBS緩沖 液+弗氏不完全佐劑按體積比1:0.8~1:1.2混合。同樣采用相同的注射方式進(jìn)行二次免疫， 免疫劑量為400~600ul。在二次免疫6~10天后，采血，分離血清，-20°C~_70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0137] 參照綿羊支原體肺炎間接血凝診斷試劑盒（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)說 明書，取96孔V型反應(yīng)板，從第1孔開始至第8孔分別滴加 PBS緩沖液20~30uL，吸取被檢血清 20~30uL于第1孔中，充分混勻后再吸取20~30uL加于第2孔，依次做對(duì)倍稀釋至第8孔，每 孔滴加0.5~1.5%抗原致敏紅細(xì)胞20~30uL，放在微量震蕩器上震蕩2min以上，直至診斷 液中的血球分布均勻，從震蕩器上取下反應(yīng)板，蓋上一塊與反應(yīng)板大小相近的玻璃板，置36 ~38°C2~3h，進(jìn)行結(jié)果判定。
[0138] 陽性對(duì)照血清效價(jià)在1:128(第7孔）以上凝集，陰性對(duì)照凝集效價(jià)小于1:4?？乖瓕?duì) 照無自凝現(xiàn)象的前提下，被檢血清效價(jià)1:8以上凝集者判為陽性，效價(jià)小于1:4者判為陰性。 測(cè)定小鼠和羔羊(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)血清樣品的抗體效價(jià)。結(jié)果M0-meAg5多表位融合抗原免 疫小鼠后血清中MO特異性間接血凝抗體效價(jià)在T 6~2〃之間，M0-meAg5多表位融合抗原免 疫羔羊后血清中MO特異性間接血凝抗體效價(jià)在爐~2_6之間（圖4)。
[0139] 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì) 本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視 為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5的制備方法，其特征在于，主要包含 以下過程： M0基因組的提取； M0基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建； M0抗原基因的免疫學(xué)篩選； M0-多表位融合抗原基因的構(gòu)建方法； M0多表位融合抗原基因在大腸桿菌中的表達(dá)； 其具體過程如下： M0基因組的提?。? 將純化后的菌株轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基中，于36~38°C、濃度為4~6%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~9 天，當(dāng)生長(zhǎng)滴度達(dá)到l〇9CQJ/ml及以上時(shí)，10000~16000r/min離心10~20min，收集菌體，棄 上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit提取試劑盒提取得到綿羊肺炎支原體的總DNA; 所述培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(K)，USA); M0基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建： 用Sau3A頂每對(duì)M0總DNA進(jìn)行酶切，使酶切的基因組片段集中于0.5~3kb，然后按照酶 切體系Sau3A頂每于36~38°C，酶切0.5~1.5ug基因組DNA 2~2.5h進(jìn)行酶切。 將酶切的片段通過T4DNA連接酶連接于經(jīng)BamH頂每切并去磷酸化處理的PET28表達(dá)載 體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB 平板上，于36~38°C培養(yǎng)12~14h; 按照分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，同樣涂布于含 有卡那霉素抗性的LB平板上，于36~38°C培養(yǎng)12~14h; 得到含有綿羊肺炎支原體基因片段的大腸桿菌，既綿羊肺炎支原體基因組表達(dá)文庫； M0抗原基因的免疫學(xué)篩選： 將所構(gòu)建的綿羊肺炎支原體基因組表達(dá)文庫等份稀釋，涂于含有卡那霉素抗性的LB平 板上36~38°C培養(yǎng)7~8h; 將克隆菌復(fù)制于硝酸纖維素膜上置于一個(gè)新的含卡那霉素 LB平板上培養(yǎng)2~3h后，再 將此含菌的NC膜置于含有1~1.2mM的IPTG的LB瓊脂板，36~38°C培養(yǎng)4~6h.然后將有細(xì)菌 菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15~25min，于空氣中干燥； 將NC膜放入裂解液中于室溫緩慢搖動(dòng)14~16h;然后將NC膜放入TBST緩沖液中漂洗3~ 5次，每次20~30min; 將NC膜再放入膜封閉液(TIANGEN)中室溫緩慢晃動(dòng)1~1.5h.再用TBST緩沖液漂洗2~4 次，每次10~20分鐘； 再將NC膜放入用封閉緩沖液按1:2500~1:3500稀釋被處理過的陽性血清中，室溫孵育 1~1.5h，分別用含0.05~0.15%BSA的TBST緩沖液、含有0.05~0.15%BSA和0.05~0.15% Tween-20的TBST緩沖液、含0.05~0.15%BSA的TBST緩沖液各洗滌3~5min; 最后將NC膜放入用封閉緩沖液按1:4500~1: 5500稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG溶液 中，室溫孵育1~1.5h后，用TBST緩沖液洗滌3~5次，每次30~40min;用TMB顯色液覆蓋于NC 膜上，挑取NC膜上顏色較深的陽性斑點(diǎn)反復(fù)進(jìn)行篩選驗(yàn)證； 挑選出陽性克隆菌在l〇ug/ml~50ug/ml的卡那霉素的LB液體中培養(yǎng)，當(dāng)其0D6Q()nm達(dá)到 0.6~0.8時(shí)，加入終濃度為1~1.2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在36~38°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)6~8h，得 到表達(dá)的綿羊肺炎支原體相關(guān)蛋白； M0多表位融合抗原基因的構(gòu)建： 通過編碼柔性氨基酸的核苷酸GGCCCGGGC將具有編碼線性優(yōu)勢(shì)抗原表位的單個(gè)基因串 聯(lián)在一起，構(gòu)建一個(gè)具有多表位融合抗原基因的串聯(lián)體，即〈210>1; 對(duì)融合基因中的大腸桿菌稀有密碼子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用編碼相同氨基酸的核苷酸的 大腸桿菌偏愛密碼子替換稀有密碼子，通過基因體外合成的方式合成M0多表位融合基因， 即〈210>2〇 M0多表位融合抗原M0-meAg5基因在大腸桿菌中的表達(dá)： 通過常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pMD19-T-M0-meAg5重組質(zhì)粒，采用EcoR I和Xhol I分別對(duì) pMD19-T-M0-meAg5質(zhì)粒和pET32a( + )質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，采用T4DNA連接酶構(gòu)建一個(gè)pET32a ( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp抗性的固體LB平 板上，36~38 °C培養(yǎng)11~14h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽性菌落測(cè)序，同時(shí)提取 陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，得到pET32a( + )-M0-meAg5重組質(zhì)粒； 將鑒定正確的pET32a( + )-M0-meAg5重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌BL21 E.coli中， 36~38 °C培養(yǎng)12~14h，挑選菌落并用PCR進(jìn)行篩選，將篩選到的陽性菌轉(zhuǎn)接到含有Amp抗性 的液體LB培養(yǎng)基中，36~38°C培養(yǎng)至0D 6QQnm為0.6~0.8，加入終濃度為0.5~1.5mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6~10h后收集菌液； 得到綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5的制備方法，其特 征在于，所述培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯培養(yǎng)基。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5的制備方法，其特 征在于，所述培養(yǎng)基中至少含有下列中的一種： 熱滅活特級(jí)馬血清15~20% (v/v)， 酸紅0 · 004~0 · 06 % (w/v)， 氨節(jié)西林25~30μg/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5的制備方法，其 特征在于： 所述含有卡那霉素抗性的LB平板為:涂布于LB平板上的卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終 濃度為l〇ug/ml~50ug/ml; 所述含有卡那霉素 LB液體為：卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作終濃度為10ug/ml~50ug/ ml ； 所述含有Amp抗性的固體LB平板為:Amp在培養(yǎng)基中的工作終濃度為25ug/ml~50ug/ ml 〇5. -種綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5,其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1至4任 一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法制備。6. -種權(quán)利要求5所述的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5的用途，其特征在 于，將所述的綿羊肺炎支原體多表位融合抗原M0-meAg5用于制備綿羊支原體肺炎多表位蛋 白疫苗。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK105859845SQ201610237704
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】喬軍, 陳誠(chéng), 孟慶玲, 胡政香, 馬玉, 田路路, 盧海亭, 曹旭東, 陳創(chuàng)夫
【申請(qǐng)人】石河子大學(xué)