專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體及衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因輸運(yùn)領(lǐng)域。它是一種可以將外源DNA輸運(yùn)到真核細(xì)胞中的多肽類(lèi)載體。真核細(xì)胞包括細(xì)胞系和原代培養(yǎng)的細(xì)胞。基因輸運(yùn)包括將DNA，SiRNA和ODN輸運(yùn)到真核細(xì)胞中。
背景技術(shù)：
：基因輸運(yùn)作為基因治療的基本技術(shù)之一，其高效的運(yùn)輸能力和低的生物毒性對(duì)基因治療的成功起了關(guān)鍵的作用。目前，基因輸運(yùn)的載體主要包括兩類(lèi)，即病毒類(lèi)載體和非病毒類(lèi)載體。病毒類(lèi)載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒類(lèi)載體(CN1871356，CN1159210,CN1302334)，慢病毒類(lèi)載體(CN1688323，CN1487841，CN1668751,CN1633495,CN101186915),腺病毒類(lèi)載體(CN1857738，C畫(huà)50021，CN1570122,CN101072879,CN1147837,CN1113390,CN1218512,CN1314948)等，盡管病毒類(lèi)載體具有很高的基因輸運(yùn)的效率，但是生物兼容性和潛在生物毒性極大程度的制約了其在臨床治療中的應(yīng)用。非病毒類(lèi)載體主要包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體核心的載體(如Lipofectamine2000),脂質(zhì)體核心的載體(FuGene6)，陽(yáng)離子聚合物核心的載體(CN101016550)，多胺類(lèi)載體，肽類(lèi)載體(CN1821399)，復(fù)合類(lèi)載體(CN101016549)及其他生物材料類(lèi)載體(CN1786163，CN1375334)等，雖然該類(lèi)載體的運(yùn)輸能力相對(duì)病毒類(lèi)載體低，但良好的生物兼容性和較高的安全性為其在研究和臨床中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，其中尤其以多肽類(lèi)載體的安全性更高，所以多肽類(lèi)載體是目前基因輸運(yùn)載體研究中的一大熱點(diǎn)。多肽類(lèi)藥物和藥物載體的研究是很廣泛的，包括靶向多肽藥物的研究(CN101143895，CN101130063，CN101130062,CN101130061，CN101224306)，多肽類(lèi)藥物研究(CN101121018，C畫(huà)1134780，CN101214369，CN1488641)，多肽類(lèi)藥物載體的研究(CN101053660，CN101024087，CN101113457，CN101262890，CN1800403)等。針對(duì)不同的生物用途，功能性多肽序列的研究也引起了大家的廣泛關(guān)注。早在1965年我國(guó)科學(xué)家就完成了牛結(jié)晶胰島素的合成，這是世界上第一次人工合成多肽類(lèi)生物活性物質(zhì)。近年來(lái)譬如MaeshimaY等人發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制功能的活性肽段(MaeshimaY;ColoradoPC;TorreA，e/aJ.DistinctantitumorpropertiesofatypeIVcollagendomainderivedfrombasementmembrane[J].J5/o/C/zew,2000.275(28):21340-8.);KobayashiN.等人發(fā)現(xiàn)了一段具有細(xì)胞核定位功能的肽段(KobayashiN.;YamadaY.;YoshidaT.爿w"w/cro6爿gew"Cte附W/^，2006，50，1118-9.);HoffinanJ.A.等人研究出具有腫瘤耙向功能的肽段(HoffmanJ.A.;GiraudoE.;SinghM.;ZhangL.;InoueM.;PorkkaK.;HanahanD.;RuoslahtiE.CawcerCe〃，2003，4，383-91.)EnbackJ.等人篩選出具有腫瘤導(dǎo)向功能的肽段(EnbackJ.;LaakkonenP.所oc/zewSocrrara，2007，35，780-3.)等。本發(fā)明首次將若干不同功能的多肽結(jié)構(gòu)域通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟB接起來(lái)，設(shè)計(jì)出一種新型多肽，不僅可以作為真核細(xì)胞基因輸運(yùn)的載體，而且具有高度的生物安全性，尤其對(duì)于原代真核細(xì)胞具有較高的基因輸運(yùn)能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是合理的利用核定位序列和腫瘤識(shí)別序列，并采用了適當(dāng)?shù)逆溄有蛄校O(shè)計(jì)了一類(lèi)多肽類(lèi)載體；本發(fā)明涉及的多肽類(lèi)載體可以通過(guò)分子間相互作用結(jié)合DNA，并將外源DNA帶入真核細(xì)胞中表達(dá)，尤其對(duì)于原代細(xì)胞具有較好的作用，同時(shí)該類(lèi)載體具有較低的毒性，為基因輸運(yùn)的研究和基因治療提供了新的思路。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了該多肽載體及衍生物的應(yīng)用。技術(shù)方案，本發(fā)明提供了用于真核細(xì)胞基因運(yùn)輸?shù)亩嚯妮d體，是一段氨基酸組成的雙功能多肽及其衍生物，命名為RPC，RPC的序列為SEQIDNO.l。該多肽是由一段位于碳端的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域、一段位于氮端的腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域和一段位于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的接頭所組成。其中，核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域采用的是SV40大T抗原蛋白分子的核定位信號(hào)肽(nuclearlocationsignal,NLS)，它是一段由7個(gè)氨基酸組成的肽段，序列為PKKKRKV。因?yàn)槠鋷в姓姾?，而DNA帶有負(fù)電荷，所以它可以引導(dǎo)蛋白或多肽從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，并通過(guò)電荷相互作用力和DNA結(jié)合。腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域是Hoffman等人發(fā)現(xiàn)的一段由5個(gè)氨基酸組成的肽段，序列為CGKRK，它可以被多種靶細(xì)胞特異性識(shí)別并進(jìn)入靶細(xì)胞的核內(nèi)。接頭肽段是根據(jù)Deshayes等人的研究成果設(shè)計(jì)出的一段由3個(gè)氨基酸組成的肽段，序列為WSQ，我們將它作為一段連接結(jié)構(gòu)域，將核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域和腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)。同時(shí)我們通過(guò)對(duì)該雙功能肽段的碳末端和氮末端分別進(jìn)行了化學(xué)修飾、替換或增加RPC序列中的部分氨基酸，設(shè)計(jì)出了RPC的一系列衍生物，并驗(yàn)證了RPC及衍生物的序列特異性。所述的衍生物RPC1為將RPC碳末端用巰基乙胺修飾，在其氮末端連接上乙?；瑤€基乙胺具有保持多肽穩(wěn)定性的功能，而乙?；亲畛Ｓ玫囊环N小分子化學(xué)修飾基團(tuán)。所述的衍生物RPC2為將RPC1碳末端修飾的巰基乙胺替換成氨基，巰基乙胺具有保持多肽穩(wěn)定性的功能，用氨基替換可以減弱這種功能，說(shuō)明巰基乙胺作為碳末端修飾的重要性。所述的衍生物RPC3為將RPC1氮末端的乙酰基替換成9-荷甲氧羰基,9-苑甲氧羰基是一種高分子量的修飾基團(tuán)，具有較大的空間結(jié)構(gòu)，它可以增加多肽的空間位阻效應(yīng)，影響多肽的折疊，說(shuō)明乙?；鳛榈┒诵揎椀闹匾?。所述的衍生物RPC4為將RPC1碳端的纈氨酸替換成賴(lài)氨酸;纈氨酸是一種中性氨基酸，側(cè)鏈不帶電荷，賴(lài)氨酸屬于堿性氨基酸，側(cè)鏈存在氨基帶正電荷。用賴(lài)氨酸取代纈氨酸可以改變多肽的電荷比例，增加其正電荷的數(shù)量，提高多肽和DNA結(jié)合的能力，從而多肽能夠攜帶更多的DNA進(jìn)入細(xì)胞，提高輸運(yùn)的能力。所述的衍生物RPC5為在RPC1序列中間插入一個(gè)賴(lài)氨酸；多肽的核定位結(jié)構(gòu)域中富含賴(lài)氨酸和精氨酸，它們都屬于堿性氨基酸，側(cè)鏈帶正電荷，可以和帶負(fù)電的DNA相互結(jié)合。在該結(jié)構(gòu)域中再插入一個(gè)賴(lài)氨酸，可以增加多肽正電荷的數(shù)量，提高其與DNA結(jié)合的能力。以上幾種類(lèi)似物的基因輸運(yùn)效果說(shuō)明，通過(guò)合理的修飾可以進(jìn)一步提高該類(lèi)多肽類(lèi)載體基因輸運(yùn)的能力。所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體及衍生物在運(yùn)輸外源DNA到真核細(xì)胞中的應(yīng)用。RPC肽段及其衍生物是由GelBiochem公司(上海)合成。RPC及其衍生物的序列為SEQIDNO.1RPC:CGKRKWSQPKKKRKVRPC1:Ac-CGKRKWSQPKKKRKV-CysteamideRPC2:Ac-CGKRKWSQPKKKRKV-NH2RPC3:Fmoc-CGKRKWSQPKKKRKV陽(yáng)CysteamideRPC4:Ac-CGKRKWSQPKKKRKK-CysteamideRPC5:Ac-CGKRKWSQPKKKKRKV-Cysteamide。肽段的碳末端和氮末端的修飾基團(tuán)優(yōu)選為巰基乙胺(Cysteamide)和乙?；?Ac)時(shí)，基因輸運(yùn)能力最高。此外，本發(fā)明在RPC1序列的基礎(chǔ)上，將RPC1碳末端的纈氨酸(V)替換成賴(lài)氨酸(K)構(gòu)建的RPC4，進(jìn)一步提高了基因輸運(yùn)的能力。有益效果本發(fā)明作為多肽類(lèi)的基因輸運(yùn)載體，具有很好的結(jié)合外源DNA并將其輸運(yùn)到真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的能力，尤其針對(duì)于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞，該發(fā)明具有良好的轉(zhuǎn)染效果，同時(shí)展示出了高度的生物安全性。圖hRPC1和DNA復(fù)合物的形成(第2-5道是DNA和不同濃度的RPCl孵育)；圖2:RPC1和RPC1-DNA復(fù)合物對(duì)原代成骨細(xì)胞活力的影響(通過(guò)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的活力，t表示p值小于0.05);圖3:RPC1對(duì)原代成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(以GFP作為報(bào)告基因)；其中A是單獨(dú)DNA轉(zhuǎn)染原代成骨細(xì)胞24小時(shí)后的熒光圖片；C是RPC1-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染原代成骨細(xì)胞24小時(shí)后的熒光圖片；B、D分別是A、C圖的顯微鏡明場(chǎng)圖片；圖4:RPC1對(duì)原代成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(以iem7/aluciferase作為報(bào)告基因)；圖5:RPC1轉(zhuǎn)染原代成骨細(xì)胞的時(shí)間效應(yīng)(以ie"/〃flluciferase作為報(bào)告基因)；圖6:Lipofectamine2000對(duì)RPC1轉(zhuǎn)染的影響(以iem7/aluciferase作為報(bào)告基因，***表示p值小于0.001)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一RPC的序列結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)本發(fā)明提供的用于真核細(xì)胞基因運(yùn)輸?shù)亩嚯妮d體，是一段由15個(gè)氨基酸組成的雙功能多肽，命名為RPC，其序列為CGKRKWSQPKKKRKV。該多肽是由一段位于碳端的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域、一段位于氮端的腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域和一段位于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的接頭所組成。其中，核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域采用的是SV40大T抗原蛋白分子的核定位信號(hào)肽(nuclearlocationsignal,NLS)，它是一段由7個(gè)氨基酸組成的肽段，序列為PKKKRKV。因?yàn)槠鋷в姓姾?，DNA帶有負(fù)電荷，所以它可以引導(dǎo)蛋白或多肽從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，并通過(guò)電荷間相互作用力和DNA結(jié)合。腫瘤耙向結(jié)構(gòu)域是Hoffman等人發(fā)現(xiàn)的一段由5個(gè)氨基酸組成的肽段，序列為CGKRK，它可以被多種靶細(xì)胞特異性識(shí)別并進(jìn)入靶細(xì)胞的核內(nèi)。接頭肽段是根據(jù)Deshayes等人的研究成果設(shè)計(jì)出的一段由3個(gè)氨基酸組成的肽段，序列為WSQ，我們將它作為一段連接結(jié)構(gòu)域，將核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域和腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)。同時(shí)我們還對(duì)該雙功能肽段的碳末端和氮末端分別進(jìn)行了化學(xué)修飾，在碳末端連接上巰基乙胺以提高多肽的穩(wěn)定性，在氮末端連接上乙?；O(shè)計(jì)出RPC1序列。RPC系列肽段是由GelBiochem公司(上海)合成。實(shí)施例二RPC1與DNA的結(jié)合能力RPC1和DNA復(fù)合物的形成將不同濃度的PRC1肽段溶液和恒定濃度的質(zhì)粒DNA溶液混合，在漩渦振蕩儀上振蕩1分鐘，置于室溫下孵育30分鐘。將不同濃度比的RPC1和DNA復(fù)合物進(jìn)行1%的瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像儀(Tanonl600)成像。結(jié)果顯示，隨著RPC1濃度的提高，與之結(jié)合的DNA含量也不斷增加。RPC1/DNA的最佳結(jié)合比率是10:1(w/w)(見(jiàn)圖l)。實(shí)施例三RPC1對(duì)原代成骨細(xì)胞的毒性作用原代成骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法分離出新生Wistar大鼠的顱骨，將顱骨上附著的軟組織剝離干凈。將顱骨剪碎后用無(wú)菌的PBS清洗2遍，再置于DMEM(含lmg/mL的II型膠原蛋白酶)培養(yǎng)基中，于37。C下孵育100分鐘。孵育結(jié)束后在250g轉(zhuǎn)速下離心3分鐘，再將細(xì)胞用DMEM(含10%小牛血清，50lig/mL青霉素和50ug/mL鏈霉素)培養(yǎng)基重懸，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37°C，5%C02)中培養(yǎng)。一周后收獲細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將原代成骨細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約5-6X10"L，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將RPC1和RPC1-DNA復(fù)合物分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37'C下培養(yǎng)48-72小時(shí)。然后向每孔中加入的MTT(噻唑藍(lán))溶液使終濃度為5yg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，再向每孔中加入150iiLDMSO(二甲基亞砜)，用酶標(biāo)儀(ELX800)在570nm處測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，RPC1以及RPC1-DNA復(fù)合物在工作濃度上對(duì)細(xì)胞的活力基本上無(wú)影響，說(shuō)明RPC1以及RPC1-DNA復(fù)合物基本上沒(méi)有細(xì)胞毒性。只是RPC1-DNA復(fù)合物在處理細(xì)胞72小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞活力有輕微的減少(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例四RPC1對(duì)原代成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(以GFP作為報(bào)告基因)細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X10"孔，過(guò)夜培養(yǎng)，待用。配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物方法如下將最佳結(jié)合比率的RPC1和DNA溶解在DMEM(含血清無(wú)抗生素)培養(yǎng)基中，每孔200uL體積，充分振蕩混合，在室溫下孵育30分鐘。轉(zhuǎn)染過(guò)程方法如下過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM(含血清無(wú)抗生素)培養(yǎng)基洗滌2次后加入孵育過(guò)的混合物，在37'C，5%(:02培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30分鐘，補(bǔ)充DMEM完全培養(yǎng)基300"。檢測(cè)方法如下細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后用PBS清洗3遍，在熒光顯微鏡(OlympusIX-70)下觀察。結(jié)果顯示，在RPC1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的原代成骨細(xì)胞中，可以看見(jiàn)明亮的綠色熒光，而未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則看不見(jiàn)熒光。說(shuō)明RPC1可以介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)入原代成骨細(xì)胞中，并保證外源基因得到有效表達(dá)(見(jiàn)圖3)。實(shí)施例五RPC1對(duì)原代成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(以Renillaluciferase作為報(bào)告基因)細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X10"孔，過(guò)夜培養(yǎng)，待用(同實(shí)施例四)。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制，轉(zhuǎn)染過(guò)程同實(shí)施例四。檢測(cè)方法如下培養(yǎng)48小時(shí)候后收集細(xì)胞，用Luciferase檢測(cè)試劑盒(Promega公司)中細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用Luciferase檢測(cè)試劑盒(Promega公司)進(jìn)行細(xì)胞裂解液中Luciferase活力檢測(cè)，同時(shí)用蛋白濃度試劑盒(碧云天生物公司)測(cè)定細(xì)胞裂解液的蛋白濃度。用蛋白濃度將Luciferase酶活進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)分析方法如下studentVTtest進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并用Origin做圖。結(jié)果顯示，經(jīng)RPC1轉(zhuǎn)染的原代成骨細(xì)胞，Luciferase的活性達(dá)到14.71RLU/嗎protein,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對(duì)照)基本檢測(cè)不到Luciferase的活性(見(jiàn)圖4)。實(shí)施例六RPCl轉(zhuǎn)染原代成骨細(xì)胞的時(shí)間效應(yīng)(以Renillaluciferase作為報(bào)告基因)細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X10"孔，過(guò)夜培養(yǎng)，待用(同實(shí)施例四)。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制，轉(zhuǎn)染過(guò)程同實(shí)施例四。轉(zhuǎn)染后7天內(nèi)，每天檢測(cè)一次Luciferase的活性，檢測(cè)方法同實(shí)施例五。數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例五。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的前兩天內(nèi)，Luciferase的活性呈上升趨勢(shì)，并在第48小時(shí)達(dá)到峰值(14.7lRLU/ngprotein),此后呈下降趨勢(shì)，在第7天后下降到0.02RLU/pgprotein(見(jiàn)圖5)。實(shí)施例七Lipofectamine2000對(duì)RPCl轉(zhuǎn)染的影響(以iem'〃aluciferase作為報(bào)告基因)細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X10"孔，過(guò)夜培養(yǎng)，待用(同實(shí)施例四)。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制同實(shí)施例四，再在RPC1-DNA復(fù)合物中加入合適體積的Lipofectamine2000。轉(zhuǎn)染過(guò)程，數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例四。結(jié)果顯示，RPCl/Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)的原代成骨細(xì)胞與RPCl單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，前者的Luciferase活性明顯高于后者(p<0.001)，說(shuō)明Lipofectamine2000可以促進(jìn)RPCl的基因輸運(yùn)(見(jiàn)圖6)。實(shí)施例八RPCl的序列特異性我們?cè)赗PCl序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了4種RPCl的類(lèi)似物，由GelBiochem公司(上海)合成，它們分別是RPC2(Ac-CGKRKWSQPKKKRKV-NH2)，將RPCl碳末端的巰基乙胺(Cysteamide)替換成氨基(NH2)。巰基乙胺具有保持多肽穩(wěn)定性的功能，用氨基替換可以減弱這種功能。RPC3(Fmoc-CGKRKWSQPKKKRKV-Cysteamide)，將RPCl氮末端的乙?；?Ac)替換成9-芴甲氧羰基'(Fmoc)。9-芴甲氧羰基是一種高分子量的修飾基團(tuán)，具有較大的空間結(jié)構(gòu)，它可以增加多肽的空間位阻效應(yīng)，影響多肽的折疊。RPC4(Ac-CGKRKWSQPKKKRKK-Cysteamide)，將RPC1碳末端的纈氨酸(V)替換成賴(lài)氨酸(K)。纈氨酸是一種中性氨基酸，側(cè)鏈不帶電荷，賴(lài)氨酸屬于堿性氨基酸，側(cè)鏈存在氨基帶正電荷。用賴(lài)氨酸取代纈氨酸可以改變多肽的電荷比例，增加其正電荷的數(shù)量，提高多肽和DNA結(jié)合的能力。RPC5(Ac-CGKRKWSQPKKKKRKV-Cysteamide)，在RPC1序列中間插入一個(gè)賴(lài)氨酸(K)。多肽的核定位結(jié)構(gòu)域中富含賴(lài)氨酸和精氨酸，它們都屬于堿性氨基酸，側(cè)鏈帶正電荷，可以和帶負(fù)電的DNA相互結(jié)合。在該結(jié)構(gòu)域中再插入一個(gè)賴(lài)氨酸，可以增加多肽正電荷的數(shù)量，提高其與DNA結(jié)合的能力。分別檢測(cè)它們對(duì)原代成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(以iem7/aluciferase作為報(bào)告基因)。細(xì)胞的準(zhǔn)備，轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制，轉(zhuǎn)染過(guò)程，數(shù)據(jù)分析方法同實(shí)施例四。結(jié)果顯示，與RPC1相比，RPC2禾卩RPC3的轉(zhuǎn)染效率大大降低了，分別為(11.12±0.96%)和(15.54±1.18%)，說(shuō)明RPC1的末端修飾是具有特異性的。而RPC4和RPC5的轉(zhuǎn)染效率分別為(130.33±3.94%)和(83.58±2.21°/。)，則與RPC1相當(dāng)，甚至其中RPC4的轉(zhuǎn)染效率比RPC1高(見(jiàn)表1)，說(shuō)明可以通過(guò)對(duì)RPC1序列的合理修飾進(jìn)一步提高其基因輸運(yùn)的能力。表l:RPC1類(lèi)似物的轉(zhuǎn)染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體及其衍生物，其特征在于其碳端是由7個(gè)氨基酸組成的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域PKKKRKV，它可以通過(guò)電荷相互作用力和DNA結(jié)合；氮端是由5個(gè)氨基酸組成的腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域CGKRK，它可以被多種靶細(xì)胞識(shí)別并進(jìn)入靶細(xì)胞的核內(nèi)，中間是一段由3個(gè)氨基酸組成的接頭WSQ，用來(lái)連接核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域和腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域，命名為RPC，其序列為SEQIDNO.1。2、如權(quán)利要求1所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體，其特征在于所述的衍生物為將RPC碳末端用巰基乙胺修飾，在其氮末端連接上乙?；玫絉PC1。3、如權(quán)利要求1所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體，其特征在于所述的衍生物為將RPC1碳末端修飾的巰基乙胺替換成氨基得到RPC2。4、如權(quán)利要求1所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體，其特征在于所述的衍生物為將RPC1氮末端的乙?；鎿Q成9-芴甲氧羰基得到RPC3。5、如權(quán)利要求1所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體，其特征在于所述的衍生物為將RPC1碳端的纈氨酸替換成賴(lài)氨酸得到RPC4。6、如權(quán)利要求1所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體，其特征在于所述的衍生物為在RPC1序列中間插入一個(gè)賴(lài)氨酸得到RPC5。7、權(quán)利要求1-6所述的能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體及衍生物在運(yùn)輸外源DNA到真核細(xì)胞中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種能夠?qū)φ婧思?xì)胞進(jìn)行基因輸運(yùn)的多肽類(lèi)載體及其衍生物，其碳端是由7個(gè)氨基酸組成的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域PKKKRKV，它可以通過(guò)電荷相互作用力和DNA結(jié)合；氮端是由5個(gè)氨基酸組成的腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域CGKRK，它可以被多種靶細(xì)胞識(shí)別并進(jìn)入靶細(xì)胞的核內(nèi)，中間是一段由3個(gè)氨基酸組成的接頭WSQ，用來(lái)連接核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域和腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明首次將不同功能的肽段結(jié)構(gòu)域通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟB接起來(lái)，設(shè)計(jì)出一種新型多肽，不僅可以作為真核細(xì)胞基因輸運(yùn)的載體，而且具有高度的生物安全性，尤其對(duì)于原代真核細(xì)胞具有較高的基因輸運(yùn)能力。文檔編號(hào)C12N15/79GK101381741SQ200810225469公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月31日優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日發(fā)明者樂(lè)于,溫龍平,娜滿(mǎn)申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)