專利名稱：一種真核細胞中重組糖蛋白高水平表達的載體系統(tǒng)pSA的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種真核細胞中重組糖蛋白高 水平表達的載體系統(tǒng)PSA。本發(fā)明還提供了特別適合在動物細胞中高效表達人活化蛋白C 的表達載體。
背景技術：
目前已發(fā)展了多種蛋白質表達系統(tǒng)來生產生物體的外源蛋白，比如大腸埃希氏菌 表達系統(tǒng)，酵母表達系統(tǒng)，高等真核細胞表達系統(tǒng)等，但這些系統(tǒng)仍存在某些有待改進的缺 陷。如何應用這些新的表達系統(tǒng)來高效表達所需目的基因，也是本領域中急需摸索和研究 的問題。例如大腸桿菌作為宿主可表達多種蛋白，但是其存在(1)缺少真核生物的蛋白翻 譯后的修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等；(2)表達的蛋白多形成不溶性包涵體， 需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性；(3)菌體蛋白較不利于純化等缺點。而釀酒酵母系統(tǒng)也具有局限性(1)產量通常較低；(2)表達質粒易于丟失；(3) 缺乏強有力的受嚴格調控的啟動子；(4)外源蛋白過度糖基化修飾會嚴重的改變蛋白質的 免疫原性、降低活性、縮短滯留時間；(5)分泌效率差，純化困難。綜上所述，目前人類的糖基化蛋白質在動物細胞中表達存在表達量較低、生產成 本高，或在細菌中表達時活性較低的技術難點。因此，本領域迫切需要開發(fā)一種在動物細胞 中高效表達人類糖基化蛋白(尤其是人活化蛋白C)的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種在動物細胞中高效表達人類糖基化蛋白(尤其是人 活化蛋白C)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種可用于在動物細胞內表達外源蛋白的表達載 體，其特征在于，所述的載體含有表達外源蛋白的表達盒，所述的表達盒從5’至3’依次具 有以下元件(a)第一啟動子，所述的第一啟動子選自CMV啟動子；(b)多克隆位點以及任選的位于多克隆位點之中、之前或之后的外源蛋白的編碼 序列；(C)第一 POlyA序列，所述的第一 POlyA序列選自牛生長因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)；(d)第二啟動子，所述的第二啟動子選自SV40早期啟動子；(e)選擇標記基因，所述的選擇標記基因選自Neo(R)基因；和(f)第二 polyA信號序列，所述的第二 polyA信號序列選自SV40 polyA信號序 列。在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體還含有增強子。
在另一優(yōu)選例中，所示的表達載體在元件(a)和(b)之間還具有用于mRNA測序的 T7啟動子序列。在另一優(yōu)選例中，所述的增強子位于外源蛋白的編碼序列的上游。在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白的編碼序列和所述選擇標記基因含有起始密碼 子ATG和終止密碼子。在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白選自下組促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因 子、粒-巨噬細胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經期促性腺激素、胰島素樣生長因子(如生 長調節(jié)素-C)、角化細胞生長因子、神經膠質細胞系產生的神經營養(yǎng)因子、血栓調節(jié)蛋白、堿 性纖維母細胞生長因子、胰島素、因子VII、因子VIII、生長激素、骨形態(tài)形成蛋白-2、血小 板產生的生長因子、水蛭素、及它們突變蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白是人活化蛋白C。在另一優(yōu)選例中，所述的人活化蛋白C來源于人。在另一優(yōu)選例中，所述的人活化蛋白C具有天然序列、變異序列或重組序列。更佳 地，所述的人活化蛋白C具有SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的抗性基因選自腺苷脫氨酶(ADA)、新霉素(neo)、二氫葉 酸還原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸轉移酶(HPH)、胸苷激酶(tk)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉 移酶(gpt)、多重耐藥基因(MDR)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性 (CAD)、或嘌呤霉素-乙酰轉移酶(PAC)在另一優(yōu)選例中，所述的標記基因是新霉素抗性基因(Neo)。在另一優(yōu)選例中，所述的標記基因具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的載體還含有用于在大腸桿菌中擴增載體的復制起點 (puc)、以及用于在大腸桿菌中進行篩選的另一篩選基因。其中，所述的篩選基因、所述的標 記基因和所述的編碼外源蛋白的基因各不相同。在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是包含序列如SEQ ID NO :1所示外源蛋白編碼 序列和序列如SEQ ID NO :2所示的標記基因的表達載體(pSA/APC)。在本發(fā)明的第二方面，提供了由本發(fā)明第一方面中任一所述的表達載體所轉化的 宿主細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是動物細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞選自幼倉鼠腎細胞(BHK)和人胚胎腎細胞 (HEK)。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞中具有3-20個所述的表達載體、3-20個所述的 表達盒、或、3-20個拷貝的所述外源基因的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞表達外源蛋白的速度> 1.5pg/細胞/天，較佳 地> 2. Opg/細胞/天，更佳地> 3. Opg/細胞/天，更佳地> 4. Opg/細胞/天，> 5. Opg/ 細胞/天。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備外源蛋白的方法，其特征在于，所述的方法 包括(a)培養(yǎng)本發(fā)明第二方面中所述的宿主細胞，從而表達所述的外源蛋白；(b)分離出表達的所述的外源蛋白。
4
應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具 體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。例如，就某一大范圍 (如10-100)的上限可以與另一優(yōu)選的較小范圍(如20-80)的下限20進行組合，從而構成 另一范圍(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。


圖1 :pSA載體和pSA/APC載體構建過程示意圖。其中，各元件如下 圖 2 :pSA/APC 酶切圖譜。圖3 :pSA/APC轉化動物細胞所得高表達細胞株的免疫活性結果，后者采用的抗體 是鼠源抗人APC的單克隆抗體。
具體實施例方式在重組蛋白表達領域，要獲得高表達量的表達載體更是取決于眾多因素。例如所 采用的表達方式有關、所采用的表達盒中的各元件、各元件的組合位置、基因拷貝數等。本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了將待表達的外源基因與一抗性的標 記基因偶聯(lián)(或配對連接)，從而構成一“偶聯(lián)的”、整體性的雙基因表達盒。在該表達盒中， 外源基因的翻譯和標記基因(如Neo)的翻譯是相對獨立，但又有聯(lián)系。在宿主細胞的培養(yǎng) (或篩選)條件下，標記基因的表達是為了保證外源基因的表達，從而使外源基因隨選擇標 記基因拷貝數在基因擴增過程中的增加而增加，從而獲得高表達外源蛋白的細胞株。在此 基礎上完成了本發(fā)明。外源蛋白如本文所用，術語“外源蛋白的編碼序列”、“異源編碼序列”、“異源基因序列”、“異 源基因”、“重組基因”、“感興趣的基因”、“目的基因”和“轉基因”可互換使用。這些術語用 于DNA序列時指編碼重組或異源基因產物的DNA序列。所述異源基因序列在宿主細胞中天然不存在而且來自不同種的生物?？墒贡景l(fā)明的重組或異源基因產物在哺乳動物細胞中表 達和大量收集。所述基因產物可以是肽或多肽，可以是任何感興趣的蛋白質，如治療蛋白質 (如白介素)或酶或多聚蛋白質的亞單元(如抗體或其片段)。所述重組產物的基因可包 含信號序列，其編碼的信號肽可使宿主生產細胞表達的多肽分泌出來的。在本發(fā)明的進一 步優(yōu)選的實施方式中，產物蛋白是為分泌蛋白質。代表性的外源蛋白包括(但并不限于)促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、 粒_巨噬細胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經期促性腺激素、胰島素樣生長因子(如生長 調節(jié)素-C)、角化細胞生長因子、神經膠質細胞系產生的神經營養(yǎng)因子、血栓調節(jié)蛋白、堿性 纖維母細胞生長因子、胰島素、因子VII、因子VIII、生長激素、骨形態(tài)形成蛋白-2、血小板 產生的生長因子、水蛭素、及它們突變蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白?！N特別優(yōu)選外源蛋白是人活化蛋白C。如本文所用，術語“人活化蛋白C基因”、“APC基因”可互換使用，均指包含本發(fā)明 SEQ ID NO :1所示的序列，且可表達產生本發(fā)明的人活化蛋白C的核苷酸序列。該術語還 包括人活化蛋白C基因的天然序列、變異序列或重組序列在本發(fā)明的一個實施方式中，可通過常規(guī)分子生物學方法獲得所述的外源基因 (例如人活化蛋白C基因)，所述方法可按照常規(guī)條件如Sambrook等人，《分子克隆實驗室 指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進行。其他元件在本發(fā)明中，可使用的標記基因沒有特別限制，代表性的標記基因選自下組二氫 葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素 抗性基因。在本發(fā)明中，可使用的啟動子(包括第一啟動子和第二啟動子)沒有特別限制，代 表性的啟動子選自(但并不限于)大腸桿菌的Iac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真 核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄 病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。 特別優(yōu)選的第一啟動子是CMV啟動子。在本發(fā)明中，可以選用各種常規(guī)的多克隆位點(MCS)，以便插入外源蛋白的編碼序 列。當然，插入的外源蛋白的編碼序列可以位于在多克隆位點之中、之前或之后。在本發(fā)明中，可使用的polyA序列(包括第一 polyA序列和第二 polyA序列)沒 有特別限制，代表性的PolyA序列選自(但并不限于)牛生長因子polyA (bovine growth factor hormone polyA), SV40 早期啟動子。優(yōu)選的第一 polyA序列是牛生長因子polyA。另外，第二啟動子宜與第二 polyA序列來源于同一物種，或來源于同一基因，例如 當第二啟動子是SV40早期啟動子，則第二 polyA序列為SV40 polyA信號序列；如本文所用，術語“間隔序列，，指位于各元件之間的起到間隔作用的序列。在本發(fā) 明中，優(yōu)選地，間隔序列位于元件外源蛋白的編碼序列和SV40啟動子之間。間隔序列可以 源自天然序列或人工合成的序列。源自天然序列的間隔序列的例子是基因的非翻譯區(qū)，代 表性的例子包括Histone H3. 3 putativetranscription pause site的非翻譯區(qū)，禾口腦心 肌炎病毒(Enc^phaloMycardiatis Virus, EMCV)的 5，非翻譯區(qū)等。
6
本發(fā)明的外源基因以及其他元件(如啟動子、標記基因、POlyA序列、間隔序列) 的核苷酸全長序列通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。以外源基因為 例，對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設 計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模 板，擴增而得有關序列片段。然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、酵母質粒、植物細胞病毒、或其他 載體。只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。通常，將獲得的用于構成本發(fā)明表達盒的各元件，按正確的順序連接在一起，就可 形成本發(fā)明的表達盒。然后，將本發(fā)明的表達盒插入常規(guī)的或市售的表達載體，即可形成本 發(fā)明的表達載體。本發(fā)明的適合在動物細胞中高效表達人類糖基化蛋白(尤其是人活化蛋白C)的 載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代 表性例子有大腸桿菌，CHO、C0S、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。優(yōu)選的宿 主細胞是肝細胞、腎細胞、CH0。更佳地，宿主細胞是腎細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的 方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據所用 的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導) 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。哺乳動物細胞系的合適培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法是本領域熟知的，例如可見 US5, 633, 162中的描述。用于實驗室燒瓶培養(yǎng)或低密度細胞培養(yǎng)可滿足特定類型細胞需 要的標準細胞培養(yǎng)液的例子包括但不限于Roswell Park MemorialInstitute (RPMI) 1640 培養(yǎng)液(Morre, G, The journal of the American MedicalAssociation, 199 :519,1967)、 L-15 培養(yǎng)液(Leibovitz，A 等，Amer. J. ofHygiene,78 :173，1963) ,Dulbecco 改良 Eagle 培 養(yǎng)液、Eagle 最簡單基礎培養(yǎng)液(Eagle，s minimal essential medium, MEM)、Ham F12 培 養(yǎng)液(Ham, R等，Proc. Natl. Acad. Sc. 53 =288,1965)或缺少白蛋白、運鐵蛋白和卵磷脂的 Iscoves 改良 DMEM (Iscoves 等，J.Exp, med. 1 :923，1978)。例如，Ham FlO 或 F12 培養(yǎng)液是 專門為CHO細胞培養(yǎng)設計的。特別適合于CHO細胞培養(yǎng)的其它培養(yǎng)液見EP-481791中所述。 已知此類培養(yǎng)液中可增添胎牛血清(FBS，也稱為胎小牛血清FCS)，后者提供了天然來源的 豐富激素和生長因子。目前哺乳動物細胞的培養(yǎng)是常規(guī)操作，在科學教科書和手冊中有全 面的描述，細節(jié)可參見R. IanFresney，《動物細胞的培養(yǎng)》(Culture of Animal cells)，手 冊,第 4 版，Wiley-Liss/N. Y.，2000。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
I=I O在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，提供了 一種pSA/人活化蛋白C表達載體。在該載體中， 外源基因和作為選擇的標記基因(新霉素抗性基因，Neo(R))這兩個基因由Histone H3. 3 putative transcription pause site的非翻譯區(qū)相互連接。在該非翻譯區(qū)之后還含有另 外一個SV40啟動子，保證目的基因的翻譯和Neo(R)的翻譯是獨立進行的。Neo(R)基因的 表達是為了保證目的基因的表達。表達載體PSA/人活化蛋白C表達動物細胞分泌型的人 活化蛋白C，所分泌表達重組的人活化蛋白C具有同天然的人活化蛋白C相同的氨基酸序 列，并具有足夠臨床使用的效價，因此適用于商業(yè)化。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括(i)使外源基因隨選擇標記基因拷貝數在基因擴增過程中的增加而增加，從而獲 得高表達外源蛋白的細胞株。(ii)可以快速地獲得高表達外源蛋白的細胞株。(iii)所獲得的表達外源蛋白的細胞株的表達速度高。通常，所述的細胞株表達外 源蛋白的速度彡2. Opg/細胞/天，甚至彡5. Opg/細胞/天。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如 Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1pSA載體和pSA/人活化蛋白C載體構建參見圖1，先用常規(guī)PCR方法獲得人活化蛋白C基因以及下表中所示的各元件
Neo(R)基因用于細胞株篩選的選擇標記基因SV40 polyA 位點轉錄終止和轉錄后RNA加工信號將pCMV(CMV啟動子)、pT7(T7啟動子)、MCS (多克隆酶切位點)、BGHPolyA(牛生 長因子PolyA位點)、SV40早期啟動子、Neo (R)基因、和SV40 polyA位點用連接酶依次連 接，形成表達盒。然后，將表達盒插入含pUC復制起點和Amp (R)抗性基因的質粒，形成表達載體 pSA。將人活化蛋白C基因插入用表達載體pSA的多克隆位點，形成質粒pSA/人活化蛋 白C。pSA/人活化蛋白C的酶切圖譜結果如圖2所示，顯示質粒構建正確。 接著，將表達載體pSA/人活化蛋白C用常規(guī)方法轉化自幼倉鼠腎細胞(BHK)，用在 含新霉素的條件下篩選，獲得多株高表達人活化蛋白C的細胞株。對于所得高表達人活化蛋白C白C的細胞株，用常規(guī)方法(ELISA)進行免疫活性 檢測，其中采用的抗體是鼠源抗人APC的單克隆抗體。結果如圖3所示，轉化的APC細胞株培養(yǎng)24小時后取上清500倍稀釋ELISA測量， 并計數其細胞數量，計算表達量為3. 2pg/細胞/天。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>蘇州澤璟生物制藥有限公司<120> 一種真核細胞中重組糖蛋白高水平表達的載體系統(tǒng)pSA<130)093123<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>1386<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1atgtggcagctcacaagcctcctgctgttcgtggccacctggggaatttccggcacacca60
gctcctcttgactcagtgttctccagcagcgagcgtgcccaccaggtgctgcggatccgc120
aaacgtgccaactccttcctggaggagctccgtcacagcagcctggagcgggagtgcata180
gaggagatctgtgacttcgaggaggccaaggaaattttccaaaatgtggatgacacactg240
gccttctggtccaagcacgtcgacggtgaccagtgcttggtcttgcccttggagcacccg300
tgcgccagcctgtgctgcgggcacggcacgtgcatcgacggcatcggcagcttcagctgc360
gactgccgcagcggctgggagggccgcttctgccagcgcgaggtgagcttcctcaattgc420
9
tcgctggacaacggcggctgcacgcattactgcctagaggaggtgggctggcggcgctgt480
agctgtgcgcctggctacaagctgggggacgacctcctgcagtgtcaccccgcagtgaag540
ttcccttgtgggaggccctggaagcggatggagaagaagcgcagtcacctgaaacgagac600
acagaagaccaagaagaccaagtagatccgcggctcattgatgggaagatgaccaggcgg660
ggagacagcccctggcaggtggtcctgctggactcaaagaagaagctggcctgcggggca720
gtgctcatccacccctcctgggtgctgacagcggcccactgcatggatgagtccaagaag780
ctccttgtcaggcttggagagtatgacctgcggcgctgggagaagtgggagctggacctg840
gacatcaaggaggtcttcgtccaccccaactacagcaagagcaccaccgacaatgacatc900
gcactgctgcacctggcccagcccgccaccctctcgcagaccatagtgcccatctgcctc960
ccggacagcggccttgcagagcgcgagctcaatcaggccggccaggagaccctcgtgacg1020
ggctggggctaccacagcagccgagagaaggaggccaagagaaaccgcaccttcgtcctc1080
aacttcatcaagattcccgtggtcccgcacaatgagtgcagcgaggtcatgagcaacatg1140
gtgtctgagaacatgctgtgtgcgggcatcctcggggaccggcaggatgcctgcgagggc1200
gacagtggggggcccatggtcgcctccttccacggcacctggttcctggtgggcctggtg1260
agctggggtgagggctgtgggctccttcacaactacggcgtttacaccaaagtcagccgc1320
tacctcgactggatccatgggcacatcagagacaaggaagccccccagaagagctgggca1380
ccttag1386
<210>2
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>新霉素抗性基因
<400>2
atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60
ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgCCgCCgtgttccggctgtca120
gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180
caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240
ctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcag300
gatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg360
cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgc420
atcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaa480
gagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgac540
ggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaat600
ggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggac660
atagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc720
ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780
gacgagttcttctga79權利要求
一種可用于在動物細胞內表達外源蛋白的表達載體，其特征在于，所述的載體含有表達外源蛋白的表達盒，所述的表達盒從5’至3’依次具有以下元件(a)第一啟動子，所述的第一啟動子選自CMV啟動子；(b)多克隆位點以及任選的位于多克隆位點之中、之前或之后的外源蛋白的編碼序列；(c)第一polyA序列，所述的第一polyA序列選自牛生長因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)；(d)第二啟動子，所述的第二啟動子選自SV40早期啟動子；(e)選擇標記基因，所述的選擇標記基因選自Neo(R)基因；和(f)第二polyA信號序列，所述的第二polyA信號序列選自SV40 polyA信號序列。
2.如權利要求1所述的表達載體，所述的外源蛋白是人活化蛋白C。
3.如權利要求1所述的表達載體，所述的人活化蛋白C來源于人。
4.如權利要求1所述的表達載體，所述的人活化蛋白C具有天然序列、變異序列或重組 序列；更佳地，所述的人活化蛋白C具有SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。
5.如權利要求1所述的表達載體，所述的標記基因是新霉素抗性基因(Neo)。
6.如權利要求1所述的表達載體，所述的標記基因具有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
7.一種由權利要求1-6中任一所述的表達載體所轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞選自幼倉鼠腎細胞 (BHK)和人胚胎腎細胞(HEK293)。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞中具有3-20個所述的 表達載體、3-20個所述的表達盒、或、3-20個拷貝的所述外源基因的編碼序列；和/或所述的宿主細胞表達外源蛋白的速度> 1. 5pg/細胞/天，較佳地> 2. Opg/細胞/天， 更佳地> 3. Opg/細胞/天，更佳地> 4. Opg/細胞/天，> 5. Opg/細胞/天。
10.一種制備外源蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞，從而表達所述的外源蛋白；(b)分離出表達的所述的外源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種真核細胞中重組糖蛋白高水平表達的載體系統(tǒng)pSA，具體地，本發(fā)明提供了可用于在動物細胞內表達外源蛋白的表達載體，它含有表達外源蛋白的表達盒，所述的表達盒從5’至3’依次具有以下元件(a)第一啟動子；(b)多克隆位點以及任選的外源蛋白的編碼序列；(c)第一polyA序列；(d)第二啟動子；(e)選擇標記基因；和(f)第二polyA信號序列。本發(fā)明的表達載體特別適合在動物細胞中高效表達人活化蛋白C。
文檔編號C12N15/85GK101906435SQ20091005257
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權日2009年6月5日
發(fā)明者盛澤林 申請人:蘇州澤璟生物制藥有限公司