核酸擴(kuò)增方法、核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增方法、核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，由于基因利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫(yī)療備受注目。另外，在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)領(lǐng)域也開發(fā)了很多將基因用于鑒別品種、改良品種的方法。作為用于利用基因的技術(shù)，PCR(Polymerase Chain React1n:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))等技術(shù)廣泛普及。如今，PCR在生物體物質(zhì)的信息解析中成為必不可少的技術(shù)。PCR是通過(guò)對(duì)含有作為擴(kuò)增對(duì)象的核酸(靶核酸)和試劑的溶液(反應(yīng)液)實(shí)施熱循環(huán)來(lái)擴(kuò)增靶核酸的方法。作為PCR的熱循環(huán)，普遍的是以2個(gè)梯度或3個(gè)梯度的溫度實(shí)施熱循環(huán)的方法。
[0003]另一方面，關(guān)于醫(yī)療領(lǐng)域中以流行性感冒為代表的感染癥的診斷，現(xiàn)狀是使用免疫層析試劑盒等簡(jiǎn)易檢查試劑盒的診斷成為主流。但是這樣的簡(jiǎn)易檢查中，有時(shí)精度不充分，希望將能夠期待更高的檢查精度的PCR應(yīng)用于感染癥的診斷。另外，醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普通門診患者等由于診察時(shí)間受限的關(guān)系，所以能夠花費(fèi)于檢查的時(shí)間被限制在短時(shí)間內(nèi)。因此，例如流行性感冒的檢查的現(xiàn)狀是犧牲檢查的精度，通過(guò)簡(jiǎn)易的免疫層析試劑盒等的檢查而以短時(shí)間進(jìn)行。
[0004]鑒于上述情況，醫(yī)療領(lǐng)域中，為了實(shí)現(xiàn)利用能夠期待更高精度的PCR進(jìn)行檢查，必須縮短反應(yīng)所需時(shí)間。作為用于以短時(shí)間進(jìn)行PCR反應(yīng)的裝置，例如在專利文獻(xiàn)I中，公開了一種生物體試樣反應(yīng)裝置，其通過(guò)使填充有反應(yīng)液和不與反應(yīng)液混合且比重小于反應(yīng)液的液體的生物體試樣反應(yīng)用芯片在水平方向的旋轉(zhuǎn)軸的周圍旋轉(zhuǎn)，從而使反應(yīng)液移動(dòng)而實(shí)施熱循環(huán)(專利文獻(xiàn)I)。另外，作為PCR的一個(gè)方法，公開了使用磁珠的方法(專利文獻(xiàn)2)、和通過(guò)使用磁珠作為液滴的移動(dòng)機(jī)構(gòu)并使在基板上的溫度變化區(qū)域的液滴移動(dòng)而進(jìn)行PCR熱循環(huán)的方法(專利文獻(xiàn)3)等。
[0005]專利文獻(xiàn)1:日本特開2009-136250號(hào)公報(bào)
[0006]專利文獻(xiàn)2:日本特開2009-207459號(hào)公報(bào)
[0007]專利文獻(xiàn)3:日本特開2008-012490號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供核酸擴(kuò)增方法、核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑盒。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增方法包括在含有核酸的試樣中混合含有促溶物質(zhì)的吸附液和微粒，使上述核酸吸附于上述微粒的吸附工序，用第I清洗液清洗吸附有上述核酸的微粒的清洗工序，使吸附于上述微粒的核酸溶出到溶出液中的溶出工序，以及對(duì)上述溶出液中的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增工序，上述吸附液含有醇，第I清洗液為酸性。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增方法包括在含有核酸的試樣中混合含有促溶物質(zhì)的吸附液和微粒，使上述核酸吸附于上述微粒的吸附工序，用第2清洗液清洗吸附有上述核酸的微粒的清洗工序，用第I清洗液清洗用上述第2清洗液清洗后的吸附有上述核酸的微粒的清洗工序，使吸附于上述微粒的核酸溶出到溶出液中的溶出工序以及將上述核酸擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增工序，其中，上述第2清洗液含有醇或乙腈，第I清洗液為酸性。
[0011]在上述任一種的核酸擴(kuò)增方法中，上述醇可以為甲醇或乙醇。另外，上述吸附液中的醇濃度可以為40%?50%。另外，上述核酸可以是核糖核酸(RNA)，上述核酸擴(kuò)增方法可以包括將溶出到上述溶出液中的上述核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄并合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄工序，核酸擴(kuò)增工序中擴(kuò)增的核酸可以是經(jīng)合成的上述cDNA。另外，核酸擴(kuò)增工序中的反應(yīng)液可以含有50 %以上的上述溶出液，特別是核酸擴(kuò)增工序中的反應(yīng)液可以是上述溶出液。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備具有管和容器，所述管具有長(zhǎng)邊方向，內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第I塞子、由與油發(fā)生相分離且清洗結(jié)合有核酸的微粒的第I清洗液構(gòu)成的第2塞子、由油構(gòu)成的第3塞子、由與油發(fā)生相分離且從結(jié)合有上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子以及由油構(gòu)成的第5塞子，上述容器能夠與上述管的配置有上述第I塞子的一側(cè)連接并連通，且包含使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液，其中，上述吸附液含有醇，上述第I清洗液為酸性。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備具有管和儲(chǔ)液部，所述管具有長(zhǎng)邊方向，內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第I塞子、由與油發(fā)生相分離且清洗結(jié)合有核酸的微粒的第I清洗液構(gòu)成的第2塞子、由油構(gòu)成的第3塞子、由與油發(fā)生相分離且從結(jié)合有上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子以及由油構(gòu)成的第5塞子，所述儲(chǔ)液部與上述管的配置有上述第I塞子的一側(cè)連通，且包含使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液，其中，上述吸附液含有醇，上述第I清洗液為酸性。
[0014]在上述任一個(gè)的核酸提取用設(shè)備中，上述醇可以為甲醇或乙醇。另外，上述吸附液中的醇濃度可以為40%?50%。
[0015]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備具有管，該管具有長(zhǎng)邊方向，內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第I塞子、由與油發(fā)生相分離且清洗結(jié)合有核酸的微粒的第2清洗液構(gòu)成的第6塞子、由油構(gòu)成的第7塞子、由與油發(fā)生相分離且清洗用上述第2清洗液清洗過(guò)的結(jié)合有上述核酸的微粒的第I清洗液構(gòu)成的第2塞子、由油構(gòu)成的第3塞子、由與油發(fā)生相分離且從結(jié)合有上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子以及由油構(gòu)成的第5塞子，其中，上述第2清洗液含有醇或乙腈，上述第I清洗液為酸性。在此，上述核酸提取用設(shè)備可以具有能夠與上述管的配置有上述第I塞子的一側(cè)連接及連通，且包含使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液的容器，上述吸附液可以含有醇，或者，可以具有與上述管的配置有上述第I塞子的一側(cè)連通，且包含使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液的儲(chǔ)液部，上述吸附液可以含有醇。應(yīng)予說(shuō)明，上述第2清洗液所含的醇可以為甲醇或乙醇，其濃度可以為70%?100%。
[0016]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒具備上述任一個(gè)的核酸提取用設(shè)備和與上述管的配置有上述第5塞子的一側(cè)連通，且包含油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器。核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的反應(yīng)液可以含有50%以上的溶出有上述核酸的溶出液，核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的反應(yīng)液可以是上述溶出液。另外，可以具備與上述管的配置有上述第I塞子的一側(cè)連通且向上述管導(dǎo)入上述微粒的罐。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑盒具備核酸提取用設(shè)備和向上述管導(dǎo)入上述微粒的罐，所述核酸提取用設(shè)備具有管，該管具有長(zhǎng)邊方向，內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第I塞子、由與油發(fā)生相分離且清洗結(jié)合有核酸的微粒的第2清洗液構(gòu)成的第6塞子、由油構(gòu)成的第7塞子、由與油發(fā)生相分離且清洗用上述第2清洗液清洗過(guò)的結(jié)合有上述核酸的微粒的第I清洗液構(gòu)成的第2塞子、由油構(gòu)成的第3塞子、由與油發(fā)生相分離且從結(jié)合有上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子以及由油構(gòu)成的第5塞子，其中，上述第2清洗液含有醇或乙腈，上述第I清洗液的pH為酸性。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部件的圖。
[0019]圖2是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部件的圖。
[0020]圖3是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部件的圖。
[0021]圖4A是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備的圖。
[0022]圖4B是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備的圖。
[0023]圖5是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部件的圖。
[0024]圖6是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用盒的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器的圖。
[0025]圖7A是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用試劑盒的一個(gè)例子的圖。
[0026]圖7B是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用試劑盒的一個(gè)例子的圖。
[0027]圖8是示意性地表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用盒的一個(gè)例子的圖。
[0028]圖9是用于說(shuō)明一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取方法的變型例的示意圖。
[0029]圖10是表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用裝置的一個(gè)例子的立體圖。
[0030]圖11是表示一個(gè)實(shí)施方式涉及的核酸提取用裝置的一個(gè)例子的立體圖。
[0031]圖12是表示分批處理的實(shí)驗(yàn)例I和2的一個(gè)結(jié)果的圖。
[0032]圖13是表示使用核酸提取用設(shè)備的實(shí)驗(yàn)例3和4的一個(gè)結(jié)果的圖。
[0033]圖14是表示使用核酸提取用設(shè)備的一個(gè)實(shí)施例的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下對(duì)本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。以下說(shuō)明的實(shí)施方式說(shuō)明本發(fā)明的例子。本發(fā)明完全不限于以下的實(shí)施方式，還包括在不變更本發(fā)明主旨的范圍內(nèi)實(shí)施的各種變型方式。應(yīng)予說(shuō)明，以下說(shuō)明的構(gòu)成不一定全部是本發(fā)明的必需構(gòu)成要素。
[0035]1.核酸提取用設(shè)備
[0036]本實(shí)施方式的核酸提取用設(shè)備1000具有管部100、第I塞子10、第2塞子20、第3塞子30、第4塞子40以及第5塞子50。
[0037]圖1是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸提取用設(shè)備1000的主要部件的圖。
[0038]1.1.管部
[0039]管部100構(gòu)成核酸提取用設(shè)備1000的主要部件。核酸提取用設(shè)備1000除包含管部100之外，還可以包含各種構(gòu)成。雖未圖示，但核酸提取用設(shè)備1000例如可以包含與管部100連接的配管、容器、栓、接頭、泵、控制裝置等。
[0040]管部100是內(nèi)部具有空洞且能夠使液體在該空洞內(nèi)沿長(zhǎng)邊方向流通的筒狀的部分。管部100具有長(zhǎng)邊方向，可以彎曲。就管部100的內(nèi)部的空洞而言，只要收容于內(nèi)部的液體能夠在管部100內(nèi)維持塞子形狀，對(duì)其大小、形狀均沒有特別限定。另外，管部100的內(nèi)部的空洞的大小、與長(zhǎng)邊方向垂直的截面的形狀可以沿管部100的長(zhǎng)邊方向變化。關(guān)于液體是否能夠在管部100內(nèi)維持塞子形狀，取決于管部100的材質(zhì)、液體種類等條件，因此管部100的與長(zhǎng)邊方向垂直的截面的形狀在能夠?qū)⒁后w在管部100內(nèi)維持塞子形狀的范圍內(nèi)被適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)。
[0041]管部100的外形的與長(zhǎng)邊方向垂直的截面的形狀也沒有限定。此外，管部100的壁厚(從內(nèi)部的空洞的側(cè)面到外部的表面的長(zhǎng)度)也沒有特別限定。管部100的內(nèi)部的空洞的與長(zhǎng)邊方向垂直的截面為圓形時(shí)，管部100的內(nèi)徑(內(nèi)部的空洞的與長(zhǎng)邊方向垂直的截面中的圓的直徑)例如可以為0.5mm?3mm。如果管部100的內(nèi)徑為該范圍，貝U在管部100的材質(zhì)、液體種類廣泛的范圍內(nèi)容易形成液體的塞子，所以優(yōu)選。
[0042]管部100的材質(zhì)沒有特別限定，例如，可以是玻璃、高分子、金屬等。應(yīng)予說(shuō)明，如果對(duì)于管部100的材質(zhì)選擇玻璃、高分子等在可見光中具有透明性的材質(zhì)，則能夠從管部100的外部觀察內(nèi)部(空洞內(nèi))，所以優(yōu)選。另外，如果對(duì)于管部100的材質(zhì)選擇透過(guò)磁力的物質(zhì)、非磁性體，則使磁性粒子通過(guò)管部100時(shí)等，通過(guò)從管部100的外部施與磁力而使該通過(guò)的進(jìn)行變得容易，所以更優(yōu)選。
[0043]在管部100的內(nèi)部依次具備由第I油構(gòu)成的第I塞子10、由與油混合時(shí)發(fā)生相分離且清洗結(jié)合有核酸的微粒的第I清洗液構(gòu)成的第2塞子20、由不與第I清洗液混合的第2油構(gòu)成的第3塞子30、由與油混合時(shí)發(fā)生相分離且從結(jié)合有核酸的微粒溶出核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子40以及由不與溶出液混合的第3油構(gòu)成的第5塞子50。
[0044]1.2.第I塞子、第3塞子和第5塞子
[0045]第I塞子10、第3塞子30和第5塞子50均由油構(gòu)成。第I塞子10、第3塞子30和第5塞子50的油可以是相互不同種類的油，也可以是相同種類的油。作為油，例如，可舉出選自二甲基硅油等有機(jī)硅系油、石蠟系油和礦物油以及它們的混合物中的一種。另外，第I塞子10、第2塞子20、第3塞子30、第4塞子40和第5塞子50的形成相鄰塞子的液體以相互不發(fā)生混合的方式選擇。
[0046]在第I塞子10與第3塞子30之間配置第2塞子20。在第I塞子10的與第2塞子20相反側(cè)的區(qū)域可以配置其它液體的塞子。優(yōu)選第I塞子10中沒有氣泡、其它液體，但只要吸附有核酸的粒子等能夠通過(guò)第I塞子10，也可以存在氣泡、其它液體。另外，優(yōu)選在第I塞子10與第2塞子20之間沒有氣泡、其它液體，但只要吸附有核酸的粒子等能夠從第I塞子10向第2塞子20通過(guò)，也可以存在氣泡、其它液體。同樣，優(yōu)選在第2塞子20與第3塞子30之間沒有氣泡、其它液體，但只要吸附有核酸的粒子等能夠從第2塞子20向第3塞子30通過(guò)，也可以存在氣泡、其它液體。
[0047]在第3塞子30與第5塞子50之間配置第4塞子40。在第5塞子50的與第4塞子40相反側(cè)的區(qū)域可以配置其它液體的塞子。優(yōu)選第3塞子30中沒有氣泡、其它液體，但