一種生化微反應(yīng)體系、高通量測(cè)序的建庫(kù)儀及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種生化微反應(yīng)體系，包括第一油性液體、第二油性液體、水基基因樣品和反應(yīng)試劑，其中，所述第一油性液體的密度大于所述第二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑被包埋在所述第一油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成夾心結(jié)構(gòu)，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑與所述第一油性液體、第二油性液體均不相混溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二油性液體不互溶。所述生化微反應(yīng)體系可生化反應(yīng)過(guò)程內(nèi)每個(gè)單獨(dú)樣品的完全控制和分離，避免交叉污染，還可節(jié)省大量耗材。本發(fā)明還提供了基于該生化微反應(yīng)體系的高通量測(cè)序的建庫(kù)儀及應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
一種生化微反應(yīng)體系、高通量測(cè)序的建庫(kù)儀及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種生化微反應(yīng)體系、高通量測(cè)序的建庫(kù) 儀及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前DNA測(cè)序儀的市場(chǎng)上主流的是第二代高通量測(cè)序平臺(tái)，主要包括 Illumina2000/2500/4000、羅氏公司的454測(cè)序儀、ABI公司的SOLID測(cè)序儀，在基因樣本準(zhǔn) 備上機(jī)進(jìn)行測(cè)序前，都需要制備測(cè)序文庫(kù)。建庫(kù)(文庫(kù)制備)過(guò)程涉及到基因樣本加入、加入 緩沖液及酶試劑混合液、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、磁珠純化等工藝環(huán)節(jié)，流程復(fù)雜且所使用 液體體系龐大，發(fā)生混樣及樣品污染風(fēng)險(xiǎn)極高。
[0003] 為解決上述困難，現(xiàn)有的全自動(dòng)文庫(kù)制備方案有如下兩種:一是基于傳統(tǒng)的文庫(kù) 制備方法，試劑及樣本體系均保持不變，采用移液工作站將制備過(guò)程自動(dòng)化，具體以 PerkinElmer Janus NGS Express為代表，缺點(diǎn)是單次運(yùn)行只能實(shí)現(xiàn)最大通量24份，且耗費(fèi) 大量一次性塑料耗材及試劑。二是基于預(yù)先將文庫(kù)制備試劑封裝入密封試劑盒，使用限制 性內(nèi)切酶對(duì)DNA分子進(jìn)行剪切，數(shù)字微流體控制納升級(jí)大小液滴，將DNA樣本自動(dòng)裝載入一 次性文庫(kù)卡片(Library card)，典型的技術(shù)是Illumina NeoPrep臺(tái)式建庫(kù)儀。該技術(shù)的自 動(dòng)化程度高、流程精簡(jiǎn)，但文庫(kù)制備的樣本通量小（16份），且只適用于Illumina測(cè)序平臺(tái)。
[0004] 現(xiàn)有的建庫(kù)方法中，為了確保相對(duì)高濃度的靶樣品，通常的樣本體積范圍為200y L，試劑體積大于200yL，相對(duì)大體積的反應(yīng)體積會(huì)導(dǎo)致高試劑成本，同時(shí)還需要大量使耗費(fèi) 一次性耗材(如槍頭等）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明第一方面提供了一種新型油包水的生化微反應(yīng)體系，并基于該 生化微反應(yīng)體系提供了一種高通量測(cè)序的建庫(kù)儀，可以降低反應(yīng)體系的體積，減少樣品用 量，確保生化反應(yīng)過(guò)程內(nèi)每個(gè)單獨(dú)樣品的完全控制和分離，避免交叉污染，還可節(jié)省大量耗 材。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了一種生化微反應(yīng)體系，用于制備測(cè)序的核酸文庫(kù)和核酸 擴(kuò)增，所述生化微反應(yīng)體系包括第一油性液體、第二油性液體、水基基因樣品和反應(yīng)試劑， 其中，所述第一油性液體的密度大于所述第二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑被 包埋在所述第一油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成夾心結(jié)構(gòu)，所述水基基因樣品和反應(yīng)試 劑與所述第一油性液體、第二油性液體均不相混溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二 油性液體不互溶。
[0007] 優(yōu)選地，所述基因樣品為片段化的DNA或RNA樣品的水性溶液;所述反應(yīng)試劑為基 因樣品的核酸擴(kuò)增、測(cè)序的核酸文庫(kù)制備中常用的試劑，所述反應(yīng)試劑包括生物酶、緩沖溶 液、酸和堿中的一種或多種。
[0008] 優(yōu)選地，所述第一油性液體的密度大于純水密度，其密度為1.01-2. Og/cm3。進(jìn)一 步優(yōu)選為 1 ? 01-1 ? 2g/cm3、1 ? 6-1 ? 95g/cm3 〇
[0009] 優(yōu)選地，所述第二油性液體的密度小于純水密度，其密度為0.09-0.99g/cm3。
[0010] 優(yōu)選地，所述第一油性液體與所述第二油性液體的體積比為1: (2-4)。
[0011] 本發(fā)明第一方面提供的生化微反應(yīng)體系，采用密度不同的兩種不互混的油性液體 來(lái)包埋微量的基因樣品和反應(yīng)試劑，第一油性液體在下，第二油性液體在上，可以將不同比 重的試劑及基因樣品完全包埋在兩種油性液體之間，形成雙油包水的"夾心"結(jié)構(gòu)，使基因 樣品和反應(yīng)試劑的所有反應(yīng)在該"油包水"的生化微反應(yīng)體系中完成，以達(dá)到降低反應(yīng)體系 的體積的目的。
[0012] 第二方面，本發(fā)明提供了一種高通量測(cè)序的建庫(kù)儀，所述高通量測(cè)序的建庫(kù)儀，包 括機(jī)臺(tái)以及設(shè)置在機(jī)臺(tái)上的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，所述機(jī)臺(tái)上還設(shè)有控制器、恒流栗、純化板、試劑區(qū)、 反應(yīng)孔板;所述試劑區(qū)包括多個(gè)試劑槽，所述多個(gè)試劑槽用以盛放第一油性液體、第二油性 液體、水基基因樣品、磁珠純化液、洗脫液和多種反應(yīng)試劑;所述反應(yīng)孔板包括陣列分布的 反應(yīng)孔位；
[0013] 所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)上連接有微量加樣裝置和純化板，所述控制器控制所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)帶 動(dòng)所述純化板和所述微量加樣裝置在機(jī)臺(tái)內(nèi)移動(dòng)，并控制所述微量加樣裝置吸取、排出試 劑；
[0014] 所述純化板包括純化板本體、陣列設(shè)置在純化板本體上的管道插入孔和多個(gè)毛細(xì) 管道，所述毛細(xì)管道穿過(guò)所述管道插入孔并在所述純化板本體的上方和下方分別具有第一 延伸端和第二延伸端，在靠近所述第一延伸端處，所述純化板本體上還放置有多個(gè)磁體，形 成所述毛細(xì)管道的磁力區(qū)，所述第一延伸端與所述恒流栗管道連接;所述第二延伸端用于 在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的帶動(dòng)下插入試劑槽及所述反應(yīng)孔位內(nèi)；
[0015] 所述控制器控制所述恒流栗從試劑區(qū)依次吸取第一油性液體、第二油性液體并注 入至反應(yīng)孔板的反應(yīng)孔位，以及控制所述微量加樣裝置吸取水基基因樣品和反應(yīng)試劑并注 入至所述反應(yīng)孔位，形成生化微反應(yīng)體系，所述生化微反應(yīng)體系為水基基因樣品和反應(yīng)試 劑被包埋在所述第一油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成的夾心結(jié)構(gòu)，其中，所述第一油性液 體的密度大于所述第二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑與所述第一油性液體、第 二油性液體均不相混溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二油性液體不互溶。
[0016] 優(yōu)選地，在所述生化微反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)后，在所述控制器的控制下，所述微量加 樣裝置吸取所述磁珠純化液并注入至所述反應(yīng)孔位，所述純化板在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的帶動(dòng)下 移動(dòng)至所述反應(yīng)孔板的上方以使所述毛細(xì)管道的第二延伸端插入所述反應(yīng)孔位內(nèi)；在所述 控制器的控制下，反應(yīng)孔位內(nèi)的液體被所述恒流栗吸取至所述磁力區(qū)進(jìn)行基因樣本富集， 并在所述富集之后，所述恒流栗吸入洗脫液至所述磁力區(qū)進(jìn)行洗脫，并排出純化后的基因 樣本。
[0017] 對(duì)于核酸擴(kuò)增，所述反應(yīng)為PCR擴(kuò)增反應(yīng)，洗脫后的基因樣本即為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018] 對(duì)于核酸文庫(kù)制備，所述反應(yīng)依次包括末端修復(fù)反應(yīng)、接頭連接反應(yīng)、加標(biāo)簽序列 反應(yīng)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，但不限于此。可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中任一可行的文庫(kù)制備的反應(yīng)來(lái)依次 進(jìn)行。根據(jù)每步所需進(jìn)行的反應(yīng)，來(lái)相應(yīng)添加選擇反應(yīng)試劑來(lái)制備生化微反應(yīng)體系。每進(jìn)行 一步反應(yīng)，均需要進(jìn)行一次純化以收集純化后的基因樣本。前一步反應(yīng)純化后的基因樣本， 作為下一步反應(yīng)的生化微反應(yīng)體系的原料之一。
[0019] 本發(fā)明第二方面提供的建庫(kù)儀中，基于油包水的生化微反應(yīng)體系和與之相適配的 純化板進(jìn)行純化，基因樣品和試劑等被包埋在油中，與所述毛細(xì)管道接觸的均是油，毛細(xì)管 道可以重復(fù)利用，無(wú)需采用多個(gè)96孔PCR板、移液槍頭等一次性耗材，也無(wú)需在排除上清液 后再加入洗脫液等繁瑣操作。
[0020] 優(yōu)選地，所述純化板本體被構(gòu)造成三層，在所述純化板中，其有間隔地平行設(shè)置上 板、中板和下板，所述管道插入孔設(shè)置在重疊設(shè)置的所述上板、中板、下板上，所述毛細(xì)管道 穿過(guò)上板、中板、下板上的管道插入孔并分別延伸至所述純化板本體的上板、下板之外，所 述第一延伸端延伸出所述上板，所述第二延伸端延伸出所述下板，所述上板上還放置有多 個(gè)磁體。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述純化板還包括用于將純化板的側(cè)面包圍起來(lái)的包圍部，所述包圍部 的高度低于純化板本體的高度，所述包圍部與所述驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)相連接。
[0022] 優(yōu)選地，所述磁體為永磁體或電磁鐵，所述磁體與所述控制器之間連接有控制線 路，在吸入洗脫液至所述磁力區(qū)后，所述磁體的磁力可通過(guò)斷電控制磁力消失或?qū)⒂来判?磁體移出毛細(xì)管道的范圍外，以進(jìn)行洗脫基因樣本。
[0023] 優(yōu)選地，所述控制器為可編程邏輯控制器(PLC)，所述控制器還配備高分辨率觸摸 顯示屏幕。
[0024] 優(yōu)選地，所述試劑槽包括常溫試劑槽、制冷試劑槽，所述制冷試劑槽的底部設(shè)置有 帕爾貼制冷片，以維持生物酶試劑處于活性溫度。根據(jù)所需生物試劑的存放條件來(lái)選擇相 應(yīng)的試劑槽。
[0025] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)孔板上還設(shè)有溫控器，所述溫控器用于將反應(yīng)體系的溫度控制 在反應(yīng)所需的溫度。所述溫控器包括溫度傳感器和給所述反應(yīng)孔板加熱的升溫裝置和給所 述反應(yīng)孔板制冷的降溫裝置。
[0026] 優(yōu)選地，所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)包括沿第一方向設(shè)置的第一工作臺(tái)、沿第二方向設(shè)置的第 二工作臺(tái)、沿第三方向設(shè)置的第三工作臺(tái)和抓取部件，其中，所述第一方向?yàn)樗椒较?，?述第二方向垂直于所述第一方向，所述第三方向與所述第一、第二方向，所述第二工作臺(tái)沿 第一方向與所述第一工作臺(tái)滑動(dòng)連接，所述第三工作臺(tái)沿第二方向與所述第二工作臺(tái)滑動(dòng) 連接，所述抓取部件沿第三方向與所述第二工作臺(tái)滑動(dòng)連接，所述抓取部件上連接有微量 加樣裝置和純化板；
[0027] 所述第一工作臺(tái)內(nèi)設(shè)有第一伺服電機(jī)，所述第二工作臺(tái)內(nèi)設(shè)有第二伺服電機(jī)，所 述第三工作臺(tái)內(nèi)設(shè)有第三伺服電機(jī)，所述控制器分別與所述第一伺服電機(jī)、第二伺服電機(jī) 和第三伺服電機(jī)電連接;所述第一伺服電機(jī)通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第二工作臺(tái)沿第一方向移 動(dòng)，所述第二伺服電機(jī)通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第三工作臺(tái)沿第二方向移動(dòng)，所述第三伺服電機(jī) 通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述抓取部件沿第三方向移動(dòng)。
[0028]優(yōu)選地，所述抓取部件為機(jī)械手。
[0029]優(yōu)選地，所述第一工作臺(tái)包括固定在所述第一工作臺(tái)上的第一導(dǎo)軌和滑動(dòng)連接在 所述第一導(dǎo)軌上的第一滑塊;所述第二工作臺(tái)包括第二導(dǎo)軌和滑動(dòng)連接在所述第二導(dǎo)軌上 的第二滑塊，所述第二導(dǎo)軌固定在所述第一滑塊上;所述第三工作臺(tái)包括第三導(dǎo)軌和滑動(dòng) 連接在所述第三導(dǎo)軌上的第三滑塊，所述第三導(dǎo)軌固定在所述第二滑塊上，所述抓取部件 固定在所述第三滑塊上。
[0030] 本實(shí)施方式中，所述第二工作臺(tái)沿所述第一導(dǎo)軌通過(guò)所述第一滑塊與所述第一工 作臺(tái)滑動(dòng)連接，所述第三工作臺(tái)沿所述第二導(dǎo)軌通過(guò)所述第二滑塊與所述第二工作臺(tái)滑動(dòng) 連接，所述抓取部件沿所述第三導(dǎo)軌通過(guò)所述第三滑塊與所述第三工作臺(tái)滑動(dòng)連接。所述 第一伺服電機(jī)通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第二工作臺(tái)沿第一方向做左右運(yùn)動(dòng)，所述第二伺服電機(jī)通 過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第三工作臺(tái)沿第二方向做前后運(yùn)動(dòng)，所述第三伺服電機(jī)通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述 抓取部件沿第三方向做上下運(yùn)動(dòng)，所述第四伺服電機(jī)在所述控制器的控制下帶動(dòng)所述微量 加樣裝置吸取、排出試劑。
[0031] 優(yōu)選地，所述微量加樣裝置包括第一微量注射器和第四伺服電機(jī)，所述第一微量 注射器內(nèi)的活塞螺桿連接所述第四伺服電機(jī)的輸出端，所述第四伺服電機(jī)的輸入端與所 述控制器電連接，所述第四伺服電機(jī)在所述控制器的控制下通過(guò)活塞螺桿帶動(dòng)所述第一微 量注射器吸取、排出試劑。
[0032] 優(yōu)選地，在所述第一微量注射器排出試劑至所述反應(yīng)孔位時(shí)，所述注射器的注射 頭插入所述生化微反應(yīng)體系的第二油性液體所在位置（即輕油位置），然后再排出試劑。這 樣可促便于形成雙油包水結(jié)構(gòu)。
[0033] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第一微量注射器的內(nèi)表面涂有鐵氟龍涂層?？梢员ＷC注射器 內(nèi)無(wú)液體殘留。
[0034]在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述微量加樣裝置為微量液體噴射系統(tǒng)，所述微 量液體噴射系統(tǒng)包括供氣源、數(shù)字調(diào)壓器、清洗液貯存瓶、微電磁閥、微噴頭、氣壓力模塊、 沖壓管道、微噴管道、氣壓輸送支管道、氣壓輸送主管道、清洗液吸入管道，其中，所述氣壓 力模塊包括步進(jìn)電機(jī)、第二注射器、與所述步進(jìn)電機(jī)連接的絲桿運(yùn)動(dòng)單元，所述第二注射器 內(nèi)的活塞桿連接所述絲桿運(yùn)動(dòng)單元，所述第二注射器的出口連接有所述氣壓輸送主管道； 所述數(shù)字調(diào)壓器管道連接于所述清洗液貯存瓶與所述供氣源之間，所述數(shù)字調(diào)壓器用于調(diào) 節(jié)所述供氣源以恒定的壓力供給所述沖壓管道;所述控制器通過(guò)控制線路分別連接至所述 步進(jìn)電機(jī)和微電磁閥；
[0035]所述微噴頭與所述氣壓力模塊之間連接有微噴管道、氣壓輸送支管道和氣壓輸送 主管道;所述微噴頭與所述沖洗瓶之間連接有微噴管道和沖壓管道，所述微電磁閥設(shè)置在 所述沖壓管道上用于控制所述微噴頭的噴樣量，所述微噴管道的一端連接所述微噴頭;所 述氣壓力模塊與所述沖洗瓶之間連接有氣壓輸送主管道、清洗液吸入管道;其中，所述微噴 管道、沖壓管道、所述氣壓輸送支管道相臨近的端口之間設(shè)有第一三通閥，所述微噴管道、 氣壓輸送支管道和氣壓輸送主管道相臨近的端口之間設(shè)有第二三通閥；
[0036]當(dāng)吸入試劑時(shí)，調(diào)節(jié)所述第一三通閥、第二三通閥使所述微噴管道、氣壓輸送支管 道和氣壓輸送主管道連通，所述步進(jìn)電機(jī)下拉所述活塞桿吸入試劑至所述微噴管道；當(dāng)噴 出吸入的試劑時(shí)，調(diào)節(jié)所述第一三通閥使所述微噴管道和所述沖壓管道連通，所述數(shù)字調(diào) 壓器供給所述沖壓管道壓力，所述微電磁閥接通，并控制所述微噴頭噴樣；當(dāng)清洗管路時(shí)， 調(diào)節(jié)所述第二三通閥使所述清洗液吸入管道與所述氣壓輸送主管道連通，所述步進(jìn)電機(jī)下 拉所述活塞桿使清洗液注滿所述氣壓輸送主管道;然后調(diào)節(jié)所述第一三通閥、第二三通閥 使所述微噴管道、氣壓輸送支管道和氣壓輸送主管道再次連通，上推所述活塞桿使清洗后 的廢液經(jīng)所述微噴頭排出。
[0037]優(yōu)選地，在吸入試劑時(shí)，所述微噴管道、氣壓輸送支管道和氣壓輸送主管道連通 后，采用步進(jìn)電機(jī)下拉所述活塞桿先吸入部分空氣至所述微噴管道。避免在排出試劑時(shí)，所 述微電磁閥的開(kāi)度較大時(shí)，清洗液被強(qiáng)力加壓進(jìn)所述微噴管道和待排出試劑混合在一起。 先吸入部分空氣，可以在排出試劑后，再將空氣排出，然后將帶入的微量清洗液排出至廢液 槽。
[0038] 本發(fā)明中，在所述微電磁閥接通時(shí)，所述微量液體噴射系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)懸空噴出微 量的試劑，避免微噴頭插入所述反應(yīng)孔位內(nèi)接觸油滴，防止交叉污染，清洗簡(jiǎn)單。此外，所述 微量液體噴射系統(tǒng)還可對(duì)所有接觸試劑的管路進(jìn)行自動(dòng)清洗。
[0039] 本發(fā)明中，設(shè)置了微量試劑的兩種加樣方式，一種是第一微量注射器和第四伺服 電機(jī)相配合的低通量加樣，第二種是高通量加樣的微量液體噴射系統(tǒng)。第一種方式適合于 待處理的基因樣本較少的情況，微量液體噴射系統(tǒng)適用于樣本量較多的情況。適用于最大 樣本通量為96份。第一微量注射器和第四伺服電機(jī)以可拆卸的方式連接在所述驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)的 抓取部件(第三工作平臺(tái)）上。所述微量液體噴射系統(tǒng)也以可拆卸的方式連接在所述驅(qū)動(dòng)結(jié) 構(gòu)的抓取部件上。
[0040] 優(yōu)選地，所述供氣源包括但并不限于氦氣、氮?dú)?。?yōu)選為裝有氦氣的氦氣瓶。
[0041] 本發(fā)明第二方面提供的所述建庫(kù)儀，基于微量加樣裝置、恒流栗以及可在XYZ軸運(yùn) 動(dòng)的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)來(lái)高精度地制備雙油包水的生化微反應(yīng)體系，可以大大縮小反應(yīng)體系的體 積，降低樣本和試劑的使用量。并通過(guò)與所述生化微反應(yīng)體系相適配的純化板對(duì)反應(yīng)后的 體系進(jìn)行純化，提純得到處理后的基因樣品?？梢酝ㄟ^(guò)所述建庫(kù)儀完成簡(jiǎn)單的核酸擴(kuò)增以 及負(fù)責(zé)的核酸文庫(kù)制備，節(jié)省一次性耗材、操作簡(jiǎn)單。
[0042]第三方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明第一方面所述的生化微反應(yīng)體系或如本發(fā)明第 二方面所述的高通量測(cè)序的建庫(kù)儀在制備測(cè)序的核酸文庫(kù)和核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
[0043]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將會(huì)在下面的說(shuō)明書(shū)中部分闡明，一部分根據(jù)說(shuō)明書(shū)是顯而易見(jiàn) 的，或者可以通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施而獲知。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的高通量測(cè)序的建庫(kù)儀的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0045] 圖2為圖1中純化板4的放大圖；
[0046] 圖3為本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中微量加樣裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，（B)為A中微量加 樣裝置3的第一微量注射器30的放大圖；
[0047] 圖4為本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施例中微量加樣裝置3B的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，（A)為吸試 劑時(shí)；（B)為噴出吸入的試劑；（C)為清洗管路中吸取清洗液時(shí)。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0049]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施方式中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式中的技術(shù)方案進(jìn)行清 楚、完整地描述。
[0050]第一方面，本發(fā)明提供了一種生化微反應(yīng)體系，用于制備測(cè)序的核酸文庫(kù)和核酸 擴(kuò)增，所述生化微反應(yīng)體系包括第一油性液體、第二油性液體、水基基因樣品和反應(yīng)試劑， 其中，所述第一油性液體的密度大于所述第二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑被 包埋在所述第一油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成夾心結(jié)構(gòu)，所述水基基因樣品和反應(yīng)試 劑與所述第一油性液體、第二油性液體均不相混溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二 油性液體不互溶。
[0051] 優(yōu)選地，所述水基基因樣品為DNA或RNA樣品經(jīng)過(guò)片段化處理得到，即DNA片段或 RNA片段。
[0052]在本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式中（如快速DNA樣品高通量文庫(kù)制備），所述水基基 因樣品為DNA或RNA樣品，片段化處理也可以在雙油包水的生化微反應(yīng)體系中來(lái)完成。
[0053] 所述反應(yīng)試劑為基因樣品的核酸擴(kuò)增(包括PCR、dPCR、qPCR、TMA、bDNA、LCR等）、測(cè) 序的核酸文庫(kù)制備(如末端修復(fù)、加接頭、加序列標(biāo)簽、雜交捕獲、PCR擴(kuò)增）中所常用的各種 試劑，包括但不限于各種生物酶、緩沖溶液、酸、堿、鹽溶液?？梢愿鶕?jù)所需要進(jìn)行的核酸擴(kuò) 增或核酸文庫(kù)制備中的各步反應(yīng)來(lái)相應(yīng)選擇反應(yīng)試劑。
[0054]水基基因樣品和反應(yīng)試劑的密度通常介于所述第一油性液體、第二油性液體的密 度之間。例如水基基因樣品和反應(yīng)試劑的密度通常為0.9-1.2g/cm3。
[0055]優(yōu)選地，所述第一油性液體的密度大于純水密度，其密度為1.01-2. Og/cm3。進(jìn)一 步優(yōu)選為 1 ? 01-1 ? 2g/cm3、1 ? 6-1 ? 95g/cm3 〇
[0056] 優(yōu)選地，所述第二油性液體的密度小于純水密度，其密度為0.09-0.99g/cm3。
[0057]優(yōu)選地，所述第一油性液體、所述第二油性液體均為非極性或弱極性硅油材料。 [0058]優(yōu)選地，所述第一油性液體包括FC40電子氟化液(氟代烴油)或全氟化胺油。
[0059] 優(yōu)選地，所述第二油性液體包括苯甲基聚硅氧烷（甲基硅油)或者甲基硅油與聚山 梨酯添加劑的混合物，其中，所述聚山梨酯添加劑優(yōu)選為司盤80、司盤65和吐溫20中的一種 或多種，所述聚山梨酯添加劑的體積為所述甲基硅油體積的〇.〇1%_8%，以達(dá)到非極性平 衡(添加劑的親水-親油平衡值(HLB值)為4-7，優(yōu)選為5。
[0060] 優(yōu)選地，所述第一油性液體與所述第二油性液體的體積比為1: (2-4)。
[0061 ]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第一油性液體的體積為15yL。
[0062]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第二油性液體的體積為40yL。
[0063]優(yōu)選地，所述第一油性液體、所述第二油性液體的用量隨DNA樣本的體積而等比 例增加。
[0064] 本發(fā)明第一方面提供的生化微反應(yīng)體系，采用密度不同的兩種不互混的油性液體 來(lái)包埋微量的基因樣品和反應(yīng)試劑，第一油性液體在下，第二油性液體在上，可以將不同比 重的試劑及基因樣品完全包埋在兩種油性液體之間，形成雙油包水的"夾心"結(jié)構(gòu)，使基因 樣品和反應(yīng)試劑的所有反應(yīng)在該"油包水"的生化微反應(yīng)體系中完成，降低了反應(yīng)體系的體 積。例如，可將傳統(tǒng)建庫(kù)方法中初始DNA樣本用量由15yL降低< 1.5yL，反應(yīng)試劑由>200yL 減為降低至< 20此(通常為5此）。
[0065] 參見(jiàn)圖1-圖3,為本發(fā)明第二方面提供的一種高通量測(cè)序的建庫(kù)儀的結(jié)構(gòu)示意圖。 所述高通量測(cè)序的建庫(kù)儀包括機(jī)臺(tái)100以及設(shè)置在機(jī)臺(tái)100上的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1，所述機(jī)臺(tái)100上 還設(shè)有控制器(圖未示）、恒流栗2、微量加樣裝置3、純化板4、試劑區(qū)5、反應(yīng)孔板6;所述試劑 區(qū)5包括多個(gè)試劑槽51，所述多個(gè)試劑槽51用以分別盛放第一油性液體、第二油性液體、水 基基因樣品、磁珠純化液、洗脫液和多種反應(yīng)試劑;所述反應(yīng)孔板6包括陣列分布的反應(yīng)孔 位61，所述反應(yīng)孔位61提供生化微反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)場(chǎng)所；
[0066]所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)11上連接有微量加樣裝置33和純化板44,所述控制器控制所述驅(qū)動(dòng) 機(jī)構(gòu)1帶動(dòng)所述純化板4和所述微量加樣裝置3在機(jī)臺(tái)100內(nèi)移動(dòng)，并控制所述微量加樣裝置 3吸取、排出試劑；
[0067]所述純化板4包括純化板本體41、陣列設(shè)置在純化板本體41上的管道插入孔42和 多個(gè)毛細(xì)管道43,所述毛細(xì)管道43穿過(guò)所述管道插入孔42并在所述純化板本體41的上方和 下方分別具有第一延伸端431和第二延伸端432(圖中未示），在靠近所述第一延伸端432處， 所述純化板本體41上還放置有多個(gè)磁體44,形成所述毛細(xì)管道43的磁力區(qū)，所述第一延伸 端431與所述恒流栗2管道連接;所述第二延伸端432用于在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1的帶動(dòng)下插入試 劑槽51及所述反應(yīng)孔位61內(nèi)；
[0068] 所述控制器控制所述恒流栗2從試劑區(qū)5依次吸取第一油性液體、第二油性液體 并注入至反應(yīng)孔板6的反應(yīng)孔位61，以及控制所述微量加樣裝置3吸取水基基因樣品和反應(yīng) 試劑并注入至所述反應(yīng)孔位61，形成生化微反應(yīng)體系，所述生化微反應(yīng)體系為水基基因樣 品和反應(yīng)試劑被包埋在所述第一油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成的夾心結(jié)構(gòu)，其中，所述 第一油性液體的密度大于所述第二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑與所述第一油 性液體、第二油性液體均不相混溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二油性液體不互 溶。
[0069] 進(jìn)一步地，在所述生化微反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)后，在所述控制器的控制下，所述微量 加樣裝置3吸取所述磁珠純化液并注入至所述反應(yīng)孔位61，所述純化板4在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1 的帶動(dòng)下移動(dòng)至所述反應(yīng)孔板6的上方以使所述毛細(xì)管道的第二延伸端插入所述反應(yīng)孔位 61內(nèi)；在所述控制器的控制下，反應(yīng)孔位61內(nèi)的液體被所述恒流栗2吸取至所述磁力區(qū)進(jìn)行 基因樣本富集，并在所述富集之后，所述恒流栗2吸入洗脫液至所述磁力區(qū)進(jìn)行洗脫，并排 出純化后的基因樣本。
[0070] 優(yōu)選地，在吸入洗脫液后，移走所述磁體44使所述磁力區(qū)消失，以便于DNA從被吸 附的磁珠上洗脫下來(lái);之后再將恢復(fù)所述磁力區(qū)進(jìn)行富集磁珠成分，排出純化后的基因樣 本。
[0071] 其中，所述反應(yīng)試劑為基因樣品的核酸擴(kuò)增、測(cè)序的核酸文庫(kù)制備中常用的試劑， 所述反應(yīng)試劑包括生物酶、緩沖溶液、酸、堿和鹽溶液中的一種或多種。
[0072] 對(duì)于核酸擴(kuò)增，所述反應(yīng)為PCR擴(kuò)增反應(yīng)，洗脫后的基因樣本即為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0073] 對(duì)于核酸文庫(kù)制備，所述反應(yīng)依次包括末端修復(fù)反應(yīng)、接頭連接反應(yīng)、加序列標(biāo) 簽、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，但不限于此?？梢愿鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)中任一可行的文庫(kù)制備的反應(yīng)來(lái)依次進(jìn) 行。
[0074] 根據(jù)每步所需進(jìn)行的反應(yīng)，從試劑區(qū)5添加選擇相應(yīng)的反應(yīng)試劑來(lái)制備生化微反 應(yīng)體系。每進(jìn)行一步反應(yīng)，均需要采用純化板進(jìn)行一次純化以收集純化后的基因樣本。前一 步反應(yīng)純化后的基因樣本，作為下一步反應(yīng)的生化微反應(yīng)體系的原料之一。例如，進(jìn)行末端 修復(fù)反應(yīng)后，經(jīng)純化得到末端修復(fù)的基因樣本;然后將末端修復(fù)的基因樣本和接頭酶、建 庫(kù)所需標(biāo)簽序列、緩沖液、酸、堿、鹽等制備成又一生化微反應(yīng)體系來(lái)進(jìn)行加接頭反應(yīng)，經(jīng)純 化得到帶標(biāo)簽序列的基因樣本;之后將帶標(biāo)簽序列的基因樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)純化后的 擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成所述高通量測(cè)序文庫(kù)。其中，所述標(biāo)簽序列由ATCG四種基本堿基隨機(jī)組合，且 所述標(biāo)簽序列互不相同，以對(duì)不同DNA樣本進(jìn)行區(qū)分。
[0075] 優(yōu)選地，所述控制器為可編程邏輯控制器(PLC)，所述控制器并配備高分辨率觸摸 顯示屏幕。本發(fā)明中，所述控制器與其他部件的"電連接"，是指其他部件通過(guò)控制線路與控 制器相連。
[0076] 本發(fā)明中，所述恒流栗2不僅用于吸取加入磁珠后的反應(yīng)孔位61內(nèi)的液體混合物， 還用于吸取第一油性液體、第二油性液體、洗脫液。同樣地，在采用恒流栗2吸取第一油性液 體、第二油性液體、洗脫液等液體時(shí)，所述純化板4需要被所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1移動(dòng)至盛放以上以 上物質(zhì)的對(duì)應(yīng)試劑槽51位置，使所述毛細(xì)管道43的第二延伸端432插入相應(yīng)試劑槽51中。其 中，多個(gè)毛細(xì)管道的第一延伸端與所述恒流栗2管道連接，可以是從所述恒流栗2引出一個(gè) 總管，總管與各個(gè)毛細(xì)管道的第一延伸端431通過(guò)一帶有管道孔的蓋體連接，也可以是多個(gè) 毛細(xì)管道的第一延伸端431直接接到恒流栗2的栗頭上。
[0077] 本發(fā)明中，所述微量加樣裝置3吸取水基基因樣品和反應(yīng)試劑、磁珠。每排出一種 物質(zhì)，均需要對(duì)所述微量加樣裝置3進(jìn)行清洗，以便進(jìn)行下一種物質(zhì)的吸取，避免免交叉污 染。優(yōu)選地，所述試劑區(qū)5還包括廢液槽52、清洗液存放槽（圖未示)等。圖1中53處也可以作 為試劑槽，主要用于臨時(shí)存放需要加入每個(gè)反應(yīng)孔位的不同基因樣品及標(biāo)簽序列。
[0078] 優(yōu)選地，所述試劑槽51包括常溫試劑槽、制冷試劑槽，所述制冷試劑槽的底部設(shè)置 有帕爾貼制冷片，以維持生物酶試劑處于活性溫度。根據(jù)所需生物試劑的存放條件來(lái)選擇 相應(yīng)的試劑槽。
[0079] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)孔板6上還設(shè)有溫控器，所述溫控器用于將反應(yīng)體系的溫度控制 在反應(yīng)所需的溫度。所述溫控器包括溫度傳感器和給所述反應(yīng)孔板6加熱的升溫裝置和給 所述反應(yīng)孔板6制冷的降溫裝置。所述溫控器與所述控制器電連接，優(yōu)選通過(guò)串口通信方 式來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢岳斫獾氖牵鰴C(jī)臺(tái)1〇〇上可以包括多個(gè)反應(yīng)孔板，各個(gè)反應(yīng)孔板可以相同， 也可以不同。
[0080] 本發(fā)明實(shí)施例中，所述反應(yīng)孔板6為PCR儀中的溫控反應(yīng)腔體。所述反應(yīng)孔板6包括 96個(gè)反應(yīng)孔位61。
[0081] 優(yōu)選地，所述洗脫液放置在與所述反應(yīng)孔板6的反應(yīng)孔位61相一致的96孔板中，例 如可以放在圖1中試劑區(qū)5的53處。
[0082] 優(yōu)選地，在核酸文庫(kù)制備中，所用的標(biāo)簽序列也放置在與所述反應(yīng)孔板6的反應(yīng)孔 位61相一致的另一96孔板中（試劑區(qū)5的53)。所述標(biāo)簽序列用于給待測(cè)基因樣本進(jìn)行標(biāo)號(hào) 區(qū)分。所述洗脫液和所述標(biāo)簽序列的盛放區(qū)與所述反應(yīng)孔板6在所述機(jī)臺(tái)100內(nèi)間隔設(shè)置。 [0083]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述純化板本體41被構(gòu)造成至少兩層，以便所述毛細(xì)管道43更好 地固定在所述純化板4中。例如，純化板本體41被構(gòu)造成三層，其間隔地平行設(shè)置上板、中板 和下板，所述管道插入孔42設(shè)置在重疊設(shè)置的所述上板、中板和下板上;所述毛細(xì)管道43穿 過(guò)上板、中板和下板上的管道插入孔42并在所述純化板本體41的的上板、下板分別具有第 一延伸端431和第二延伸端432,其中，延伸出所述上板的一端為第一延伸端431，延伸出所 述下板的一端為第二延伸端432。在靠近所述第一延伸端431處，所述純化板本體41的上板 上還放置有多個(gè)磁體44,外部放置有磁體的毛細(xì)管道部分構(gòu)成所述毛細(xì)管道43的磁力區(qū)。 可以理解的是，每層的純化板本體41上陣列設(shè)置有多個(gè)管道插入孔42,所述多個(gè)磁體44放 置在所述上板上的管道插入孔42的間隔處。所述磁體44優(yōu)選以豎直方式放置以節(jié)省空間。 優(yōu)選地，所述磁體44的高度為3-6mm。所述磁體44可以為永磁體或電磁鐵，只要可以實(shí)現(xiàn)提 供磁性作用力的即可。所述磁體44與所述控制器之間連接有控制線路，在吸入洗脫液至所 述磁力區(qū)后，所述磁體44的磁力可通過(guò)斷電控制磁力消失或?qū)⒂来判源朋w移出毛細(xì)管道43 的范圍外(例如移出5mm)，以便于對(duì)DNA洗脫。
[0084]可以理解的是，每根毛細(xì)管道都有相同的磁力作用區(qū)。
[0085]優(yōu)選地，當(dāng)所述磁體44為永磁體時(shí)，可以在磁體44的底部設(shè)置彈簧，通過(guò)控制器 設(shè)置來(lái)控制彈簧的伸縮將所述磁體44彈出所述毛細(xì)管道43的范圍外。
[0086]優(yōu)選地，當(dāng)所述磁體44為電磁鐵時(shí)，可以在所述磁體44與所述控制器之間連接有 控制線路，在吸入洗脫液至所述磁力區(qū)后，通過(guò)斷電控制磁體44的磁力消失（即使毛細(xì)管道 的磁力區(qū)消失）。
[0087]而在DNA洗脫之后，可以恢復(fù)所述磁體44的磁力或?qū)⑵湟苹刂良兓迳希椿謴?fù)所 述磁力區(qū)，以免磁珠隨基因樣品一起排出），便于富集磁珠成分，并排出洗脫后的水性基因 樣品。
[0088]優(yōu)選地，所述磁珠純化液包括磁珠和體積濃度為70 % -85 %的酒精，所述磁珠和酒 精的體積比優(yōu)選為1: (0-2)。磁珠純化液用以對(duì)基因樣本(如DNA)進(jìn)行抓捕。此處使用磁珠 為普通磁珠，表面沒(méi)有鏈霉素親和酶，例如所述磁珠可以是來(lái)自Beckman公司AMpure磁珠。
[0089] 優(yōu)選地，所述磁珠的加入體積為待純化的體系中水相試劑的（1-2)倍。
[0090] 優(yōu)選地，所述洗脫液包括TE緩沖液或純水。
[0091] 優(yōu)選地，在所述恒流栗吸入所述洗脫液之前，采用所述恒流栗吸入體積濃度為 70%_85%的酒精溶液至所述磁力區(qū)，用以清洗掉磁珠表面粘附的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。優(yōu)選為體 積濃度為75 %的酒精溶液，酒精的體積為反應(yīng)微反應(yīng)體系總體積的3-5倍，優(yōu)選清洗兩次。 最好在磁珠吸附區(qū)域靜置5分鐘。之后再采用所述恒流栗吸入所述洗脫液(TE緩沖液或純 水)至所述磁力區(qū)進(jìn)行洗脫。
[0092] 進(jìn)一步地，所述純化板4還包括包圍部45,所述包圍部45將純化板4的側(cè)面包圍起 來(lái)，以使各個(gè)毛細(xì)管道43規(guī)整排列。所述包圍部45設(shè)于純化板4的下半部分的四周，即將所 述純化板本體41的中板、下板的包圍起來(lái)。所述包圍部45的高度優(yōu)選為低于純化板本體41 的高度。通過(guò)抓取所述包圍部45的一側(cè)面來(lái)實(shí)現(xiàn)所述純化板4與所述驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)的連接。
[0093] 本發(fā)明第二方面提供的建庫(kù)儀中，在純化時(shí)，將加入磁珠后的"雙油包水"生化微 反應(yīng)體系吸入毛細(xì)管道44的磁力區(qū)，毛細(xì)管道44中的基因樣本（如DNA)在經(jīng)過(guò)磁力區(qū)時(shí)被 磁珠富集，并從油包水結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)，而被雙油包埋的其他成分在毛細(xì)管道44中繼續(xù)向 前流動(dòng);之后再吸入洗脫液至磁力區(qū)，移去移除磁力區(qū)（通過(guò)電磁控制磁體的磁力消失或 將永磁性磁體移出管道范圍），使含DNA的磁珠成分懸浮于洗脫液中，將富集的DNA洗脫，排 出富集的DNA得到純化后的基因樣本。優(yōu)選地，在排液體時(shí)，先接收洗脫的基因樣本至水或 緩沖溶液中，作為后續(xù)制備生化微反應(yīng)體系的原料，而將毛細(xì)管道44中剩余的包埋其他成 分的油包水結(jié)構(gòu)直接排到試劑區(qū)5的廢液槽52中。由于一根毛細(xì)管道接觸的是用于同一樣 本的油水混合物，可以等全部流程結(jié)束后再清洗管道。
[0094] 傳統(tǒng)的純化方法將直接將試劑及基因樣品放置于96孔板中，然后將96孔板放置于 大塊磁鐵上，被磁珠抓取的DNA成分會(huì)由于磁力作用聚集至96孔板的底部，吸取上清液將孔 板中其他試劑排出之后，得到包含DNA樣本的磁珠。
[0095]本發(fā)明中，基于油包水的生化微反應(yīng)體系和與之相適配的純化板4進(jìn)行純化，基因 樣品和試劑等被包埋在油中，與所述毛細(xì)管道接觸的均是油，毛細(xì)管道可以重復(fù)利用，無(wú)需 采用多個(gè)96孔PCR板、移液槍頭等一次性耗材，也無(wú)需在排除上清液后再加入洗脫液等繁瑣 操作。
[0096] 進(jìn)一步地，所述純化板4上的管道插入孔42(包括孔徑和數(shù)目）構(gòu)造為與所述反應(yīng) 孔板6的反應(yīng)孔位61相一致。每層純化板本體41上的管道插入孔與所述反應(yīng)孔位61的數(shù)目、 排布相一致，以便毛細(xì)管道43的第二延伸端432插入到加磁珠后的反應(yīng)孔位61內(nèi)。所述純化 板4上毛細(xì)管道43的數(shù)目根據(jù)基因樣品的數(shù)目來(lái)決定。
[0097]優(yōu)選地，所述毛細(xì)管道43的材質(zhì)為氟化物(例如聚四氟乙烯），不粘附油性物質(zhì)，保 證不被油包水結(jié)構(gòu)所粘附。
[0098]進(jìn)一步地，參加圖1，所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1包括沿第一方向設(shè)置的第一工作臺(tái)10、沿第二 方向設(shè)置的第二工作臺(tái)20、沿第三方向設(shè)置的第三工作臺(tái)30、抓取部件40 (圖未示），其中， 所述第一方向?yàn)樗椒较颍龅诙较虼怪庇谒龅谝环较?，所述第三方向與所述第一、 第二方向，所述第二工作臺(tái)20沿第一方向與所述第一工作臺(tái)10滑動(dòng)連接，所述第三工作臺(tái) 30沿第二方向與所述第二工作臺(tái)20滑動(dòng)連接，所述抓取部件40沿第三方向與所述第三工作 臺(tái)30滑動(dòng)連接，所述抓取部件40上連接有微量加樣裝置3和純化板4;
[0099]所述第一工作臺(tái)10內(nèi)設(shè)有第一伺服電機(jī)101，所述第二工作臺(tái)20內(nèi)設(shè)有第二伺服 電機(jī)102,所述第三工作臺(tái)30內(nèi)設(shè)有第三伺服電機(jī)103,所述控制器分別與所述第一伺服電 機(jī)101、第二伺服電機(jī)102和第三伺服電機(jī)103電連接；
[0100] 所述第一伺服電機(jī)101通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第二工作臺(tái)20沿第一方向移動(dòng)，所述第 二伺服電機(jī)102通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第三工作臺(tái)30沿第二方向移動(dòng)，所述第三伺服電機(jī)103通 過(guò)螺桿帶動(dòng)所述抓取部件40沿第三方向移動(dòng)。
[0101] 優(yōu)選地，所述抓取部件40為機(jī)械手。
[0102]優(yōu)選地，所述第二工作臺(tái)20以懸臂式結(jié)構(gòu)與所述第一工作臺(tái)10相連接。這樣可以 節(jié)省機(jī)臺(tái)內(nèi)的操作空間。
[0103] 本發(fā)明中，所述機(jī)臺(tái)100內(nèi)還設(shè)有支柱200,所述支柱200支撐所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1?？梢?理解的是，所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1的位置高于所述恒流栗2、反應(yīng)孔板6、試劑區(qū)5。所述第一工作臺(tái) 10固定在所述支柱200上。所述支柱通過(guò)螺釘固定在機(jī)臺(tái)上，所述第一工作臺(tái)10也通過(guò)螺釘 固定在所述支柱200上。
[0104] 本發(fā)明中，所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1位于所述恒流栗2、反應(yīng)孔板6、試劑區(qū)5的后方，所述驅(qū) 動(dòng)機(jī)構(gòu)1在所述控制器的作用下帶動(dòng)所述純化板4和所述微量加樣裝置3在反應(yīng)孔板6、試劑 區(qū)5的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行移動(dòng)。所述第一方向?yàn)樽笥疫\(yùn)動(dòng)方向（也可稱為X軸方向），所述第二方向 為前后運(yùn)動(dòng)方向（也可稱為Y軸方向），所述第三方向?yàn)樯舷逻\(yùn)動(dòng)方向（也可稱為Z軸方向）。
[0105] 優(yōu)選地，所述純化板4和所述微量加樣裝置3可以同時(shí)固定連接，也可以是以可拆 卸的方式安裝在所述驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)1的抓取部件40上。本實(shí)施方式中，純化板4和微量加樣裝置3 是同時(shí)固定連接在驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1的抓取部件40上，優(yōu)選兩者是以"背靠背"的方式連接在抓取 部件40上。避免一個(gè)部件在工作時(shí)，另一個(gè)部件會(huì)阻擋其移動(dòng)路徑。抓取部件40優(yōu)選抓取所 述純化板1的側(cè)壁。
[0106] 在本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式中，在所述控制器的作用下，可以在需要使用在需 要使用純化板4或所述微量加樣裝置3時(shí)，將這2個(gè)部件時(shí)分別從機(jī)臺(tái)上抓取過(guò)來(lái)。
[0107] 具體地，所述第一工作臺(tái)10包括固定在所述第一工作臺(tái)10上的第一導(dǎo)軌和滑動(dòng) 連接在所述第一導(dǎo)軌上的第一滑塊;所述第二工作臺(tái)20包括第二導(dǎo)軌和滑動(dòng)連接在所述第 二導(dǎo)軌上的第二滑塊23,所述第二導(dǎo)軌固定在所述第一滑塊上;所述第三工作臺(tái)30包括第 三導(dǎo)軌和滑動(dòng)連接在所述第三導(dǎo)軌上的第三滑塊34,所述第三導(dǎo)軌固定在所述第二滑塊23 上，所述抓取部件40固定在所述第三滑塊34上。
[0108] 本實(shí)施方式中，所述第二工作臺(tái)20沿所述第一導(dǎo)軌通過(guò)所述第一滑塊與所述第一 工作臺(tái)10滑動(dòng)連接，所述第三工作臺(tái)30沿所述第二導(dǎo)軌通過(guò)所述第二滑塊23與所述第二工 作臺(tái)20滑動(dòng)連接，所述抓取部件40沿所述第三導(dǎo)軌通過(guò)所述第三滑塊34與所述第三工作臺(tái) 30滑動(dòng)連接。所述第一伺服電機(jī)101通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第二工作臺(tái)20沿第一方向做左右運(yùn) 動(dòng)，所述第二伺服電機(jī)102通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述第三工作臺(tái)30沿第二方向做前后運(yùn)動(dòng)，所述第 三伺服電機(jī)103通過(guò)螺桿帶動(dòng)所述抓取部件40沿第三方向做上下運(yùn)動(dòng)。
[0109] 本實(shí)施方式中，所述第一工作臺(tái)10內(nèi)設(shè)有第一伺服電機(jī)101、第一螺桿，所述第一 伺服電機(jī)101和所述第一螺桿之間通過(guò)聯(lián)軸器相連接。同樣地，所述第二工作臺(tái)20內(nèi)設(shè)有第 二伺服電機(jī)102、第二螺桿，所述第二伺服電機(jī)102和所述第二螺桿之間通過(guò)聯(lián)軸器相連接。 [0110]圖3為圖1中建庫(kù)儀的所述微量加樣裝置3的放大圖。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，參 加圖3,所述微量加樣裝置3包括第一微量注射器30和第四伺服電機(jī)104,所述第一微量注射 器30內(nèi)的活塞螺桿301連接所述第四伺服電機(jī)104的輸出端，所述第四伺服電機(jī)104的輸入 端與所述控制器電連接，所述第四伺服電機(jī)104在所述控制器的控制下通過(guò)活塞螺桿301帶 動(dòng)所述第一微量注射器30吸取、排出試劑。
[0111] 進(jìn)一步地，如圖3所示，所述第一微量注射器30包括活塞螺桿301、注射頭302、進(jìn)樣 器活塞303、進(jìn)樣器套筒304和進(jìn)樣器固定螺母305。進(jìn)樣器固定螺母305可固定在所述第四 伺服電機(jī)104上。
[0112] 優(yōu)選地，在所述第一微量注射器排出試劑到反應(yīng)孔位61時(shí)，所述注射器的注射頭 302插入所述生化微反應(yīng)體系的第二油性液體所在位置（即輕油位置），然后再排出試劑。 這樣水性液體(包括水基基因樣本和反應(yīng)試劑)會(huì)自動(dòng)包埋在所述第一油性液體、第二油性 液體之間構(gòu)成夾心結(jié)構(gòu)，所述第一油性液體在下面，所述第二油性液體在上面，兩種油性液 體不互混。在所述第一微量注射器排出試劑之后，從所述試劑區(qū)5的清洗液存放槽中吸取清 洗液，對(duì)所述第一微量注射器進(jìn)行清洗，以便進(jìn)行下一種試劑的吸取。所述清洗液存放槽中 的清洗液為酒精或次氯酸鈉溶液。
[0113]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第一微量注射器30的內(nèi)表面涂有鐵氟龍涂層?？梢员ＷC注射 器內(nèi)無(wú)液體殘留。
[0114] 所述第四伺服電機(jī)104可以精確控制所述第一微量注射器30的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)精度可 達(dá)5wii。所述第一微量注射器30的量程可低至2yL。在所述第四伺服電機(jī)104的配合下，所述 第一微量注射器30的吸液量可最低0.4yL，吸液的均一度可控制在5 %精度內(nèi)。
[0115] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第一微量注射器30的數(shù)目可以是一個(gè)或多個(gè)。例如1個(gè)、6個(gè)、8 個(gè)，也可以同時(shí)帶有1個(gè)和多個(gè)注射器（圖1中即是同時(shí)帶有1個(gè)和8個(gè)微量注射器的）。當(dāng)可 以根據(jù)所需要樣本的數(shù)目來(lái)選擇，可以一個(gè)一個(gè)地進(jìn)樣，也可以采用多個(gè)注射器一排排地 進(jìn)樣。
[0116] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，參加圖4,所述微量加樣裝置3為微量液體噴射系 統(tǒng)3B，所述微量液體噴射系統(tǒng)3B包括供氣源31、數(shù)字調(diào)壓器32、清洗液貯存瓶33、微電磁閥 34、微噴頭35、氣壓力模塊36、沖壓管道pl、微噴管道p2、氣壓輸送支管道p3、氣壓輸送主管 道P4、清洗液吸入管道p5,其中，所述氣壓力模塊36包括步進(jìn)電機(jī)、與所述步進(jìn)電機(jī)連接的 絲桿運(yùn)動(dòng)單元（圖未示)和第二注射器360，所述第二注射器360內(nèi)的活塞桿連接所述絲桿運(yùn) 動(dòng)單元，所述第二注射器360的出口連接有所述氣壓輸送主管道p4。具體地，所述第二注射 器360包括活塞桿361、活塞362,所述步進(jìn)電機(jī)通過(guò)絲桿運(yùn)動(dòng)單元推動(dòng)活塞桿361而帶動(dòng)所 述第二注射器的活塞362。
[0117] 優(yōu)選地，所述微電磁閥34的電信號(hào)通過(guò)接口板與所述控制器相連，以對(duì)噴樣量進(jìn) 行控制。
[0118] 優(yōu)選地，所述供氣源31包括但并不限于氦氣、氮?dú)?。?yōu)選為裝有氦氣的氦氣瓶。
[0119] 所述數(shù)字調(diào)壓器32管道連接于所述清洗液貯存瓶33與所述供氣源31之間。具體 地，所述清洗液貯存瓶33包括進(jìn)氣接口 11、第一接口 01和第二接口 01，所述進(jìn)氣接口 11與所 述數(shù)字調(diào)壓器32的輸出端連接，所述第一接口 01連通于所述沖壓管道pi上的微電磁閥34， 所述第二接口 01連接于所述清洗液吸入管路的吸入端。所述數(shù)字調(diào)壓器32的輸入端與所述 供氣源31通過(guò)一氣路管道連接，所述數(shù)字調(diào)壓器32的輸出端與所述清洗液貯存瓶33的進(jìn)氣 接口 II連接。
[0120] 所述數(shù)字調(diào)壓器32用于調(diào)節(jié)所述供氣源31以恒定的壓力供給所述沖壓管道pi;所 述控制器通過(guò)控制線路分別連接至所述步進(jìn)電機(jī)和微電磁閥34。
[0121] 所述微噴頭35與所述氣壓力模塊之間連接有微噴管道p2、氣壓輸送支管道p3和氣 壓輸送主管道P4;所述微噴頭35與所述沖洗瓶之間連接有微噴管道p2和沖壓管道pi，所述 微電磁閥34設(shè)置在所述沖壓管道pi上用于控制所述微噴頭35的噴樣量，所述微噴管道p2的 一端連接所述微噴頭35;所述氣壓力模塊與所述沖洗瓶之間連接有氣壓輸送主管道p4、清 洗液吸入管道P5;其中，所述微噴管道p2、沖壓管道pl、所述氣壓輸送支管道p3相臨近的端 口之間設(shè)有第一三通閥V，所述微噴管道p2、氣壓輸送支管道p3和氣壓輸送主管道p4相臨近 的端口之間設(shè)有第二三通閥U。
[0122] 具體地，所述第一三通閥V包括第一閥口 VI、第二閥口 V2、第三閥口 V3，所述第一閥 口 VI接通于所述清洗瓶的第一接口 01(所述第一閥口 VI與所述清洗瓶之間的連接管道構(gòu)成 所述沖壓管道pi)，所述第二閥口V2接通于所述微噴頭35(所述第二閥口V2與所述微噴頭35 的連接管道構(gòu)成所述微噴管道P2)，所述第三閥口 V3接通于所述氣壓輸送支管道p3的第一 端。所述第二三通閥U包括第一端口 U1、第二端口 U2、第三端口 U3，所述第一端口 U1接通于所 述氣壓輸送支管道P3的第二端(所述第二三通閥U的第一端口 U1與所述第一三通閥V的第三 閥口 V3之間的連接管道構(gòu)成所述氣壓輸送支管道p3)，所述第二端口 U2接通于所述氣壓力 模塊的第二注射器的出口（所述第二端口U2與所述氣壓力模塊之間的連接管道構(gòu)成所述 氣壓輸送主管道P4 )，所述第三端口 U3接通于所述清洗液貯存瓶33的第二接口 01 (所述第三 端口 U3與所述第二接口 01之間的連接管道構(gòu)成所述清洗液吸入管道p5)。
[0123] 當(dāng)需要從試劑槽51吸入試劑時(shí)（見(jiàn)圖4中A)，調(diào)節(jié)所述第一三通閥V、第二三通閥U 使所述微噴管道P2、氣壓輸送支管道p3和氣壓輸送主管道p4連通（即，使第一端口 U1、第二 端口 U2相連通，第二閥口 V2、第三閥口 V3相連通），所述步進(jìn)電機(jī)下拉所述活塞桿361吸入試 劑至所述微噴管道P2。
[0124] 當(dāng)噴出吸入的試劑時(shí)(見(jiàn)圖4中B)，調(diào)節(jié)所述第一三通閥V使所述微噴管道p2和所 述沖壓管道pl連通(即，使第一閥口 VI、第二閥口 V2相連通），所述數(shù)字調(diào)壓器32供給所述沖 壓管道pl壓力，所述微電磁閥34接通，并控制所述微噴頭35噴樣。
[0125] 當(dāng)清洗管路時(shí)，首先需要吸取清洗液(見(jiàn)圖4中C)，調(diào)節(jié)所述第二三通閥U使所述清 洗液吸入管道P5與所述氣壓輸送主管道p4連通（即，使），所述步進(jìn)電機(jī)下拉所述活塞桿361 使清洗液注滿所述氣壓輸送主管道P4;然后調(diào)節(jié)所述第一三通閥V、第二三通閥U使所述微 噴管道P2、氣壓輸送支管道p3和氣壓輸送主管道p4再次連通(示意圖同圖4中A)，上推所述 活塞桿361使清洗后的廢液經(jīng)所述微噴頭35排出。
[0126] 進(jìn)一步地，在吸入試劑時(shí)，所述微噴管道P2、氣壓輸送支管道p3和氣壓輸送主管道 P4連通后，采用步進(jìn)電機(jī)下拉所述活塞桿361先吸入部分空氣至所述微噴管道p2。避免在排 出試劑時(shí)，所述微電磁閥34的開(kāi)度較大時(shí)，清洗液被強(qiáng)力加壓進(jìn)所述微噴管道p2和待排出 試劑混合在一起。先吸入部分空氣，可以在排出試劑后，再將空氣排出，然后將帶入的微量 清洗液排出至廢液槽。
[0127] 本發(fā)明中，在所述微電磁閥34接通時(shí)，所述微量液體噴射系統(tǒng)3B可以實(shí)現(xiàn)懸空噴 出微量的試劑至所述反應(yīng)孔位61內(nèi)，且由于噴樣壓力較大，可以將吸取的試劑壓入第一油 性液體和第二油性液體之間，而不需要將微噴頭35插入反應(yīng)孔位61內(nèi)的輕油位置，可以避 免微噴頭35插入所述反應(yīng)孔位61內(nèi)接觸油滴，防止交叉污染，清洗簡(jiǎn)單。此外，所述微量液 體噴射系統(tǒng)3B還可對(duì)所有接觸試劑的管路進(jìn)行自動(dòng)清洗。所述微噴頭的噴射試劑的速度 可達(dá)到每秒10個(gè)以上，噴射的試劑的體積可低于O.lyL，可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量制樣。
[0128] 本實(shí)施方式中，當(dāng)吸入試劑或當(dāng)清洗管路吸入清洗液時(shí)，下拉活塞362,使所述氣 壓輸送主管道P4的管路體積變小，產(chǎn)生負(fù)壓，吸入試劑；當(dāng)清洗管路排出清洗液時(shí)，上推活 塞362,使所述氣壓輸送主管道p4的管路體積變大，產(chǎn)生正壓，排出清洗液。
[0129] 優(yōu)選地，所述微噴頭35和通過(guò)管路連接的微電磁閥34(包括微噴管道p2、部分沖壓 管道P1)固定連接在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1的抓取部件40上。
[0130] 為節(jié)省空間，其余部件(例如將清洗液貯存瓶33和供氣源31)可放置在所述高通量 測(cè)序的建庫(kù)儀的機(jī)艙外面?？梢栽谒鰴C(jī)艙的側(cè)壁設(shè)置小孔，將管路通過(guò)小孔穿出機(jī)艙。其 中，機(jī)艙將所述建庫(kù)儀的機(jī)臺(tái)100整體包圍起來(lái)，形成一腔室。
[0131]所述微量液體噴射系統(tǒng)3B可和驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1相互配合，在所述控制器的控制下由所 述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)1帶動(dòng)所述微噴頭35按照預(yù)設(shè)程序移動(dòng)位置，制備出設(shè)定的樣品陣列。
[0132] 本發(fā)明中，設(shè)置了微量試劑的兩種加樣方式，一種是第一微量注射器和第四伺服 電機(jī)相配合的低通量加樣，第二種是高通量加樣的微量液體噴射系統(tǒng)3B。第一種方式適合 于待處理的基因樣本數(shù)量較少的情況，微量液體噴射系統(tǒng)3B適用于樣本量較多的情況。適 用于單次運(yùn)行最大樣本通量為96份。第一微量注射器和第四伺服電機(jī)以可拆卸的方式連接 在所述驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)的抓取部件40上。所述微量液體噴射系統(tǒng)3B也以可拆卸的方式連接在所述 驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)的抓取部件40上。可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，切換所需要的微量加樣方式。
[0133] 本發(fā)明第二方面提供的所述建庫(kù)儀，基于微量加樣裝置、恒流栗以及可在XYZ軸運(yùn) 動(dòng)的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)而高精度地制備雙油包水的生化微反應(yīng)體系，并通過(guò)與所述生化微反應(yīng)體系 相適配的純化板對(duì)反應(yīng)后的體系進(jìn)行純化，提純得到處理后的基因樣品。可以通過(guò)所述建 庫(kù)儀完成簡(jiǎn)單的核酸擴(kuò)增以及負(fù)責(zé)的核酸文庫(kù)制備，節(jié)省一次性耗材、操作簡(jiǎn)單。
[0134] 第三方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明第一方面所述的生化微反應(yīng)體系或如本發(fā)明第 二方面所述的高通量測(cè)序的建庫(kù)儀在制備測(cè)序的核酸文庫(kù)和核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
[0135] 應(yīng)用案例1:普通DNA樣品的高通量文庫(kù)制備
[0136] 采用圖1所示的建庫(kù)儀，以12周孕婦血漿cfDNA樣本作為基因樣品，使用Life公司 Ion Plus Fragment Library Kit試劑盒制備高通量測(cè)序文庫(kù)，具體操作流程如下：
[0137] (1)末端修復(fù)，建立生化微反應(yīng)體系1:
[0138] 采用恒流栗5依次吸取第一油性液體、第二油性液體至反應(yīng)孔板6的反應(yīng)孔位61 內(nèi)，所述反應(yīng)孔板6為PCR儀的溫控腔體，其中，第一油性液體(重油)具體為氟代烴油FC-40， 取15此，第二油性液體(輕油）為苯甲基聚硅氧烷PD5和聚山梨酯添加劑（司盤80)的混合溶 液，其中，司盤80的體積為PD5體積的5%，第二油性液體的總體積為40yL，油性液體加入時(shí) 沿管壁輕柔加入，避免產(chǎn)生氣泡；
[0139] 使用微量加樣裝置依次將如下試劑注入反應(yīng)孔板6中，形成雙油包水的生化微反 應(yīng)體系1:
[0141] ^通過(guò)控制器來(lái)設(shè)置溫度使上述生化微反應(yīng)體系1在20°C下反應(yīng)30min，其中，可先 將DNA注入兩種油性液體中，可把其他試劑先混合后再注入反應(yīng)孔板中。
[0142] (2)末端修復(fù)后純化：
[0143] 向反應(yīng)孔位內(nèi)注入Beckman公司AMpure XP磁珠2.7此(水系體積的1.8倍），靜置 lOmin，然后采用恒流栗將反應(yīng)孔位內(nèi)的液體吸入純化板中毛細(xì)管道的磁力區(qū)進(jìn)行富集，富 集5min之后，然后采用恒流栗吸入磁珠清洗液(75 %酒精)20yL，靜置lmin，重復(fù)1次，以清洗 掉磁珠表面粘附的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再繼續(xù)采用恒流栗吸入洗脫液(具體為3yL的TE緩沖液） 至每個(gè)毛細(xì)管道的磁力區(qū)，移除磁鐵使DNA充分溶解到洗脫液中，靜置5min后，再使用磁鐵 放置回毛細(xì)管道構(gòu)成磁力區(qū)以富集磁珠成分，采用恒流栗排出洗脫后的液體，得到3yL末端 修復(fù)的DNA樣品的TE溶液。
[0144] (3)Adapter連接(接頭連接），建立生化微反應(yīng)體系2:
[0145] 采用恒流栗依次吸取15yL的上述第一油性液體、40yL的第二油性液體至反應(yīng)孔板 6的反應(yīng)孔位61內(nèi)；使用微量加樣裝置將上述3yL的末端修復(fù)的DNA樣品注入注入反應(yīng)孔板6 內(nèi)，然后再將如下試劑（同時(shí)含有了加標(biāo)簽序列)也注入反應(yīng)孔板6內(nèi)，建立生化微反應(yīng)體系 2：
[0147] 通過(guò)控制器來(lái)設(shè)置溫度使上述生化微反應(yīng)體系2在20°C下反應(yīng)30min，
[0148] (4)接頭連接后純化：
[0149] 純化操作同上述步驟(2)，不同之處在于加入的AMpure XP磁珠體積為上述生化微 反應(yīng)體系2中水系試劑（1.7+3)的1.5倍，即7yL，用3yL的TE緩沖液來(lái)洗脫，純化后得到3yL接 頭連接的DNA樣品的TE溶液。
[0150] (5)PCR反應(yīng)，建立生化微反應(yīng)體系3:
[0151] 采用恒流栗依次吸取15yL的上述第一油性液體、40yL的第二油性液體至反應(yīng)孔板 6的反應(yīng)孔位61內(nèi)；使用微量加樣裝置將上述3yL的接頭連接的DNA樣品注入注入反應(yīng)孔板6 內(nèi)，然后再將如下試劑也注入反應(yīng)孔板6內(nèi)，建立生化微反應(yīng)體系3:
[0153] 隨后將上述體系3按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)： 72 °C 20 min .95 °C 5 min
97 C 15 sec
[0154] 60 °C 15sec 70 V ! min 72： C 5mm 15 C hold
[0155] (6)PCR 后純化：
[0156] 純化操作同上述步驟(2)，不同之處在于加入的AMpure XP磁珠體積為上述生化微 反應(yīng)體系3中水系試劑（1.9+3)的1倍，即5此。用3此的TE緩沖液來(lái)洗脫，收集洗脫后的基因 樣本，完成得到孕婦血漿cfDNA樣本的測(cè)序建庫(kù)。
[0157] 應(yīng)用實(shí)施例2:(適用于快速DNA樣品高通量文庫(kù)制備）
[0158] 采用圖1所示的建庫(kù)儀，以新生兒?jiǎn)位虿NA樣本作為基因樣品，采用酶切打斷 方法制備高通量測(cè)序文庫(kù)，具體操作流程如下：
[0159] (1)建立生化微反應(yīng)體系1:
[0160] 采用恒流栗5依次吸取第一油性液體、所述第二油性液體至反應(yīng)孔板6的反應(yīng)孔位 61內(nèi)，所述反應(yīng)孔板6為PCR儀的溫控腔體，其中，第一油性液體(重油)具體為氟代烴油FC-40,取15此，第二油性液體(輕油）為苯甲基聚硅氧烷TO5和聚山梨酯添加劑（司盤80)的混合 溶液，其中，司盤80的體積為TO5體積的5%，第二油性液體的總體積為40此，油性液體加入 時(shí)沿管壁輕柔加入，避免產(chǎn)生氣泡；
[0161] 打斷反應(yīng):采用圖3中的微量加樣裝置3先將1.4yL的DNA樣品（濃度為3.6ng/yL，實(shí) 驗(yàn)中DNA樣品濃度是采用Qubit BR試劑盒來(lái)測(cè)定)注入反應(yīng)孔位61內(nèi)的輕油位置，輕油會(huì)自 動(dòng)包埋水基DNA樣本，然后基于轉(zhuǎn)座酶DNA文庫(kù)試劑盒TruePr^? DNA Library Prep Kit配 制DNA打斷的水系試劑，在反應(yīng)孔位61的輕油層中依次加入tagmentation buffer 0.4ul， tagmentation enzyme 0.2ul并保證其形成雙油包水的生化微反應(yīng)體系1(水相共1.4+0.6 = 2yL)。在55°C下孵育lOmin。其中，打斷酶與緩沖液(均放置于制冷試劑槽中）單獨(dú)分批加 入反應(yīng)孔位內(nèi)，體積總和為〇.6yL;
[0162] (2)打斷后純化：
[0163] 打斷后，向反應(yīng)孔位內(nèi)注入Beckman公司AMpure XP磁珠0.9yL，靜置lOmin，然后采 用恒流栗將反應(yīng)孔位內(nèi)的液體吸入純化板中毛細(xì)管道的磁力區(qū)進(jìn)行富集，富集5min之后， 然后采用恒流栗吸入磁珠清洗液(75%酒精)20iiL，靜置lmin，重復(fù)1次，以清洗掉磁珠表面 粘附的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再繼續(xù)采用恒流栗吸入洗脫液(具體為純水5yL)至每個(gè)毛細(xì)管道的 磁力區(qū)，移除磁鐵使DNA充分溶解到洗脫液中，靜置5min后，再使用磁鐵富集磁珠成分，采用 恒流栗排出洗脫后的液體，得到包含DNA成分的回收溶液。
[0164] (3)建立生化微反應(yīng)體系2:
[0165] 將上述5yL包含DNA成分的回收溶液同上述18yL的第一油性液體、45yL的第二油性 液體再次構(gòu)建微反應(yīng)體系，然后再依次注入PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)試劑(PCR生物酶、緩沖液、 酸、堿、鹽溶液等)至反應(yīng)孔位61的輕油位置，輕油會(huì)自動(dòng)將DNA樣本與后加入的液體融合， 形成雙油包水的生化微反應(yīng)體系2,其中，PCR反應(yīng)試劑為預(yù)先混勻好，再一起加入反應(yīng)孔位 內(nèi)，PCR反應(yīng)試劑的總體積為16yL，PCR反應(yīng)體系的試劑盒是TruePrep? DNA Library Prep Kit(Vazyme#TD501-TD503)，具體由以下試劑組成：

[0168] (4)對(duì)上述生化微反應(yīng)體系2設(shè)定循環(huán)溫度完成PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，其中，具體 條件如下： 12 t： 3 mm 98 °e 30s
98 C： 10 sec
[0169] 60 °C 30sec 72 t 3 mm 72 C 3mm 15°C hold
[0170] (4)PCR 后純化：
[0171] PCR結(jié)束后的純化同上述步驟(2)，只是磁珠的加入體積為6此。收集洗脫后的基因 樣本，即得到新生兒?jiǎn)位虿NA的測(cè)序文庫(kù)。
[0172] 應(yīng)用實(shí)施例3
[0173] 以來(lái)自耳聾患者樣本的DNA作為基因樣品，基于Agenal公司Complete iPLEX? Pro Reagent Set試劑盒來(lái)進(jìn)行種高通量多重PCR質(zhì)譜分析，包括以下步驟：
[0174] 1、采用恒流栗5依次吸取第一油性液體、所述第二油性液體至反應(yīng)孔板6的反應(yīng)孔 位61內(nèi)，所述反應(yīng)孔板6為PCR儀的溫控腔體，其中，第一油性液體(重油）具體為氟代烴油 FC-40,取15此，第二油性液體（輕油）具體為苯甲基聚硅氧烷PD5和聚山梨酯添加劑（司盤 80)的混合溶液，其中，司盤80的體積為TO5體積的5%，第二油性液體的總體積為40yL;
[0175] 采用圖3中的微量加樣裝置3B先將1此的DNA樣品注入反應(yīng)孔位61內(nèi)的輕油位置， 輕油會(huì)自動(dòng)包埋水基DNA樣本;然后再依次注入Pre-PCR反應(yīng)試劑至所述反應(yīng)孔位61的輕 油位置，輕油會(huì)自動(dòng)將DNA樣本與后加入的液體融合，形成雙油包水的生化微反應(yīng)體系，其 中，被包埋的水性體系包括以下體積的各種物質(zhì)：

[0177] 2、隨后將上述體系按以下程序進(jìn)行Pre-PCR反應(yīng)：
[0178] Pre-PCR 反應(yīng)程序： 94 "C for2mins
94 °C for 20s 56〇C for 30s
[0179] 72 °C for 1 min 72 'C for 5mins 12 V forever
[0180] 3、往上述Pre-PCR反應(yīng)的微體系中加入SAP消化用試劑，SAP消化用試劑具體包括 以下：
[0182] 每個(gè)孔位中所需的SAP消化用試劑，可以是將多份所需的SAP消化用試劑先混合在 一起再采用微量加樣裝置吸取一個(gè)孔位所需量并注入反應(yīng)孔板內(nèi)（下同），然后按照以下 SAP反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
[0183] 37°C for 40mins
[0184] 85〇C for 5mins
[0185] 12°C forever
[0186] 4、向上述SAP反應(yīng)后的微體系中加入延伸反應(yīng)用試劑，具體包括以下：
[0188] 5、對(duì)上述延伸反應(yīng)后的反應(yīng)體系進(jìn)行磁珠純化：
[0189] 向反應(yīng)孔位內(nèi)注入同時(shí)注入Beckman公司AMpure XP磁珠9yL和18yL的75 %酒精作 為磁珠純化液，靜置l〇min，然后采用恒流栗將反應(yīng)孔位內(nèi)的液體吸入純化板中毛細(xì)管道的 磁力區(qū)進(jìn)行富集，富集5min之后，然后采用恒流栗吸入洗脫液(具體為純水20此的水或TE緩 沖液)至每個(gè)毛細(xì)管道的磁力區(qū)，移除磁鐵使DNA充分溶解到洗脫液中，靜置5min后，再使用 磁鐵富集磁珠成分，采用恒流栗排出洗脫后的液體，得到包含DNA成分的回收溶液，即多重 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后可進(jìn)行質(zhì)譜上樣分析。
[0190]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生化微反應(yīng)體系，用于制備測(cè)序的核酸文庫(kù)和核酸擴(kuò)增，其特征在于，所述生化 微反應(yīng)體系包括第一油性液體、第二油性液體、水基基因樣品和反應(yīng)試劑，其中，所述第一 油性液體的密度大于所述第二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑被包埋在所述第一 油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成夾心結(jié)構(gòu)，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑與所述第一油 性液體、第二油性液體均不相混溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二油性液體不互 溶。2. 如權(quán)利要求1所述的生化微反應(yīng)體系，其特征在于，所述第一油性液體的密度大于純 水密度，其密度為1.01-2. Og/cm3;所述第二油性液體的密度小于純水密度，其密度為0.09-0·99g/cm3。3. 如權(quán)利要求1所述的生化微反應(yīng)體系，其特征在于，所述基因樣品為片段化的DNA或 RNA樣品的水性溶液;所述反應(yīng)試劑包括生物酶、緩沖溶液、酸、堿和鹽溶液中的一種或多 種。4. 一種高通量測(cè)序的建庫(kù)儀，其特征在于，包括機(jī)臺(tái)以及設(shè)置在機(jī)臺(tái)上的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，所 述機(jī)臺(tái)上還設(shè)有控制器、恒流栗、純化板、試劑區(qū)和反應(yīng)孔板;所述試劑區(qū)包括多個(gè)試劑槽， 所述多個(gè)試劑槽用以盛放第一油性液體、第二油性液體、水基基因樣品、磁珠純化液、洗脫 液和多種反應(yīng)試劑;所述反應(yīng)孔板包括陣列分布的反應(yīng)孔位;所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)上連接有微量 加樣裝置和純化板，所述控制器控制所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)帶動(dòng)所述純化板和所述微量加樣裝置在 機(jī)臺(tái)內(nèi)移動(dòng)，并控制所述微量加樣裝置吸取、排出試劑;所述純化板包括純化板本體、陣列 設(shè)置在純化板本體上的管道插入孔和多個(gè)毛細(xì)管道，所述毛細(xì)管道穿過(guò)所述管道插入孔并 在所述純化板本體的上方和下方分別具有第一延伸端和第二延伸端，在靠近所述第一延伸 端處，所述純化板本體上還放置有多個(gè)磁體，形成所述毛細(xì)管道的磁力區(qū)，所述第一延伸端 與所述恒流栗管道連接;所述第二延伸端用于在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的帶動(dòng)下插入試劑槽及所述 反應(yīng)孔位內(nèi)； 所述控制器控制所述恒流栗依次吸取第一油性液體、第二油性液體并注入至所述反應(yīng) 孔位，以及控制所述微量加樣裝置吸取水基基因樣品和反應(yīng)試劑并注入至所述反應(yīng)孔位， 形成生化微反應(yīng)體系，所述生化微反應(yīng)體系為水基基因樣品和反應(yīng)試劑被包埋在所述第一 油性液體、第二油性液體之間構(gòu)成的夾心結(jié)構(gòu)，其中，所述第一油性液體的密度大于所述第 二油性液體，所述水基基因樣品和反應(yīng)試劑與所述第一油性液體、第二油性液體均不相混 溶且不發(fā)生反應(yīng)，所述第一油性液體、第二油性液體不互溶。5. 如權(quán)利要求4所述的建庫(kù)儀，其特征在于，在所述生化微反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)后，在所 述控制器的控制下，所述微量加樣裝置吸取所述磁珠純化液并注入至所述反應(yīng)孔位，所述 純化板在所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的帶動(dòng)下移動(dòng)至所述反應(yīng)孔板的上方以使所述毛細(xì)管道的第二延 伸端插入所述反應(yīng)孔位內(nèi)；在所述控制器的控制下，反應(yīng)孔位內(nèi)的液體被所述恒流栗吸取 至所述磁力區(qū)進(jìn)行基因樣本富集，并在所述富集之后，所述恒流栗吸入洗脫液至所述磁力 區(qū)進(jìn)行洗脫，并排出純化后的基因樣本。6. 如權(quán)利要求4所述的建庫(kù)儀，其特征在于，所述微量加樣裝置為微量液體噴射系統(tǒng)， 所述微量液體噴射系統(tǒng)包括供氣源、數(shù)字調(diào)壓器、清洗液貯存瓶、微電磁閥、微噴頭、氣壓力 模塊、沖壓管道、微噴管道、氣壓輸送支管道、氣壓輸送主管道、清洗液吸入管道，其中，所述 氣壓力模塊包括步進(jìn)電機(jī)、第二注射器、與所述步進(jìn)電機(jī)連接的絲桿運(yùn)動(dòng)單元，所述第二注 射器內(nèi)的活塞桿連接所述絲桿運(yùn)動(dòng)單元，所述第二注射器的出口連接有所述氣壓輸送主管 道;所述數(shù)字調(diào)壓器管道連接于所述清洗液貯存瓶與所述供氣源之間，所述數(shù)字調(diào)壓器用 于調(diào)節(jié)所述供氣源以恒定的壓力供給所述沖壓管道;所述控制器通過(guò)控制線路分別連接至 所述步進(jìn)電機(jī)和微電磁閥； 所述微噴頭與所述氣壓力模塊之間連接有微噴管道、氣壓輸送支管道和氣壓輸送主管 道;所述微噴頭與所述沖洗瓶之間連接有微噴管道和沖壓管道，所述微電磁閥設(shè)置在所述 沖壓管道上用于控制所述微噴頭的噴樣量，所述微噴管道的一端連接所述微噴頭;所述氣 壓力模塊與所述沖洗瓶之間連接有氣壓輸送主管道、清洗液吸入管道;其中，所述微噴管 道、沖壓管道、所述氣壓輸送支管道相臨近的端口之間設(shè)有第一三通閥，所述微噴管道、氣 壓輸送支管道和氣壓輸送主管道相臨近的端口之間設(shè)有第二三通閥； 當(dāng)吸入試劑時(shí)，調(diào)節(jié)所述第一三通閥、第二三通閥使所述微噴管道、氣壓輸送支管道和 氣壓輸送主管道連通，所述步進(jìn)電機(jī)下拉所述活塞桿吸入試劑至所述微噴管道；當(dāng)噴出吸 入的試劑時(shí)，調(diào)節(jié)所述第一三通閥使所述微噴管道和所述沖壓管道連通，所述數(shù)字調(diào)壓器 供給所述沖壓管道壓力，所述微電磁閥接通，并控制所述微噴頭噴樣；當(dāng)清洗管路時(shí)，調(diào)節(jié) 所述第二三通閥使所述清洗液吸入管道與所述氣壓輸送主管道連通，所述步進(jìn)電機(jī)下拉所 述活塞桿使清洗液注滿所述氣壓輸送主管道;然后調(diào)節(jié)所述第一三通閥、第二三通閥使所 述微噴管道、氣壓輸送支管道和氣壓輸送主管道再次連通，上推所述活塞桿使清洗后的廢 液經(jīng)所述微噴頭排出。7. 如權(quán)利要求4所述的建庫(kù)儀，其特征在于，所述微量加樣裝置包括第一微量注射器和 第四伺服電機(jī)，所述第一微量注射器內(nèi)的活塞螺桿連接所述第四伺服電機(jī)的輸出端，所述 第四伺服電機(jī)的輸入端與所述控制器電連接，所述第四伺服電機(jī)在所述控制器的控制下通 過(guò)活塞螺桿帶動(dòng)所述第一微量注射器吸取、排出試劑。8. 如權(quán)利要求4所述的建庫(kù)儀，其特征在于，所述磁體為永磁體或電磁鐵，所述磁體與 所述控制器之間連接有控制線路，在吸入洗脫液至所述磁力區(qū)后，所述磁體的磁力可通過(guò) 斷電控制磁力消失或?qū)⒂来判源朋w移出毛細(xì)管道的范圍外，以進(jìn)行洗脫基因樣本。9. 如權(quán)利要求4所述的建庫(kù)儀，其特征在于，所述控制器為可編程邏輯控制器，所述控 制器還配備高分辨率觸摸顯示屏幕。10. 如權(quán)利要求1所述的生化微反應(yīng)體系或如權(quán)利要求4所述的建庫(kù)儀在制備測(cè)序的核 酸文庫(kù)和核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12M1/38GK105821482SQ201610278466
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】李星軍
【申請(qǐng)人】李星軍