增強(qiáng)hpv抗原表位肽免疫原性的方法及類病毒顆粒、顆粒制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法及類 病毒顆粒、顆粒制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV)屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病 毒屬，它是一類分子量較小的無包膜的雙鏈環(huán)狀嗜上皮性DNA病毒，通過入侵生殖道鱗狀 上皮細(xì)胞以及其他組織器官的上皮細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生分化失調(diào)，引起局部上皮增生、增厚或 呈乳頭狀。
[0003] HPV基因組是雙鏈環(huán)狀DNA，以共價(jià)閉合的超螺旋結(jié)構(gòu)、開放的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、線性分 子3種形式存在，HPV基因組編碼9個(gè)開放閱讀框，分為3個(gè)功能區(qū)即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)、晚期轉(zhuǎn) 錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)又稱為E區(qū)，分別編碼El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8等8個(gè) 早期蛋白，參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等功能。晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼主要 衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。HPV衣殼是由72個(gè)L1蛋白五聚體構(gòu)成的T= 7的二十 面體結(jié)構(gòu)，因此一個(gè)病毒粒子上含有360個(gè)L1蛋白單體，L2蛋白位于L1構(gòu)成的VLP(類病 毒顆粒）上，每個(gè)病毒粒子上含有12個(gè)或者更多拷貝的L2蛋白。
[0004] HPV的L1可以在酵母菌或者昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并自我組裝成與真正病毒顆粒大小 相同的VLP，也可以與L2蛋白共組裝成VLP，VLP從形態(tài)學(xué)和抗原的熒光分析跟天然的病毒 幾乎完全相同，并表現(xiàn)出了很好的免疫原性及耐受性，免疫機(jī)體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中 和抗體，利用此方法可以生產(chǎn)HPVL1VLP疫苗。
[0005] 最為成熟的HPV疫苗是針對L1抗原設(shè)計(jì)的，代表產(chǎn)品為已獲批上市的由Merck公 司生產(chǎn)的Gardasil包括HPV6、11、16、18 的四價(jià)疫苗，和GSK的CervarixHPV16、18 二 價(jià)疫苗，此外Merck開發(fā)的9價(jià)HPV疫苗已經(jīng)完成了III期臨床研宄，結(jié)果表明，對HPV-31、 33、45、52、58引起的宮頸、陰道和外陰癌前病變的保護(hù)性大約有97%，而對HPV-6、11、16、 18的免疫應(yīng)答也不亞于Gardasil，預(yù)計(jì)9價(jià)疫苗也可以很快獲批上市。
[0006] 雖然有多篇文章報(bào)道HPV的L2具有免疫原性，可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但是 針對HPVL2的預(yù)防性疫苗的研宄進(jìn)展不大，部分原因與單獨(dú)蛋白表達(dá)HPVL2的中和表位， 不能有效激發(fā)機(jī)體的免疫原因有關(guān)。
[0007] 1999年，Kawana等首先報(bào)道在HPV16L2aal08-120存在HPV6的交叉中和表位， 該表位的合成肽免疫的鼠血清能夠同時(shí)抑制HPV16假病毒和HPV6假病毒的感染。Embers 等從體內(nèi)水平上驗(yàn)證了該交叉中和表位的合成肽能夠誘導(dǎo)中和性抗體，并抑制乳頭瘤病毒 的感染。2007年，Gambhira等發(fā)現(xiàn)HPV16L2aal7 - 36多肽免疫的鼠血清能夠中和HPV5、 HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52、HPV58 假病毒?，F(xiàn)已證實(shí)L2 存在多個(gè)交 叉中和表位，將具有交叉中和活性的肽段序列鏈接在一起，可提高L2交叉中和表位的呈遞 效率，是極具潛力的廣譜性HPV疫苗研發(fā)途徑之一，但唯一的遺憾是，純粹的肽段偶聯(lián)分子 量太小，不能有效激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法。
[0009] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于利用所述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的 方法獲得可以展示人乳頭瘤病毒抗原肽的類病毒顆粒。
[0010] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供所述類病毒顆粒的制備方法。
[0011] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供所述類病毒顆粒的應(yīng)用。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0013] 一種增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，把HPV抗原基因組裝到HBc(乙肝病毒 攜帶的蛋白，也是乙肝病毒的核心抗原）的基因上，體外表達(dá)融合蛋白，則整合之后的基因 通過外源表達(dá)使HBc形成VLP(類病毒顆粒），且所述VLP表面展示多個(gè)拷貝的HPV抗原， 得到HBc-HPVVLP。
[0014] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原基因?yàn)镠PV晚期 轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼主要衣殼蛋白L1或HPV晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼次要衣殼蛋白L2。
[0015] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原基因?yàn)镠PV晚期 轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼次要衣殼蛋白L2。
[0016] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述VLP表面表達(dá)的HPV抗原 是L1或L2的一個(gè)抗原肽，或L1或L2的多個(gè)抗原肽，或L1或L2的多個(gè)抗原肽的偶聯(lián)。
[0017] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述VLP表面表達(dá)的HPV抗原 是L2的兩個(gè)抗原肽的偶聯(lián)，所述兩個(gè)抗原肽的序列為ASATQLYKTCKQAGTCProilPKVEGKTIAD QILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPT。
[0018] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原肽完全暴露在 HBc形成的類病毒顆粒的表面，且VLP表面展示的HPV抗原肽多于一個(gè)拷貝。
[0019] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法，可以在HBc基因上插入更多的 外源基因，且不影響HBc類病毒顆粒的形成。
[0020] 上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法獲得可以表達(dá)人乳頭瘤病毒抗原肽的 類病毒顆粒，為HBc-L2融合蛋白，具有序列表中〈400>8所示的序列，即實(shí)施例中表1中的 全基因組序列。
[0021] 優(yōu)選的，上述增強(qiáng)HPV抗原表位肽免疫原性的方法獲得可以展示人乳頭瘤病毒抗 原肽的類病毒顆粒，所述HBC-L2融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)后可自組裝 VLP〇
[0022] 上述類病毒顆粒的表達(dá)載體構(gòu)建方法，具體步驟為：
[0023] (1)克隆載體轉(zhuǎn)化DH5a，挑取單克隆，接種于5mlLB培養(yǎng)基中，37°C200rpm過夜 培養(yǎng)；
[0024] (2)按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒提取效 果；
[0025] (3)BamHI和Ndel雙酶切克隆載體上的目標(biāo)基因；
[0026] (4)按照膠回收試劑盒說明書回收目標(biāo)基因；
[0027] (5)將回收的目標(biāo)基因和經(jīng)BamHI和Ndel雙酶切后的表達(dá)載體質(zhì)粒pET9a通過連 接酶進(jìn)行連接，16 °C過夜；
[0028](6)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，繼而將陽性克隆接種LB 培養(yǎng)基后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；
[0029] (7)陽性菌種擴(kuò)增保存。
[0030] 所述步驟（1)所述克隆載體由lifetechnology公司構(gòu)建，外包公司合成目標(biāo)基 因（_包括兩端的BamHI和Ndel酶切位點(diǎn)）并連接T載體構(gòu)成克隆載體。
[0031] 優(yōu)選的，上述類病毒顆粒的制備方法，所述HBc-HPVVLP的表達(dá)和純化的具體步驟 為：
[0032]I、表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟為：
[0033] (1)菌種復(fù)蘇：將10ul凍存菌液接種到50mlLB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm搖菌過 夜；
[0034] (2)菌種擴(kuò)增：以5ml復(fù)蘇菌液接種lOOmlLB培養(yǎng)基的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，2L三角瓶中 加入 1L的LB培養(yǎng)基，37°C250rpm搖菌至 0D600 = 0? 60. 7 ；
[0035] (3)誘導(dǎo)表達(dá)：加入IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，其中誘導(dǎo)條件為ImMIPTG，25°C低溫 誘導(dǎo)；
[0036] (4)菌體收獲：誘導(dǎo)4h后，誘導(dǎo)結(jié)束，8000rpm離心10min，收集菌體沉淀；
[0037] (5)超聲破碎：菌體用 400mLTGEbuffer(50mMTris，0. 5mMEDTA，50mMNacl，5% 甘油）重懸，冰浴超聲破碎，鏡檢確保菌體完全破碎；
[0038] II、純化的實(shí)驗(yàn)步驟為：
[0039] (1)蛋白收集：超聲破碎后，8000rpm離心10min，收集上清；
[0040] (2)蛋白沉淀：蛋白上清在磁力攪拌狀態(tài)下緩慢加入（NH4)2S04粉末，終濃度為 10%w/v，待所有粉末溶解后將燒杯置于4°C靜置2h;
[0041] (3)離心收集沉淀，計(jì)算沉淀重量，以每lg沉淀用60mLbuffer的比例以TGE buffer重懸溶解；
[0042] (4)重懸液再次離心，收集上清，過0. 22ym濾膜；
[0043] (5)膜包洗滌：100KDa的膜包反復(fù)洗濾，其目的是除去小分子量蛋白質(zhì)，同時(shí)濃縮 重懸液體