專利名稱：：一種改良的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是涉及一種改良的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法。
背景技術(shù)：
：免疫檢測(cè)是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)的方法。在臨床檢驗(yàn)中主要通過(guò)抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。根據(jù)檢測(cè)原理的不同，免疫檢測(cè)可以分為間接法、夾心法(包括雙抗原夾心法和雙抗體夾心法)、捕獲法、競(jìng)爭(zhēng)法等。雙抗原夾心法屬于夾心法的一種，廣泛應(yīng)用于免疫檢測(cè)領(lǐng)域。其基本原理是用特異性抗原進(jìn)行包被和制備標(biāo)記結(jié)合物，通過(guò)兩次免疫結(jié)合，形成包被抗原-抗體-標(biāo)記抗原復(fù)合物，完成待測(cè)抗體的檢測(cè)。根據(jù)抗原標(biāo)記物及檢測(cè)技術(shù)的不同，雙抗原夾心法又可進(jìn)一步具體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫(ELISA)、快速診斷(包括基于膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠等的快速診斷)、放射免疫、熒光免疫等檢測(cè)中。酶聯(lián)免疫的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。雙抗原夾心ELISA法，是雙抗原夾心免疫檢測(cè)法在ELISA檢測(cè)上面的一個(gè)具體應(yīng)用。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本中的抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方式使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)3物的量與標(biāo)本中受檢抗體的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。故雙抗原夾心ELISA法廣泛應(yīng)用于傳染病等項(xiàng)目的抗體檢測(cè)，具有靈敏度高，特異性好的特點(diǎn)?？焖僭\斷檢測(cè)采用膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠等標(biāo)記物，利用此類標(biāo)記物可以牢固吸附在抗原/抗體的表面而不影響抗原/抗體的活性，當(dāng)標(biāo)記抗體/抗原與待測(cè)標(biāo)本中的抗原/抗體反應(yīng)聚集到一定濃度時(shí)，可以直接呈現(xiàn)顏色，從而達(dá)到快速診斷的效果。快速診斷檢測(cè)又可進(jìn)一歩具體為斑點(diǎn)滲濾法，免疫層析法等。免疫層析法是上世紀(jì)九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體/抗原先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體/抗原的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原/抗體即與該抗體/抗原發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。雙抗原夾心免疫層析法，是雙抗原夾心免疫檢測(cè)法在免疫層析檢測(cè)上面的一個(gè)具體應(yīng)用，此方法檢測(cè)待測(cè)樣品中的目標(biāo)抗體，具有迅速便捷的優(yōu)勢(shì)。化學(xué)發(fā)光免疫觀lj定(Chemiluminescentimmunoassay,CLIA)是將抗原與抗體特異性反應(yīng)與敏感性的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。放射免疫測(cè)定法將放射性的靈敏度與免疫的特異度相結(jié)合，既簡(jiǎn)便準(zhǔn)確又靈敏可靠。雙抗原夾心法均可具體應(yīng)用于這兩種檢測(cè)方法。但是，雙抗原夾心法在具體實(shí)施時(shí)，常常會(huì)由于試劑、材料、環(huán)境等因素，特別是待測(cè)樣品中的一些干擾性物質(zhì)會(huì)引起非特異性結(jié)合，導(dǎo)致有一定程度的假陽(yáng)性，影響了檢測(cè)結(jié)果的可信度。常規(guī)的處理方法就是調(diào)低包被或者標(biāo)記抗原的用量，提高抗原純度，嚴(yán)格控制雙抗原夾心法試劑盒材料的質(zhì)量等方面去緩解。但是調(diào)低包被或者標(biāo)記抗原的用量勢(shì)必會(huì)降低檢測(cè)的靈敏度，提高抗原純度也不可能使抗原純度達(dá)到百分之百，試劑盒材料的質(zhì)量也不是自己可以隨意可調(diào)控的因素。因此雙抗原夾心法檢測(cè)目4的抗體時(shí)，背景過(guò)高以及假陽(yáng)率高始終是一個(gè)難以解決的問(wèn)題。為此，必須尋求一種方法來(lái)降低雙抗原夾心法的背景和假陽(yáng)率，提高檢測(cè)的特異性。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明的目的就是為了提供一種改良的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，降低檢測(cè)的背景和假陽(yáng)率，提高檢測(cè)的特異性。技術(shù)方案在雙抗原夾心法檢測(cè)樣品時(shí)，有多種因素可能導(dǎo)致假陽(yáng)，包括操作員，待測(cè)樣品本身含有的干擾性物質(zhì)，試劑盒所采用的抗原抗體以及其它輔料等等因素。在這些因素當(dāng)中，檢測(cè)中由于樣品含有的干擾性物質(zhì)的非特異性結(jié)合是引起假陽(yáng)的重要因素。非特異性結(jié)合的是指在待測(cè)樣品中除待測(cè)抗體以外的其他物質(zhì)與包被抗原或者檢測(cè)系統(tǒng)中的固相支持物結(jié)合，使得檢測(cè)結(jié)果為假陽(yáng)。為了減少和降低這種非特異性結(jié)合，本發(fā)明將抗人IgG加入到檢測(cè)體系中，利用抗人IgG的非特異性結(jié)合特性，使其與待測(cè)樣品中的其他蛋白或者抗體產(chǎn)生非特異性的結(jié)合，由于這種結(jié)合將對(duì)兩者的空間構(gòu)象產(chǎn)生影響，增大了非待測(cè)抗體與包被抗原或者標(biāo)記抗原產(chǎn)生非特異性結(jié)合的空間位阻，降低了結(jié)合的幾率，從而降低了由于非特異性結(jié)合的干擾帶來(lái)的假陽(yáng)。而對(duì)于待測(cè)抗體，由于抗原抗體間的結(jié)合是特異性的，抗人IgG即使結(jié)合到待測(cè)抗體上，對(duì)靈敏度的影響不大(可參看實(shí)施例中的具體試驗(yàn)數(shù)據(jù))。進(jìn)一步具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明將抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體，以合適的使用比例加入到雙抗原夾心法檢測(cè)的反應(yīng)體系之中，例如將抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體加入到ELISA檢測(cè)法的樣品稀釋液、免疫層析檢測(cè)法的加樣墊或者標(biāo)記物墊上，按照免疫層析試劑盒的一般結(jié)構(gòu)組裝成雙抗原夾心法檢測(cè)試劑盒。因此，本發(fā)明提供一種改良的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，此方法在雙抗原夾心法的反應(yīng)體系中加有抗人IgG抗體。通過(guò)抗人IgG在檢測(cè)體系中的作用，尤其是抗人IgG抗體與檢測(cè)體系中各種成分的復(fù)合作用的綜合影響，達(dá)到最終降低假陽(yáng)的效果。本發(fā)明中利用的抗人IgG經(jīng)驗(yàn)證可以是單克隆抗體，多克隆抗體。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明了抗人IgG在雙抗原夾心法中具有普遍適應(yīng)性。本發(fā)明可以應(yīng)用于酶聯(lián)免疫法、快速檢測(cè)法、放射免疫檢測(cè)法、熒光免疫檢測(cè)法等，相應(yīng)的，其標(biāo)記物可以是酶、膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)。更進(jìn)一歩，本發(fā)明公開了該方法在快速診斷檢測(cè)中的應(yīng)用?？蓪⒖谷薎gG抗體加入加樣墊或標(biāo)記物墊。相應(yīng)的，本發(fā)明公開了上述方法制備的快速診斷檢測(cè)試劑盒，由PVC底板、加樣墊、標(biāo)記物墊、NC膜、吸水紙、對(duì)照線和檢測(cè)線組成，在加樣墊或者標(biāo)記物墊中含有抗人IgG抗體。此外，本發(fā)明還公開了該方法在酶聯(lián)免疫檢測(cè)上的應(yīng)用，具體可將抗人工gG抗體加入樣品稀釋液中。相應(yīng)的，本發(fā)明公開了上述方法制備的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，由多孔板、樣品稀釋液、酶結(jié)合物稀釋液、顯色液組成，在樣品稀釋液中加有抗人IgG抗體。實(shí)施例的數(shù)據(jù)證明了抗人IgG在雙抗原夾心法的應(yīng)用可以在不影響檢測(cè)靈敏度的條件下，降低檢測(cè)系統(tǒng)中由非特異性結(jié)合干擾所帶來(lái)的假陽(yáng)，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確度。本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案，將在以下的實(shí)施例中進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例以雙抗原夾心法檢測(cè)丙型肝炎病毒(H印atitisCVirus,HCV)抗體和梅毒螺旋體(Tr印onemaPallidum,TP)抗體為例詳細(xì)闡述，對(duì)于其它項(xiàng)目的雙抗原夾心法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以以此類推。需要說(shuō)明的是，在現(xiàn)有技術(shù)中，采用捕獲法測(cè)定特異IgM時(shí)，也有人在樣品稀釋液中加入抗人IgG抗體。之所以加入抗人IgG抗體，是因?yàn)闃悠分械腎gG抗體會(huì)跟待測(cè)IgM抗體競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗原標(biāo)記物，導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度降低；加入抗人IgG抗體，會(huì)減少這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，保證了IgM檢測(cè)的靈敏度。所以說(shuō)，這項(xiàng)現(xiàn)有技術(shù)，和本發(fā)明的技術(shù)是有很大區(qū)別的。發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過(guò)引入抗人IgG實(shí)現(xiàn)了對(duì)雙抗原夾心法的改良，在現(xiàn)有技術(shù)的靈敏度條件下，大大降低了檢測(cè)的背景和假陽(yáng)率，提高了檢測(cè)的特異性。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻(xiàn)(薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯，等.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京科學(xué)出版社，1992)中所述的條件，或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法進(jìn)行，在此不必贅述。實(shí)施例1加樣墊加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標(biāo)試紙條1.1HCV包被抗原的制備PCR擴(kuò)增丙型肝炎病毒基因NS3部分如SEQIDNO.1所對(duì)應(yīng)的DNA區(qū)段(屬于NS3蛋白的一部分)，其上游引物如SEQIDN0.2所示，帶有BamHI位點(diǎn)，下游引物如SEQIDN0.3所示，帶有HindIII位點(diǎn)。PCR的片段經(jīng)回收之后，用BamHI和HindIII酶切，連接到用BamHI和HindIII酶切之后的PQE30載體(Qiagen公司)中，得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒PQE30-NS3。將質(zhì)粒PQE30-NS3轉(zhuǎn)化ER2566菌(美國(guó)NewEnglandBiolabs公司)，用500ml含lOOug/ml氨芐西林鈉(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，貨號(hào)A0339)的LB培養(yǎng)基37t:振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，貨號(hào)IB0168)，37。C誘導(dǎo)4小時(shí)。74°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，ImMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，部分目的蛋白分布在包涵體。包涵體用含2%TritonX_100(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，貨號(hào)T0694)的溶液I(20mMTirs-HCl，pH8.5，5mMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲，4°C12000rpm離心20分鐘收集包涵體，用溶液I配制的4M尿素溶解后，對(duì)100倍體積的PB緩沖液(pH7.0,20mM)透析，換液3次，4°C12000rpm離心20分鐘去除沉淀后制成粗抗原，用同一PB緩沖液平衡S印hacrylS_200凝膠柱(美國(guó)AmershamBiosciences公司)后將上述粗抗原過(guò)柱，收集合并含目的蛋白的溶液，用平衡緩沖液(10mMNa2HPO"1.8mMKH2P04，140mMNaCl，2.7mMKC1，25mM咪唑(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)15513)，pH8.0)充分透析。用10倍柱床體積的平衡緩沖液平衡Ni-NTA親和柱(Qiagen公司，貨號(hào)30210)之后，加入透析之后的蛋白樣，用10倍介質(zhì)體積的平衡緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，再用5倍體積洗脫緩沖液(20mMNa2HP04，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)，洗脫目的蛋白，再用PB緩沖液透析，去除咪唑，測(cè)定蛋白濃度，蛋白命名為PQE-NS3，此為本發(fā)明的包被抗原。1.2HCV標(biāo)記抗原的制備將上述經(jīng)過(guò)BamHI和HindIII酶切之后的NS3片段連接到經(jīng)過(guò)BamHI和HindlII酶切之后的PET-30a載體(Novagen公司，貨號(hào)69909-3)中，得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒PET30a-NS3轉(zhuǎn)化ER2566菌，用500ml含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，貨號(hào)KB0286)的LB培養(yǎng)基37。C振蕩培養(yǎng)至0D60(^1.0左右，用終濃度為O.5mM的IPTG，37。C誘導(dǎo)4小時(shí)。4°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，部分目的蛋白分布在裂解液包涵體。后續(xù)純化步驟和PQE-NS3—樣，純化得到的蛋白命名為30a-NS3，此為本發(fā)明的標(biāo)記抗原。81.3膠體金的制備在三角燒瓶中加入100ml超純水，磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入lml1%氯金酸(Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)16961-25-4)溶液，沸騰后立刻加入lml1%檸檬酸三鈉(Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)6132-04-3)水溶液，繼續(xù)沸騰10分鐘，然后自然冷卻即可。1.4HCV抗原-膠體金標(biāo)記物的制備取10ml上述膠體金放入燒杯中，攪拌中加入150ul的0.2MK^03調(diào)節(jié)pH至7.0，繼續(xù)攪拌30秒；加入150-300ug的HCV標(biāo)記抗原30a-NS3，繼續(xù)攪拌10分鐘；加入O.lml10%BSA，繼續(xù)攪拌5分鐘；5000g離心10分鐘，吸出上清，將沉淀收集至一合適容器；對(duì)上清再用10000g離心15分鐘，重復(fù)第一次離心的操作；對(duì)上清再用12000g離心30分鐘，棄掉上清，將三次離心的沉淀收集到同一離心管中，用膠體金稀釋液(20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，0.l%TritonX-100，2%Sucrose，0.01%Proclin300)定容至lml充分混勻后放-4'C保存。1.5試紙條的組裝將上述金標(biāo)復(fù)合物用膠體金稀釋液10倍稀釋后以0.45u1/腿2加到標(biāo)記物墊上，_50°0真空冷凍干燥5&后于41:存放，即制成標(biāo)記物墊。鼠抗人IgG多克隆抗體，采用一般實(shí)驗(yàn)室的制備方法，在此并無(wú)特別之處，所以不需要贅述。將鼠抗人IgG多克隆抗體用PBS緩沖液稀釋到0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4,0、5.0、8.0、10.Omg/ml，分別浸泡玻璃纖維(Watman公司)，-5(TC真空冷凍干燥6h后于4。C存放，作為加樣墊。沒有加鼠抗人IgG多克隆抗體的PBS作為對(duì)照。用檢測(cè)線稀釋液(lOmMPBS+2。/。蔗糖)稀釋HCV包被抗原PQE-NS3以及對(duì)照線抗體到工作濃度，分別為2.Omg/ml和1.Omg/ml，隨后用點(diǎn)膜儀(噴液量均為0.05ul/匪，噴液速度為70ml/S)分別包被在硝酸纖維素膜(Millipore公司，貨號(hào)HF135002)上，形成間隔0.5cm的測(cè)試線(T線)和質(zhì)控線(C線)，室溫晾干。將h述標(biāo)記物墊、包被好的硝酸纖維素膜以及吸水紙、PVC底板、加樣墊等輔料組裝成HCV金標(biāo)雙抗原夾心法檢測(cè)試紙條。1.6試紙條的檢測(cè)方法加100ul待測(cè)樣品(例如饑清)到加樣墊處，室溫放置20分鐘之后，判定結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下①僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)無(wú)條帶出現(xiàn)，為陰性(-);②有兩條條帶出現(xiàn)，其中一條位于質(zhì)控區(qū)，另一條位于測(cè)試區(qū)，表示陽(yáng)性(十)；③質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)條帶，表明不正確的操作過(guò)程或試紙條己變質(zhì)損壞。在此情況下，應(yīng)用新的試紙條重新測(cè)試。1.7檢測(cè)結(jié)果選用經(jīng)過(guò)RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗(yàn)證過(guò)的100份HCV陽(yáng)性血清和3000份陰性血清，同時(shí)用本發(fā)明加樣墊用鼠抗人IgG多克隆抗體預(yù)處理之后的HCV金標(biāo)雙抗原夾心法檢測(cè)試紙條，以及本發(fā)明的對(duì)照試紙條來(lái)檢測(cè)，得到了表l的結(jié)果。表1:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條假陽(yáng)性評(píng)價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>對(duì)于100份陽(yáng)性血清，本發(fā)明試紙條和對(duì)照試紙條都全部檢出，且信號(hào)強(qiáng)度差別不大。對(duì)于3000份陰性血清，對(duì)照試紙條有77份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為2.57%，在3.0mg/ml的鼠抗人IgG多克隆抗體處理之后的加樣墊制備的試紙條有17份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為0.57%，二者有顯著差異。我們將100份經(jīng)過(guò)RIBA2.0驗(yàn)證過(guò)的HCV陽(yáng)性標(biāo)本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對(duì)照，考察不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度，得到的結(jié)果如表2所示。表2:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度情況鼠抗人IgG多克隆抗體的濃度(mg/ml)PBS對(duì)照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0標(biāo)本稀釋倍數(shù)ioo份標(biāo)本中檢出陽(yáng)性數(shù)110010010010010010010010010010099982510010010010010010010010010099958950999999999998989897959176100979797979796969693928361200848383818079787874716549從表2可以看出，抗人IgG的濃度越高，對(duì)靈敏度的影響越大，在8.0和10.0mg/ml時(shí)，原倍的標(biāo)本也有漏檢，說(shuō)明，并不是抗人IgG的使用濃度越高，效果越好。綜合表1和表2的結(jié)果，為了同時(shí)保證試紙條有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發(fā)明的加樣墊上鼠抗人IgG多克隆抗體的使用濃度是0.055.Omg/ml，優(yōu)選為0.54.Omg/ml，更優(yōu)選為2.03.Omg/ml。實(shí)施例2標(biāo)記物墊加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標(biāo)試紙條分別參見實(shí)施例l.l、1.2、1.3、1.4制備HCV包被抗原、HCV標(biāo)記抗原、膠體金以及標(biāo)記抗原-膠體金復(fù)合物。2.5試紙條的組裝將鼠抗人IgG多克隆抗體用PBS緩沖液稀釋到0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3,0、4.0、5.0、8.0、10.Omg/ml，分別浸泡玻璃纖維(Watman公司)，-5(TC真空冷凍干燥6h后于4r存。沒有加鼠抗人IgG多克隆抗體的PBS作為對(duì)照。將標(biāo)記抗原-膠體金復(fù)合物用膠體金稀釋液10倍稀釋后以丄/irrf加到上述加有鼠抗人IgG多克隆抗體處理之后的玻璃纖維上，-5(TC真空冷凍干燥5h后于4'C存放，即制成標(biāo)記物墊。用檢測(cè)線稀釋液(10mMPBS+2》〕蔗糖)稀釋HCV包被抗原PQE-NS3以及對(duì)照線抗體到工作濃度，分別為2.Omg/ml和1.OmgZml，隨后用點(diǎn)膜儀(噴液量均為0.05ul/mm，噴液速度為70ml/S)分別包被在硝酸纖維素膜(Millipore公司,貨號(hào)HF135002)上，形成間隔0.5cm的測(cè)試線(T線)和質(zhì)控線(C線)，室溫晾十。將上述標(biāo)記物墊、包被好的硝酸纖維素膜以及吸水紙、PVC底板、加樣墊等輔料組裝成HCV金標(biāo)雙抗原夾心法檢測(cè)試紙條。2.6試紙條的檢測(cè)方法參見實(shí)施例1.6進(jìn)行檢測(cè)。2.7檢測(cè)結(jié)果選用經(jīng)過(guò)RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗(yàn)證過(guò)的100份HCV陽(yáng)性血清和3000份陰性血清，同時(shí)用本發(fā)明加樣墊預(yù)處理之后的HCV金標(biāo)雙抗原夾心法檢測(cè)試紙條，以及本發(fā)明的對(duì)照試紙條來(lái)檢測(cè)，得到了表3的結(jié)果。表3:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條假陽(yáng)性評(píng)價(jià)鼠抗人IgG多克RIBAPBS對(duì)照隆抗體的濃度2.0對(duì)照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0(mg/ml)陽(yáng)性檢出份數(shù)1001001001001001001001001001001009898檢出率(%)1001001001001001001001001001001009898假陽(yáng)檢出份數(shù)0773431282423211920202120假陽(yáng)率02.571.131.030.930.800.770.70C.630.670.670.700.67對(duì)于100份陽(yáng)性血清，本發(fā)明試紙條和對(duì)照試紙條都全部檢出，且信12號(hào)強(qiáng)度差別不大。對(duì)于3000份陰性血清，對(duì)照試紙條有77份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為2.57%,在3.0mg/ml的鼠抗人IgG多克隆抗體處理之后的加樣墊制備的試紙條有19份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為0.63%，二者有顯著差異。我們將100份經(jīng)過(guò)RIBA2.0驗(yàn)證過(guò)的HCV陽(yáng)性標(biāo)本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對(duì)照，考察不同濃度的鼠抗人工gG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度，得到的結(jié)果如表4所示。表4:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度情況鼠抗人IgG多克隆抗體的濃度(mg/ml)PBS對(duì)照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0標(biāo)本稀釋倍數(shù)ioo份標(biāo)本中檢出陽(yáng)性數(shù)110010010010010010010010010010098972510010010010010010010010010099948750999999999998989797%90741009797979796%%9593918362200848484848281797874716651從表4可以看出，鼠抗人IgG多克隆抗體的濃度越高，對(duì)靈敏度的影響越大，在8.0和10.0mg/ml時(shí)，原倍的標(biāo)本也有漏檢，說(shuō)明，并不是鼠抗人IgG多克隆抗體的使用濃度越高，效果越好。綜合表3和表4的結(jié)果，為了同時(shí)保證試紙條有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發(fā)明的加樣墊上鼠抗人IgG多克隆抗體的使用濃度是0.055.0mg/ml，優(yōu)選為0.54.Omg/ml，更優(yōu)選為2.03.Omg/ml。實(shí)施例3加樣墊或者標(biāo)記物墊加有抗人IgG單克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標(biāo)試紙條參見實(shí)施例1、2，制備加樣墊或者標(biāo)記物墊加有抗人IgG單克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標(biāo)試紙條，最后得到了跟實(shí)施例1.7和2.7類似的結(jié)果，這說(shuō)明，在加樣墊或者標(biāo)記物墊加入抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體都可以提高金標(biāo)試紙條檢測(cè)的特異性。實(shí)施例4樣品稀釋液加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法ELISA13試劑盒分別參見實(shí)施例1.1、1.2制備HCV包被抗原、HCV標(biāo)記抗原。4.3HCV標(biāo)記抗原-HRP標(biāo)記物的制備HCV標(biāo)記抗原和服P的偶聯(lián)采用Nal04氧化法。稱取10mg辣根過(guò)氧化物酶(HRP，美國(guó)SIGMA公司，貨號(hào)P8375)溶解于lml超純水中，再緩慢滴加lml超純水新鮮配制的5mg/mlNaI04(生工，貨號(hào)ST1244)溶液，室溫下避光輕柔攪拌40分鐘后加入20%乙二醇(生工，貨號(hào)E0582)溶液0.05ml，室溫下避光攪拌40分鐘。然后立即加入事先對(duì)100mM，pH9.51碳酸鹽緩沖液透析2小時(shí)，2.5mg/ml的純化好的30a_NS3抗原lml，4。C避光對(duì)100mM，pH9.51碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜。次日，向混合物中滴加0.lml新鮮配制的4mg/mlNaBH4(生工，貨號(hào)ST1268)溶液，混勻，4。C靜置2小時(shí)。將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)PBS緩沖液(150mM，pH7.4)透析，4。C過(guò)夜。加入酶保護(hù)劑及終濃度50。/。的甘油混勻后-2(TC避光保存?zhèn)溆?，此?biāo)記物下文稱為30a-NS3-HRP。4.4試劑盒的檢測(cè)方法將PQE30-NS3抗原以一定比例用碳酸鹽緩沖液(50mM，pH9.51)稀釋，100ul/孔加入酶標(biāo)板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司輻照酶標(biāo)板)，4。C包被24小時(shí)，次日用PBST(10mMPB，150raMNaCl，0.05%Tween-20，pH7.4)洗滌液洗板二次，拍干，120ul/孔加入含30%新生牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，8%蔗糖，5%。酪蛋白(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)C-8645)，150mMNaCl的pH7.4，lOmMPB封閉液，37。C封閉2小時(shí)，甩掉孔內(nèi)液體，拍干，置室溫20-25°C、濕度55%-65%、有通風(fēng)設(shè)備的房間內(nèi)風(fēng)干。封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。在包被酶標(biāo)板中每孔加入100ul樣品稀釋液(配方PH7.4PB，0.15MNaCl，20%NBS，0.5%明膠，1%Tween-20，0.04。％TtitonX-100，0.1%巰基乙醇，預(yù)先以1:10000，1:5000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50的稀釋比例加入抗人IgG多克隆抗體，設(shè)陰性對(duì)照14樣品稀釋液，不加抗人IgG多克隆抗體)，50Ul待測(cè)樣品、陰性參照樣品(正常人陰性血清)、陽(yáng)性參照樣品(HIV抗體陽(yáng)性血清)對(duì)照，37'C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干。再100ul/孔加入含有20。/。新生牛血清，以一定比例稀釋的30a-NS3-HRP綴合物的pH7.4的20mMPB緩沖液，37°C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干。每孔加入含0.5%。過(guò)氧化氫尿素(生工，貨號(hào)UB1753)、4.76%。三水合乙酸鈉、0.9。；冰醋酸的顯色劑A及含0.32。；TMB(生工，貨號(hào)TB0514)、5mM檸檬酸、0.5mMEDTA-2Na、5。/。甲醇、2^。二甲基甲酰胺的顯色劑B各50ul，37'C避光顯色10分鐘。每孔加50ul，含2M硫酸的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng)630nm)空白孔校零后讀取OD值。截值(CutoffValue(COV))計(jì)算COV二陰性對(duì)照平均OD值X2.0(陰性對(duì)照OD值低于0.075按0.075計(jì)算，高于0.075按實(shí)際OD值計(jì)算)，待測(cè)樣品OD值》COV為陽(yáng)性，待測(cè)樣品OD值〈COV為陰性。4.5檢測(cè)結(jié)果選用經(jīng)過(guò)RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗(yàn)證過(guò)的100份HCV陽(yáng)性血清和3000份陰性血清，同時(shí)用本發(fā)明的樣品稀釋液加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法ELISA試劑盒，以及本發(fā)明的對(duì)照試紙條來(lái)檢測(cè)，得到了表5的結(jié)果。表5:不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試劑盒假陽(yáng)性評(píng)價(jià)樣品稀釋液中抗人IgG多克隆抗體的稀釋比例RIBA2.0對(duì)照樣品稀釋液無(wú)抗人IgG多克隆抗體1000050002000100050020010050陽(yáng)性檢出份數(shù)檢出率(%)假陽(yáng)檢出份數(shù)100100100100211001001001001009998971001001001001009998971913814假陽(yáng)率(%)0.700.630.430.270.170.230.270.300.47對(duì)于100份陽(yáng)性血清，本發(fā)明試劑盒在1:10000到1:500區(qū)間抗人IgG多克隆抗體處理?xiàng)l件下和對(duì)照試劑盒都全部檢出，在l:200以及更高濃度抗人IgG多克隆抗體處理?xiàng)l件下，有漏檢。對(duì)于3000份陰性血清，對(duì)照試劑盒有21份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為0.70%，在本發(fā)明的試劑盒最好條件下，1:1000的抗人IgG處理?xiàng)l件下的試劑盒有5份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為O.17%，二者有顯著差異。我們將100份經(jīng)過(guò)RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗(yàn)證過(guò)的HIV陽(yáng)性標(biāo)本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對(duì)照，考察不同濃度的抗人IgG多克隆抗體加入樣品稀釋液之后制備的試劑盒靈敏度，得到的結(jié)果如表6所示。表6:不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試劑盒靈敏度情況<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果顯示，抗人IgG多克隆抗體在l:10000至l:500的使用比例范圍內(nèi)，對(duì)試劑盒的靈敏度影響不大。綜合表5和表6的結(jié)果，為了同時(shí)保證試劑盒有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發(fā)明的試劑盒樣品稀釋液里抗人IgG多克隆抗體的使用比例是l:2000到l:500，最優(yōu)選為l:1000。本發(fā)明又采用抗人IgG單克隆抗體重復(fù)了本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果跟上述抗人IgG多克隆抗體的效果類似。實(shí)施例5加樣墊加有抗人IgG多克隆抗體的TP雙抗原夾心法金標(biāo)試紙條5.1TP包被抗原的制備PCR擴(kuò)增梅毒螺旋體17Kda(TP17)基因部分如SEQIDNO.4所對(duì)應(yīng)的DNA區(qū)段，其上游引物如SEQIDNO.5所示，帶有BamHI位點(diǎn)，下游引物如SEQIDNO.6所示，帶有EcoRI位點(diǎn)。PCR的片段經(jīng)回收之后，用BamHI和EcoRI酶切，連接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表達(dá)載體PET_32a中，得到重組質(zhì)粒PET-32a-TP17，即本發(fā)明的包被抗原的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒PET-32a-TP17轉(zhuǎn)化ER2566(美國(guó)NewEnglandBiolabs公司)，用含100ug/ml氨芐西林鈉的500mlLB培養(yǎng)基37"振蕩培養(yǎng)至0D600=1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG(生工，貨號(hào)IB0168)37。C誘導(dǎo)4小時(shí)。4°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，lmMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，大部分目的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液(廣東光華化學(xué)試劑公司，貨號(hào)7783-20-2，調(diào)pH7.4)至硫酸銨終濃度為30%，4。C靜置30min，4°C12000g離心20分鐘，收集上清，繼續(xù)逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為60%，4。C靜置30min，4°C12000g離心20分鐘，收集沉淀，用5ml平衡緩沖液(10mMNa2HP04，1.8raMKH2P04，140mMNaCl，2.7mMKCl，25mM咪唑(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)15513)，pH8.0)溶解。用10倍柱床體積的平衡緩沖液平衡Ni-NTA親和柱(Qiagen公司，貨號(hào)30210)之后，加入蛋白樣，用10倍介質(zhì)體積的平衡緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，再用5倍體積洗脫緩沖液(20mMNa2HP04，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)，洗脫目的蛋白，測(cè)定蛋白濃度，-2(rC保存?zhèn)溆?，蛋白命名?2a-TP17。5.2TP標(biāo)記抗原的制備用2.1中的TP17片段，連接到用BamHI和EcoRI雙酶切處理之后的表達(dá)載體pGEX-6P-l(Phamacia公司，貨號(hào)27-4597-01)中得到重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-TP17，即本發(fā)明的標(biāo)記抗原的重組質(zhì)粒，以下簡(jiǎn)稱6P-TP17。上述陽(yáng)性克隆，接種于含100ug/ml氨節(jié)西林鈉(生工，貨號(hào)A0339)的500mlLB培養(yǎng)基37。C振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG37。C誘導(dǎo)4小時(shí)。4°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，ImMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，大部分口的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至石Jj充酸銨終濃度為25%，4'C靜置30min，4。C12000g離心20分鐘，收集上清，繼續(xù)逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為45W，4t:靜置30min，4'C12000g離心20分鐘，收集沉淀，用10ml平衡緩沖液(pH7.3PBS，140mMNaCl，2.7mMKC1，lOraMNa2HP04，1.8mMNaH2P(M)溶解。用10倍柱床體積的平衡緩沖液平衡GSTrap親和柱(Amcrsham公司，貨號(hào)17-5130-02)之后，加入蛋A樣，用IO倍介質(zhì)體積的平衡緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，再用5倍體積洗脫緩沖液(50mMTris-HC1，10mM還原型谷胱甘肽(Araresco公司，貨號(hào)0399)，pH8.0)，洗脫目的蛋白，測(cè)定蛋白濃度，-2(TC保存?zhèn)溆?，蛋Q命名為GST-TP17。5.3膠體金的制備參見實(shí)施例1.3制備膠體金。5.4TP標(biāo)記抗原-膠體金標(biāo)記物的制備參見實(shí)施例].4制備TP標(biāo)記抗原-膠體金標(biāo)記復(fù)合物。5.5試紙條的組裝參見實(shí)施例1.5組裝加樣墊加有抗人IgG多克隆抗體的TP雙抗原夾心法金標(biāo)試紙條。5.6檢測(cè)方法參見實(shí)施例1.6進(jìn)行檢測(cè)。5.7檢測(cè)結(jié)果選用經(jīng)過(guò)梅毒螺旋體確診試驗(yàn)(TPPA)驗(yàn)證過(guò)的100份TP陽(yáng)性血清和3000份陰性血清，同時(shí)用本發(fā)明加樣墊預(yù)處理之后的的TP金標(biāo)雙抗原夾心法檢測(cè)試紙條，以及木發(fā)明的對(duì)照試紙條來(lái)檢測(cè)，得到了表7的結(jié)果。表7:不同濃度的抗人TgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條假陽(yáng)性評(píng)價(jià)抗人igc;rpp/ipk;gmq10205102fl"ino多克隆抗對(duì)照對(duì)照18體的濃度(mg/ml)陽(yáng)性檢出份數(shù)10010010。1001001001001001001001009897檢出率(%)100100100100100丄OO100丄OO1001001009897假陽(yáng)檢出份數(shù)0483928242219181516161818假陽(yáng)率(%)01.601.300.930.800.730.630.600.500.600.600.600.60對(duì)于100份陽(yáng)性血清，本發(fā)明試紙條和對(duì)照試紙條都全部檢出，且信號(hào)強(qiáng)度差別不大。對(duì)于3000份陰性血清，對(duì)照試紙條有48份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為1.60%，在3.0mg/ml的抗人IgG多克隆抗體處理之后的加樣墊制備的試紙條有15份檢出(假陽(yáng))，假陽(yáng)率為0.50%，二者有顯著差異。.我們將100份經(jīng)過(guò)梅毒螺旋體確診試驗(yàn)(TPPA)驗(yàn)證過(guò)的TP陽(yáng)性標(biāo)本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對(duì)照，考察不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度，得到的結(jié)果如表8所示。表8:不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度情況抗人TgG多克隆抗體的PBS對(duì)照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0濃度(mg/ml)___IOO份標(biāo)本中檢出陽(yáng)性數(shù)100100丄OO1001001001001001001009896100100100100100100100100100999489999999999898989897959078979797979796969594948165200_848483828281807978786151從表8可以看出，抗人IgG多克隆抗體的濃度越高，對(duì)靈敏度的影響越大，在8.0和10.0mg/ml時(shí)，原倍的標(biāo)本也有漏檢，說(shuō)明，并不是抗人IgG多克隆抗體的使用濃度越高，效果越好。綜合表7和表8的結(jié)果，為了同時(shí)保證試紙條有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發(fā)明的加樣墊上抗人IgG多克隆抗體的使用濃度是0.055.OmgZml，優(yōu)選為0.54.Omg/ml，更優(yōu)選為2.03.Omg/ml。標(biāo)本稀釋子;數(shù)12550100此外，在TP項(xiàng)目中采用本發(fā)明并進(jìn)行實(shí)施例2-4類似的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本發(fā)明應(yīng)用于TP項(xiàng)目與HCV項(xiàng)目有相似的檢測(cè)效果，證明抗人IgG對(duì)TP項(xiàng)目同樣具有改善假陽(yáng)和提高檢測(cè)特異性的效果。對(duì)于HCV、TP項(xiàng)目之外的其它項(xiàng)目，本發(fā)明也做了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本跟上面的實(shí)施例類似，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的研究人員根據(jù)本發(fā)明皆可實(shí)踐，故這里不再贅述。序列表〈110〉深圳市菲鵬生物股份有限公司<120>—種經(jīng)過(guò)改進(jìn)的雙抗原夾心法免疫層析試紙條〈160〉6<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>795<212〉腿〈213>南型肝炎病毒(H印atitisCvirus)<220〉<223〉丙型肝炎病毒NS3部分序列<■〉1CTAGAAACTACCACGCGGTCTCCGGTTTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTACCG60CAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCTCCTACTGGCAGCGGCAAGAGCACTAAAGTG120CCGGCTGCATATGCGGCCCAAGGGTACAAGGTGCTCGTCCTGAACCCGTCCGTTGCCGCC180ACCTTAGGTTTTGGGGCGTATATGTCTAAGGCACATGGTATCGACCCTAGCGTCAGGACC240GGGGTAAGGACCATCACCACGGGTAGCCCCATCACGTACTCCACCTATGGCAAGTTCCTT300GCTGATGGTGGTTGCTCTGGGGGTGCCTATGACATTATAATATGTGATGAGTGCCATTCA360ACTGACTCGACTACTATCTTGGGCATCGGCACGGTCCTGGACCAAGCGGAGACGGCTGGA420GCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACCGCTACGCCTCCGGGATCGGTCACCGTGCCACATCCC480AACATCCAGGAGGTGGCCCTGTCCAATACTGGAGAGATCCCCTTCTATGGTAAAGCCATC540CCCATCGAGGCCATCAGGGGGGGAAGGCATCTCATTTTCTGCCACTCCAAGAAGAAGTGT600GACGAGCTCGCTGCAAAGCTATCATCC、CTCGGACTCAACGCTGTGGCGTACTACCGGGGT660CTTGATGTGTCCGTCATACCATCTAGCGGAGACGTCGTTGTCGTGGCAACAGACGCTCTA720ATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACGTGCGTCACCCAG780ACAGTCGATTTCAGC79521<210>2<211>28<212>DNA<213〉人工合成〈220〉<223>HCVNS3上游引物〈400〉2GGAGGATCCCTAGAAACTACCACGCGGT28<210〉3<211>28〈212〉腿〈213〉人工合成〈220〉〈223〉HCVNS3下游引物〈400〉3GGGAAGCTTGCTGAAATCGACTGTCTGG28〈210>4〈211〉405〈212〉DNA〈213〉梅毒螺旋體(Treponemapallidum)<220>22〈223〉梅毒螺旋體17Kda蛋白的基因序列(TP17)〈400〉4TGTGTCTCGTGCATAACCGTGTGTCCGCACGCCGGGAAGGCCAAAGCGGAAAAGGTAGAG60TGCGCGTTGAAGGGAGGTATCTTTCGGGGTACGCTACCTGCGGCCGATTGCCCGGGAATC120GATACGACTGTGACGTTCAACGCGGATGGCACTGCGCAAAAGGTAGAGCTTGCCCTTGAG180AAGAAGTCGGCACCTTCTCCTCTTACGTATCGCGGTACGTGGATGGTACGTGAAGACGGA240ATTGTCGAACTCTCGCTTGTGTCCTCGGAGCAATCGAAGGCACCGCACGAGAAAGAGCTG300TACGAGCTGATAGACAGTAACTCCGTTCGCTACATGGGCGCTCCCGGCGCAGGAAAGCCT360TCAAAGGAGATGGCGCCGTTTTACGTGCTCAAAAAAACAAAGAAA405<210>5〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉梅毒螺旋體17Kda蛋白的上游引物〈400〉5GGGGGATCCTGTGTCTCGTGCATAACCG28〈210〉6<211>30〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉梅毒螺旋體17Kda蛋白的下游引物<400〉6GGGGAATTCTTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC30權(quán)利要求1.一種雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其特征在于反應(yīng)體系中加有抗人IgG抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其特征在于抗人IgG抗體與待測(cè)樣品有接觸反應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其抗人IgG抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求2的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其采用的標(biāo)記物為酶。5.根據(jù)權(quán)利要求2的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其采用的標(biāo)記物為膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠。6.根據(jù)權(quán)利要求2的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其采用的標(biāo)記物為化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)。7.—種根據(jù)權(quán)利要求3、4制備的雙抗原夾心法ELISA試劑盒，由多孔板、樣品稀釋液、酶結(jié)合物稀釋液、顯色液組成，其特征在于樣品稀釋液中含有抗人IgG抗體。8.—種根據(jù)權(quán)利要求3、5制備的雙抗原夾心法試紙條，由PVC底板、加樣墊、標(biāo)記物墊、NC膜、吸水紙、對(duì)照線和檢測(cè)線組成，其特征在于在加樣墊或者標(biāo)記物墊中含有抗人IgG抗體。全文摘要一種改良的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法，其旨在降低現(xiàn)有雙抗原夾心檢測(cè)法的假陽(yáng)率，提高檢測(cè)的特異性。該方法通過(guò)將抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體，以合適的使用比例加入到雙抗原夾心法檢測(cè)的反應(yīng)體系之中參與檢測(cè)，可具體應(yīng)用于快速診斷、酶聯(lián)免疫檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等多種檢測(cè)方法。本發(fā)明的雙抗原夾心免疫檢測(cè)法與現(xiàn)有雙抗原夾心免疫檢測(cè)法相比，檢測(cè)的背景和假陽(yáng)率有顯著降低，特異性有大大提高。文檔編號(hào)G01N33/577GK101498730SQ20091010605公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年3月16日優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日發(fā)明者婧孫,孫興寶,亮彭,娟洪,潘少麗,王寧燕,王榮娥,鵬胡,顏文豪申請(qǐng)人:深圳市菲鵬生物股份有限公司