血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抗原肽-mhc i類分子單鏈三聚體dna疫苗及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抗原肽(KDR2)與主要組織相容性抗原I類分子(MHC I)的單鏈三聚體DNA疫苗(SCT-KDR2)的多核苷酸，以及此多核苷酸的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一。惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移必須依靠新生血管提供足夠的營(yíng)養(yǎng)才能實(shí)現(xiàn)。因此，以抑制或破壞腫瘤血管生成為目的的抗腫瘤血管生成療法，已成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。該治療策略有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):①血管內(nèi)皮細(xì)胞具有遺傳穩(wěn)定性，不易產(chǎn)生耐藥性；②藥物最易到達(dá)作用部位，即血管表面；③對(duì)具有新血管生成的腫瘤都有效，具有通用性；④新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的有限破壞可使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)并被誘導(dǎo)凋亡從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0003]血管生成過程受到促進(jìn)因子和抑制因子的相互調(diào)節(jié)。主要的血管生成促進(jìn)因子有:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(ang1genin)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)等。主要的血管生成抑制因子包括血管抑素(ang1statin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)和血小板因子-4等。血管生成促進(jìn)因子必須與相應(yīng)的受體結(jié)合，才能發(fā)揮作用。其中VEGF與表達(dá)在活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體VEGFR2 (VEGFR2)結(jié)合所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是血管生成中的限速步驟，在整個(gè)血管生成過程中發(fā)揮著最為關(guān)鍵的作用。業(yè)已證實(shí)，VEGF和VEGFR2過度表達(dá)與人類腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，用VEGFR2胞外區(qū)(也稱可溶性VEGFR2)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VEGF、或者用VEGF的單克隆抗體(bevacizumab，貝伐單抗)中和VEGF的活性、或者用VEGFR2的單克隆抗體結(jié)合VEGFR2、或者用小分子的受體酪氨酸激酶抑制劑(RTKIs)等，阻斷VEGFR2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成和腫瘤的生長(zhǎng)，具有顯著的抗腫瘤作用。但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤患者使用貝伐單抗治療后，初期效果顯著，但隨后出現(xiàn)耐藥。究其原因是由于腫瘤微環(huán)境中表達(dá)的Gall能模擬VEGF，通過與VEGFR2上的N-聚糖復(fù)合物結(jié)合，激活VEGFR2介導(dǎo)的信號(hào)途徑，促進(jìn)腫瘤血管新生。近年來，血管生成抑制因子的基礎(chǔ)和臨床研究也有了可喜的成果，實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)皮抑素、血管抑素和TNP-470在動(dòng)物體內(nèi)均能抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)?；蛑亟M的血管內(nèi)皮抑素已經(jīng)上市，被用于腫瘤治療。但是血管生成抑制因子治療腫瘤必須長(zhǎng)期用藥，一旦停止,腫瘤又會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng),并且血管生成抑制因子的合成和提取費(fèi)時(shí)、費(fèi)事、成本高,治療費(fèi)用昂貴。因此，尋找新的簡(jiǎn)單有效而廉價(jià)的抗腫瘤血管生成制劑是當(dāng)務(wù)之急，只有獲得新的藥物，才能使腫瘤的抗血管生成治療有更大的應(yīng)用前景，才能真正造福于廣大腫瘤患者。
[0004]如前所述，VEGF與表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體VEGFR2結(jié)合所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是血管生成中的限速步驟，在整個(gè)血管生成過程中發(fā)揮著最為關(guān)鍵的作用。因此，VEGFR2是抗腫瘤血管生成治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，若能通過某種途徑打破對(duì)VEGFR2的自身免疫耐受，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)VEGFR2的免疫應(yīng)答，破壞表達(dá)VEGFR2的血管內(nèi)皮細(xì)胞，無疑是抗腫瘤血管生成治療最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法。DNA疫苗由于具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，廣為關(guān)注，但其主要不足是其免疫效果不盡人意。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種分離的編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抗原肽(KDR2)與主要組織相容性抗原I類分子(MHC I)的單鏈三聚體的多核苷酸(SCT-KDR2)，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述的多核苷酸編碼的蛋白，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供包括上述的多核苷酸編碼的載體和疫苗，本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種上述的多核苷酸編碼或蛋白的應(yīng)用，本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種上述的多核苷酸的制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種分離的編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抗原肽與主要組織相容性抗原I類分子的單鏈三聚體的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列至少有90%相同性:
Ca)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種上述的多核昔酸所編碼的蛋白，該蛋白的氣基酸序列如SEQ ID NO:2所不。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種載體，該載體含有上述的多核苷酸。
[0009]—種疫苗，該疫苗含有上述的多核苷酸。
[0010]一種藥物組合物，該藥物組合物含有安全有效量的上述的多核苷酸或其所編碼的蛋白。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述的第四個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
上述的多核苷酸用于制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0012]上述的蛋白用于制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0013]上述的蛋白用于制備KDR2特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)制劑中的應(yīng)用。
[0014]為了實(shí)現(xiàn)上述的第五個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種制備上述的多核苷酸的方法，該方法包括以下的步驟:
①人工合成兩條互補(bǔ)的編碼b2m信號(hào)肽和H-2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸鏈，退火后形成雙鏈DNA，5’ -端含NheI酶切位點(diǎn)，3’ -端含SpeI酶切位點(diǎn)；
②人工合成兩條互補(bǔ)的編碼Linkerl的寡核苷酸鏈，退火后形成雙鏈DNA，5’-端含SpeI酶切位點(diǎn)，3’ -端含HindIII酶切位點(diǎn)；將①和②所得到的雙鏈DNA通過SpeI酶切位點(diǎn)鏈接，并經(jīng)NheI和HindIII酶切后，插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)中，構(gòu)成pcDNA3.1 (+) /b2m 信號(hào)肽-KDR2_Linkerl ；
③RT-PCR從C57BL/6小鼠脾細(xì)胞克隆HID1^cDNA，5’ -端含NotI酶切位點(diǎn)，3，-端含XbaI酶切位點(diǎn)，酶切后，插入pcDNA3.l(+)/b2m信號(hào)肽-KDR2-Linkerl中，形成pcDNA3.1 (+) /b2m 信號(hào)肽-KDR2-Linkerl-H_2Db;
④RT-PCR從C57BL/6小鼠脾細(xì)胞克隆b2m的cDNA，5’ -端含Hindi 11酶切位點(diǎn)，3 ’ -端含BamHI酶切位點(diǎn)，酶切后，插入到pcDNA3.1 (+)/b2m信號(hào)肽-KDR2-Linkerl-H_2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信號(hào)肽-KDR2-Linkerl-b2m-H_2Db;
⑤人工合成兩條互補(bǔ)的編碼Linker2的寡核苷酸鏈，退火后形成雙鏈DNA，5’-端含BamHI酶切位點(diǎn)，3 ’ -端含NotI酶切位點(diǎn)，酶切后，插入到pcDNA3.1 (+) /b2m信號(hào)肽-KDR2-Linkerl-b2m-H-2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信號(hào)肽-KDR2-Linkerl_b2m-Linker2-H-2Db，形成多核苷酸。
[0015]一種制備上述的疫苗的方法該方法包括多核苷酸的制備方法，然后以重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) /b2m 信號(hào)肽-KDR2-Linkerl-b2m-Linker2-H_2Db轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH5a，大量抽提質(zhì)粒，經(jīng)純化后-20° C保存?zhèn)溆谩?br>[0016]本發(fā)明構(gòu)建抗原肽-MHC I類分子[即MHC I類分子重鏈和b2_微球蛋白(b2m)]單鏈三聚體(SCT)以提高DNA疫苗免疫效果的有效措施，SCT DNA疫苗皮內(nèi)免疫能顯著誘導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，在抗腫瘤和抗感染中顯示良好的應(yīng)用前景。軟件分析顯示在小鼠的VEGFR2中存在MHC I類分子(H_2Db)限制性的CTL抗原表位(KDR2，aal033~1042)，本發(fā)明另外構(gòu)建表達(dá)KDR2-b2m-H-2Db的SCT DNA疫苗，并研究其免疫效果以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。并制備新的有效的抗腫瘤血管生成制劑，提高了抗腫瘤效果。
[0017]
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明的SCT-KDR2的結(jié)構(gòu)。
[0019]圖2是本發(fā)明的SCT-KDR2在A293的表達(dá)。
[0020]圖3是本發(fā)明的SCT-KDR2免疫后誘導(dǎo)的CTL對(duì)表達(dá)VEGFR2的靶細(xì)胞的殺傷活性。
[0021]圖4是本發(fā)明的SCT-KDR2免疫后對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的影響。
[0022]圖5是本發(fā)明的SCT-KDR2免疫后抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0024]實(shí)施例1:SCT_KDR2 DNA疫苗的構(gòu)建和制備
該DNA疫苗所用的真核表達(dá)載體為pcDNA3.1 (+) (Invitrogen)。它含有CMV啟動(dòng)子、SV40復(fù)制起始點(diǎn)、新霉素抗性基因，可進(jìn)行目的基因的短暫表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。外源基因克隆位點(diǎn)的兩端分別是含有T7啟動(dòng)子和牛生長(zhǎng)激素BGH的polyA信號(hào)，可用T7和BGH通用引物對(duì)目的外源基因進(jìn)行直接測(cè)序。
[0025]1.1編碼b2m信號(hào)肽和H_2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸鏈的制備人工合成兩條互補(bǔ)的編碼b2m信號(hào)肽和H-2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸鏈，
序列如下:有義鏈:5’-CATGCTAGCATGGCTCGCTC GGTGACCCTAGTCTTTCTGGT GCTTGTCTCACTGACCGGCTTGTATGCTGTCATCCTCACCAACCCCATTTCAATGACTAGTGGTG-3’，反義鏈:5’ -CACCACTAGTCATTGAAATGGGGTTGGTGAGGATGACAGCAT ACAAGCCGGTCAGTGAGACAAGCACCAGAAAGACTAGGGTCACCGAGCGAGCCATGCTAGCATG-3’，退火后形成雙鏈DNA (5’ -端含NheI酶切位點(diǎn)，3’ -端含SpeI酶切位點(diǎn))。
[0026]1.2編碼Linkerl的寡核苷酸鏈的制備及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
人工合成兩條互補(bǔ)的編碼Linkerl的寡核苷酸鏈，序列如下:有義鏈:5’ -GACTA GTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAG GTTCTAAGCTTGGG-3 ’，反義鏈:5，-CCCAAGCTTAGAACCTCCGCCACCAGA ACCTCCG CCACCAGAACCTCCGCCACCAGAACCTCCGCCACCACTAGTC-3’。退火后形成雙鏈DNA (5，-端含SpeI酶切位點(diǎn)，3’ -端含HindIII酶切位點(diǎn))。
[0027]將1.1和1.2所得到的雙鏈DNA通過SpeI酶切位點(diǎn)鏈接，并經(jīng)NheI和HindIII酶切后,插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，構(gòu)成pcDNA3.1 (+)/b2m信號(hào)肽-KDR2_Linkerl。
[0028]1.3 RT-PCR克隆無信號(hào)肽編碼序列的H_2Db cDNA及及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
用 Trizol (Invitrogen)提取 C57BL/6 小鼠脾細(xì)胞總 RNA。以 First Strand cDNASynthesis Kit (Fermentas)將2mg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系為20ml。PCR擴(kuò)增H-2Db cDNA 所用的引物如下:有義引物:5’ -TT6tKKO7(?6GGCCCACACTCGATGCGGT-3’，反義引物:5’-GCTCTAGATCACGCTTTACAATCTCGG AG-3’。PCR 反應(yīng)體積為 50ml，其中含逆轉(zhuǎn)錄模板2ml、0.4mM 引物、0.2mM dNTP 和 IU Blend Taq DNA 聚合酶(Takara)。擴(kuò)增參數(shù)為 94。C20秒、62 ° C 30秒、72 ° C 60秒，30個(gè)循環(huán)后PCR產(chǎn)物行I %瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。DNA序列測(cè)定結(jié)果表明