專利名稱:體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人肝臟祖先細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外擴(kuò)增及制備人肝祖先細(xì)胞的方法。該培養(yǎng)方法及該培養(yǎng)方法 制備的人肝祖先細(xì)胞可用于肝細(xì)胞治療，包括肝細(xì)胞移植、和體外人工肝支持系統(tǒng)，藥物篩 選中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)平臺(tái)，肝炎病毒感染及藥物篩選平臺(tái)等。
背景技術(shù)：
原位肝移植手術(shù)是目前挽救終末期肝病病人生命的最有效的療法。但其費(fèi)用 高、技術(shù)復(fù)雜、尤其是供體肝源嚴(yán)重短缺，很多病人在等待供肝時(shí)死亡。并且患者全肝移 植后，要終生服用昂貴的抗免疫排斥藥物，因此嚴(yán)重地影響病人的生活品質(zhì)。肝細(xì)胞移植 (hepatocytet ransplantation)作為原位肝移植的潛在替代療法，是指將肝細(xì)胞通過脾動(dòng) 脈或肝門靜脈等分別經(jīng)灌注或注射導(dǎo)入肝或脾臟中，以恢復(fù)部份或全部的肝臟功能⑴。另 一種基于肝細(xì)胞治療的方法是生物人工肝支持系統(tǒng)(bioartificialliver)。在該系統(tǒng)中， 患者的血漿通過含肝細(xì)胞的生物反應(yīng)器而循環(huán)。由于在該反應(yīng)器中的肝細(xì)胞具有生物合 成、生物轉(zhuǎn)化和解毒等功能，所以能輔助治療肝功能不全、急慢性肝衰竭及其相關(guān)疾病⑵。 盡管肝細(xì)胞移植和生物人工肝支持系統(tǒng)等肝細(xì)胞治療方法先后在先天性肝臟代謝缺陷病、 急慢性肝衰竭等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究階段取得令人鼓舞的療效，并且該療法可克服肝移 植費(fèi)用昂貴、技術(shù)復(fù)雜、供體肝嚴(yán)重短缺、手術(shù)死亡率相對(duì)較高等困難，但由于肝細(xì)胞來源 的嚴(yán)重短缺，因此限制了它的臨床應(yīng)用(1_5)。通常肝細(xì)胞治療方法需要大量的肝細(xì)胞(每個(gè) 病人需至少1到10億個(gè)細(xì)胞)來達(dá)到一定的療效，而成人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞來源非常有限、肝細(xì) 胞功能不足、體外成活時(shí)間短而難于培養(yǎng)、更不用說代傳和擴(kuò)增，因此尋找合適的、可靠的 和豐富的肝細(xì)胞來源是肝細(xì)胞治療成功的前提條件。
肝臟是人體中生物代謝分解、合成、解毒、和儲(chǔ)存的中心，甚至是免疫器官，也是唯 一能再生的器官。當(dāng)成人肝臟受到輕微的損傷或部分肝(高達(dá)70% )手術(shù)切除，肝臟能通 過肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的復(fù)制而修復(fù)受損傷的肝臟，直至恢復(fù)到正常的水平。此時(shí)的肝干/祖先細(xì) 胞處于未受損傷和靜止的狀態(tài)。可是當(dāng)病毒、化學(xué)毒物等引起大量肝細(xì)胞死亡，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì) 細(xì)胞的復(fù)制能力喪失，這時(shí)肝干/祖先細(xì)胞被激活，而且分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞以修復(fù)部分肝 功能。可是，當(dāng)肝受到持續(xù)而嚴(yán)重的損傷時(shí)，肝干/祖先細(xì)胞的復(fù)制能力也將喪失，最終導(dǎo) 致病程難以逆轉(zhuǎn)(6)。
由于肝干/祖先細(xì)胞具有超強(qiáng)的增殖與雙向或多向分化潛能、強(qiáng)的抗缺血損傷能 力、低免疫原性和非腫瘤源性，因此被認(rèn)為是最安全有效和最具前景的肝細(xì)胞來源(7)。但 是，現(xiàn)在人們對(duì)肝干/祖先細(xì)胞的認(rèn)知還不夠完整。例如，在肝臟中有多少種肝干/祖先細(xì) 胞？非肝源性的干細(xì)胞在體內(nèi)能否分化為肝干細(xì)胞嗎？這些肝干/祖先細(xì)胞在肝中存在 的部位及表面標(biāo)記譜系有什么異同？這些肝干/祖先細(xì)胞怎樣協(xié)同地參與肝再生和發(fā)育 及分化？這些仍是研究的熱點(diǎn)和爭(zhēng)論的焦點(diǎn)(6)。1956年Farber等(8)首先在在嚙齒類動(dòng) 物肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)一種胞漿少，核呈卵圓形，具有雙向分化潛能的小細(xì)胞，并將這種細(xì)胞 命名為卵圓細(xì)胞(oval cell)。通常情況下，卵圓細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，數(shù)量極少，它主要分布于閏管、門管和膽管樹狀分支區(qū)，只是肝在受到嚴(yán)重的損傷時(shí)，它才在門靜脈周圍大量增 殖，并參與肝再生與肝損傷修復(fù)。由于卵圓細(xì)胞和造血干細(xì)胞有某些共同的細(xì)胞表面標(biāo)記 物(如!1^-1、0)34、30 、(3-1^0，這暗示二者密切相關(guān)，并可能共同來源于骨髓。Taniguchi 等⑼將造血干細(xì)胞移植到急性肝衰竭小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)這些造血干細(xì)胞不僅在小鼠體內(nèi)形 成嵌合肝，而且重建了受體小鼠的骨髓造血功能，并可誘導(dǎo)移植后小鼠的免疫耐受，這表明 功能性的造血干細(xì)胞能在肝臟中生存。Lagasse等(1°)更進(jìn)一步將正常小鼠的全骨髓細(xì)胞 或純化的造血干細(xì)胞KTLS (C-IdthighThyltwIirrsca-I+)亞群移植給延胡索酰乙酰乙酸水解 酶(Fumarkylacetoacetate hydrolase, FAH)剔除的小鼠中，顯示能顯著改善其肝功能，提 高存活率。在這些移植了造血干細(xì)胞的FAH剔除小鼠肝中，觀察到造血干細(xì)胞竟能分化為 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。后來的實(shí)驗(yàn)解釋了這種現(xiàn)象，實(shí)際上是在特定的FAH剔除小鼠肝損傷模型中， 造血干細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的融合而不是造血干細(xì)胞的分化(“)。這一實(shí)驗(yàn)引發(fā)人們更多的 疑問細(xì)胞融合是一種正常的肝再生機(jī)制嗎？為什么細(xì)胞融合會(huì)在肝中發(fā)生？肝中細(xì)胞融 合會(huì)引起癌變嗎(12) ？
de Boer 等(lS 利用上皮細(xì)胞黏附分子(印ithelial cell adhesionmolecule, EpCAM)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)觀察正常肝、再生肝、胚胎肝臟及肝腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)EpCAM的 表達(dá)總是和細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)。在胚胎肝臟組織中，EpCAM陽(yáng)性(EpCAM+)的細(xì)胞不但在肝母 細(xì)胞區(qū)，而且存在于肝母細(xì)胞與門靜脈間充質(zhì)結(jié)合的膽管細(xì)胞區(qū)，但在造血組織(微血管 周圍)中呈陰性；在成人肝臟組織中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和大的肝膽管細(xì)胞不表達(dá)EpCAM?？墒?，小 的肝膽管細(xì)胞及間充質(zhì)表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的EpCAM。在肝損傷及再生時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了大量EpCAM+的 細(xì)胞。因此，這些生長(zhǎng)的EpCAM+的肝細(xì)胞被認(rèn)為是肝干細(xì)胞及祖先細(xì)胞。隨著這些肝干細(xì) 胞漸漸分化為成熟的肝細(xì)胞，EpCAM的表達(dá)也就完全消失(13_15)。另外，在肝母細(xì)胞瘤和膽管 癌中也有發(fā)現(xiàn)大量EpCAM+的細(xì)胞(13)。
最近的幾篇報(bào)道更進(jìn)一步地證實(shí)，EpCAM是一個(gè)可靠的肝干細(xì)胞及祖先細(xì)胞標(biāo)記 物，而且利用EpCAM標(biāo)記物分離純化了肝臟干細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞。例如，Schmelzer等(16)從 妊娠約16 20周的人胎肝和成人肝中，用熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)，分離純化了兩種細(xì)胞，一種是EpCAM/神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neral cell adhesionmolecule)陽(yáng)性(NCAM+)、人細(xì)胞角蛋白 19 (cytokeratin 19)陽(yáng)性(CK19+)、白蛋白 (albumin)陰性或弱陽(yáng)性，但甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)陰性的肝干細(xì)胞(liver stem cell)；另一種是EpCAM+、NCAM_a°w、CK19+a ，但甲胎蛋白和白蛋白陽(yáng)性的肝母細(xì)胞 (hepatoblast) 0這兩種細(xì)胞的比例隨著人肝生長(zhǎng)發(fā)育的階段而變化。在胎兒肝中，約有 12% EpCAM+的細(xì)胞，其中約10% EpCAM+的細(xì)胞是肝母細(xì)胞，少于0. 7%的細(xì)胞是肝干細(xì)胞。 相反地，在成人及新生兒肝中，有約2% EpCAM+的細(xì)胞，其中約0. 5% EpCAM+的細(xì)胞是肝干 細(xì)胞，肝母細(xì)胞的比例少于0. 1%。Dan等(17)經(jīng)長(zhǎng)期嚴(yán)格的培養(yǎng)，從妊娠約10 15周的 人胎肝中也分離純化了一種多潛能的干細(xì)胞(multipotent progenitor cell)。這種干細(xì) 胞表達(dá) EpCAM+、CD45/ CD34+、CD90+、c_kit+、c_met+、SSEA-4+、CK18+、CK19+、CD44+ (透明質(zhì)酸 寡聚糖受體，hyaluronan rec印tors)，但甲胎蛋白和白蛋白陰性。該多潛能干細(xì)胞不僅能 分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管細(xì)胞，而且在特定的分化條件下可分化為脂肪、骨、軟骨等組織細(xì) 胞和內(nèi)皮細(xì)胞。因此該多潛能的肝干細(xì)胞被認(rèn)為是間充質(zhì)-上皮移行細(xì)胞(印ithelial-m esenchymaltransitions)。Herrera等(18)經(jīng)長(zhǎng)期嚴(yán)格的培養(yǎng)，從成人肝中富集分離了一種甲胎蛋白和白蛋白陽(yáng)性，CK-19陰性(CK19—)的不同于卵圓細(xì)胞的多潛能肝干細(xì)胞(human liver stem cell，HLSC)。HLSC表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD73、CD44和CD90，但 不表達(dá)血液干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD45、CD117和CD133。HLSC也表達(dá)波形蛋白(vimentin) 和巢蛋白(nestin)。HLSC在體外不僅能分化為成熟的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而且能在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基 中分化為骨、內(nèi)皮細(xì)胞以及產(chǎn)胰島素的胰島樣的結(jié)構(gòu)。但這種多潛能的肝干細(xì)胞在成人肝 中所占的比例極低。Turner等(⑼及Kon等(2°)更進(jìn)一步證實(shí)⑶44像EpCAM—樣也在人 肝干細(xì)胞及肝母細(xì)胞中表達(dá)。上述的幾種肝干/祖先細(xì)胞都能在動(dòng)物肝損傷模型中修復(fù)肝 損傷。由于上述這些干細(xì)胞的表面標(biāo)記和特性并不完全相同，這暗示肝內(nèi)的干細(xì)胞是一個(gè) 非常異質(zhì)的動(dòng)態(tài)演化的種群。當(dāng)前文獻(xiàn)中描述的肝干細(xì)胞或許只代表肝臟中某一特殊發(fā)育 分化階段的干細(xì)胞。隨著這些從人胎兒及成人肝臟的肝干/祖先細(xì)胞的進(jìn)一步分離，純化 及其表面標(biāo)記譜系的鑒定及分化的誘導(dǎo)，將為肝干/祖先細(xì)胞的細(xì)胞治療提供了堅(jiān)實(shí)的基 礎(chǔ)。另外，由于干細(xì)胞的可朔性，有文獻(xiàn)報(bào)道，非肝源性組織器官的干細(xì)胞，例如骨髓或血液 干細(xì)胞(1°’21)、人臍帶血干細(xì)胞(22)、人脂肪組織(23)以及胰腺上皮細(xì)胞(24)，在特定的的分化 培養(yǎng)基中也可分化為成熟樣的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
—般地，干細(xì)胞在體內(nèi)或體外有五種可能的命運(yùn)(1)干細(xì)胞處于不分裂的 潛伏狀態(tài)(quiescence) ； (2)干細(xì)胞經(jīng)對(duì)稱分裂(symmetricdivision)或自我更新 (self-renewal)而擴(kuò)增(expansion) ； (3)干細(xì)胞經(jīng)不對(duì)稱分裂(asymmetric division)而 維持相對(duì)穩(wěn)定比例的干細(xì)胞和分化的細(xì)胞(maintenance) ； (4)干細(xì)胞經(jīng)分化為成熟的細(xì) 胞而耗盡(d印letion or differentiation) ； (5)干細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞凋亡而消失(apotosis)。 實(shí)際上干細(xì)胞所處的微環(huán)境決定了它的命運(yùn)，特別是在肝中，肝干/祖先細(xì)胞處在一個(gè)有 肝干/祖先細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝干/祖先細(xì)胞與胞外基質(zhì)、肝干/祖先細(xì)胞與 各種體液因子之間極其復(fù)雜的相互作用的三維空間中(6’25)，這些協(xié)同的相互作用所產(chǎn)生的 信號(hào)構(gòu)成了一個(gè)整合的網(wǎng)狀的信號(hào)微環(huán)境。這些間質(zhì)細(xì)胞包括肝星狀細(xì)胞(humanstellate cell，HSTC)、肝膽管細(xì)胞(human biliary duct cell，HBDC)、肝臟成纖維樣細(xì)胞(liver fibroblast-like cells)，肝內(nèi)皮細(xì)胞(humanliver endothelial cell)；胞外基質(zhì)包括膠 原蛋白(collagen),如 I, III 或 IV、或非膠原糖蛋白(noncollagenous glycoproteins), 如層粘連蛋白(Iaminin)，纖維粘連蛋白(f ibronectin)、或蛋白多糖(proteoglycan)，如明M (hyaluronic ac id)、硫酸乙酰肝素糖蛋白(h印aran sulfate proteoglycans, HSPG)等。體液因子包括腫瘤壞死因子(TNF α)、人白細(xì)胞介素3 (IL-3)、人白細(xì)胞介素 6(IL-6)、肝生長(zhǎng)因子(HGF)；和甚至交感神經(jīng)也被認(rèn)為調(diào)控肝干/祖先細(xì)胞的生長(zhǎng)@)。雖 然文獻(xiàn)報(bào)道肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞，能增強(qiáng)成熟肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能，但是在這些肝間 質(zhì)細(xì)胞中，肝內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)肝再生和發(fā)育起著更重要的作用(27_32)。當(dāng)成人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體 外培養(yǎng)時(shí)，常常很快失去肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能，去分化甚至死亡。但是，當(dāng)它同成人肝竇內(nèi) 皮細(xì)胞(liversinusoidal endothelia lcell)共培養(yǎng)時(shí)，成人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞變得對(duì)丙型肝 炎病毒易感，并維持其它成人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能(33)。但現(xiàn)在，還未見內(nèi)皮細(xì)胞能選擇性 增強(qiáng)肝干/祖先細(xì)胞的功能和生長(zhǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道。
常規(guī)的干細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法是經(jīng)機(jī)械的剪切-連貼或/和長(zhǎng)時(shí)間的膠原酶降解而 轉(zhuǎn)移干細(xì)胞集落。機(jī)械的剪切-連貼法常常導(dǎo)致極低的傳代效率，長(zhǎng)時(shí)間的膠原酶降解能 損傷干細(xì)胞而導(dǎo)致大量的干細(xì)胞不能形成干細(xì)胞集落，并且在操作過程中，這些干細(xì)胞集落不可避免地被其它的非干細(xì)胞污染。如果這些干細(xì)胞集落直接用于臨床肝細(xì)胞移植中， 會(huì)引起血管栓塞；如果直接用于冷凍保存會(huì)引起大量的肝干細(xì)胞死亡。因此，體外培養(yǎng)的干 細(xì)胞集落必須經(jīng)降解，重新分離純化為單個(gè)人肝干細(xì)胞才能應(yīng)用在臨床肝細(xì)胞移植中和有 效地冷凍保存及傳代。
冷凍保存是保存及運(yùn)輸骨髓和各種細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)方法。成人肝細(xì)胞較脆弱，普通 冷凍保存方法可對(duì)肝細(xì)胞造成相當(dāng)大的損傷。現(xiàn)有保存肝細(xì)胞的方法非常繁瑣，需要昂貴 的程控低溫冰箱。如果經(jīng)培養(yǎng)后肝祖先細(xì)胞能按標(biāo)準(zhǔn)冷凍保存方法保存和復(fù)蘇，將為肝祖 先細(xì)胞的研究和臨床應(yīng)用提供極大的方便。
如果用于細(xì)胞治療的細(xì)胞污染有動(dòng)物血清、蛋白及細(xì)胞時(shí)，常在臨床應(yīng)用中引起 急性免疫排斥反應(yīng)及潛在的動(dòng)物病毒感染。盡量減少這些污染而造成在臨床上的急性免疫 排斥反應(yīng)，是體外擴(kuò)增及制備肝祖先細(xì)胞時(shí)應(yīng)充分考慮這些因子。
在現(xiàn)行的生物人工肝支持系統(tǒng)中，普遍采用永久肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞株或肝腫瘤細(xì)胞株或 異種動(dòng)物的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞等，這是因?yàn)槌扇烁螌?shí)質(zhì)細(xì)胞難于體外培養(yǎng)和長(zhǎng)期維持其功能⑵。 但這些細(xì)胞株或異種動(dòng)物的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的生理代謝及功能同原代的成人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞相比 有很大的不同，并有潛在的致腫瘤性或可能帶有人畜共患病的病毒。在生物人工肝支持系 統(tǒng)這一概念提出二十多年后，生物人工肝支持系統(tǒng)僅在美國(guó)的FDA 二期臨床研究階段。有 限的細(xì)胞來源和缺乏成人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和長(zhǎng)期維持其功能的方法是限制生物人工 肝支持系統(tǒng)發(fā)展的瓶頸因素。
由于人肝干/祖先細(xì)胞比成人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞有無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，它有可能成為肝細(xì) 胞治療的合適的、可靠的和豐富的肝細(xì)胞來源。但人肝干/祖先細(xì)胞的數(shù)量非常有限，只有 經(jīng)體外大量培養(yǎng)，才能解決臨床上肝細(xì)胞嚴(yán)重不足的矛盾。然而，現(xiàn)行的肝干/祖先細(xì)胞培 養(yǎng)方法并沒有充分考慮到肝干/祖先細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境和臨床應(yīng)用的要求，使得純化的肝 干/祖先細(xì)胞系難以在無(wú)動(dòng)物細(xì)胞、病毒、血清、及蛋白等污染的條件下獨(dú)立培養(yǎng)及傳代， 難以制備成臨床所需的單細(xì)胞，因此離肝細(xì)胞臨床應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)。例如，人肝干/祖先細(xì)胞 培養(yǎng)在人膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等胞外基質(zhì)，或聚乳酸羥乙酸(PLGA)、多肽 聚合物等人工合成的基質(zhì)上，人肝干/祖先細(xì)胞易失去自我更新能力，并很快分化為肝實(shí) 質(zhì)細(xì)胞或/和膽管細(xì)胞而停止生長(zhǎng)。例如，人肝干/祖先細(xì)胞培養(yǎng)在生長(zhǎng)被抑制的鼠胚胎 纖維母細(xì)胞滋養(yǎng)層上，能顯著地提高人肝干/祖先細(xì)胞的自我更新和克隆生長(zhǎng)能力(34)。但 動(dòng)物(鼠)來源的蛋白及潛在的動(dòng)物細(xì)胞及病毒污染嚴(yán)重地影響它的臨床應(yīng)用。例如，人 肝干/祖先細(xì)胞培養(yǎng)在源于鼠腫瘤組織的MatriKel 上，仍不能克服上述動(dòng)物蛋白甚至腫 瘤因子的污染。例如，共培養(yǎng)人肝干細(xì)胞和未純化人胎肝非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，雖然克服了上述動(dòng) 物蛋白及細(xì)胞污染的因素，但似乎是將純化人肝干/祖先細(xì)胞回復(fù)到未純化的狀態(tài)，并且 人肝干/祖先細(xì)胞的自我更新和克隆生長(zhǎng)能力僅有有限的提高。另一缺點(diǎn)是不同批次的未 純化人胎肝非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的技術(shù)指標(biāo)很難質(zhì)控。
盡管在公開號(hào)為CN1742082A的專利中提到了人肝干/祖先細(xì)胞的分離、傳代，然而，其“從塑膠傳代到STO飼養(yǎng)層以后的集落形成效率很低，......可能由于需要將細(xì)胞置于漫長(zhǎng)的膠原酶消化以獲得單細(xì)胞懸液的緣故”(見說明書第51頁(yè))，獲得適于臨床應(yīng)用 的、大量純化的，多次獨(dú)立傳代的人肝干/祖先細(xì)胞依然難如人意。
如何得到在體外能大量擴(kuò)增，可獨(dú)立傳代的純化的人干干/祖先細(xì)胞始終是一個(gè)難題。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種體外擴(kuò)增傳代的人肝祖先細(xì)胞(human hepatic progenitor cell)的制備方法，該方法包括a、分離人肝祖先細(xì)胞；b、在含有人纖 維蛋白膠或其類似物的胞外基質(zhì)上，用無(wú)血清的培養(yǎng)基共培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞和步驟a分離到的 人肝祖先細(xì)胞，擴(kuò)增得到人肝祖先細(xì)胞集落。
優(yōu)選的，所述的方法還包括步驟C、利用單細(xì)胞制備技術(shù)，將步驟b得到的人肝祖 先細(xì)胞集落制備成單細(xì)胞懸液，進(jìn)一步分離純化人肝祖先細(xì)胞。
具體地，步驟c所述的單細(xì)胞制備技術(shù)包括
(a)將步驟b得到的人肝祖先細(xì)胞集落用膠原酶(Collagenase)或高度純化的膠 原酶liberase blendzyme3，或者其中之一與透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)或其他的中性 蛋白酶(如鏈霉蛋白酶，pronase)的混合，酶解不超過4分鐘，收集培養(yǎng)物；
(b)將步驟(a)的培養(yǎng)物，用胰蛋白酶(trypsin)或Accutase消化，在不超過室溫 條件下，消化時(shí)間不超過5分鐘，收集細(xì)胞培養(yǎng)物；
(c)將步驟(b)的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮于含分散酶(dispase)緩沖液中，再加入脫氧核 糖核酸酶I (DNase I)，至白色絮狀物消失和細(xì)胞釋放，過濾、沉淀，收集沉淀細(xì)胞，加入緩沖 液，得到單細(xì)胞懸液。從該單個(gè)細(xì)胞懸液中經(jīng)免疫選擇法分離純化人肝祖先細(xì)胞，該分離純 化人肝祖先細(xì)胞可在液氮中冷凍保存。
上述方法中，所述的人肝祖先細(xì)胞，包括人肝祖先細(xì)胞Qiuman Iiverprogenitor cell)、肝母細(xì)胞(h印atoblast)、卵圓細(xì)胞(oval cell)。
這些人肝祖先細(xì)胞可從人肝干細(xì)胞Ofepatic stem cell)分化得到，也可從非肝 源性的胰臟、骨髓等器官，或人臍帶血、人脂肪組織、分化的人胚胎干細(xì)胞經(jīng)免疫選擇法或 特別嚴(yán)格的培養(yǎng)法而富集得到。
上述方法中，所述的胞外基質(zhì)為人纖維蛋白膠或經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白 膠或它們與其他胞外基質(zhì)的組合物，其他胞外基質(zhì)可為膠原蛋白，如III或IV，或非膠原 糖蛋白，如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白，或蛋白多糖，如透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素糖蛋白或它 們的混合物、或富含胞外基質(zhì)的組織抽提物。
所述的人纖維蛋白膠(fibrin)或其類似物，例如，聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白 膠(fibrin-PEG)是通過凝血酶(thrombin)作用于人纖維蛋白原(fibrinogen)或經(jīng)聚乙 二醇化(PEGylation)修飾的人纖維蛋白原(fibrinogen-PEG)而制備的降解物。
簡(jiǎn)單地，凝血酶降解人纖維蛋白原或經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白原為人纖維 蛋白單體(fibrin monomer)，血漿纖維蛋白肽(fibrinop印tide) A和B。多個(gè)人纖維蛋白 膠單體自集合為人纖維蛋白多體(fibrin multimer)而成的一種無(wú)色或白色的無(wú)定形纖維 狀的彈性膠狀降解物-即為人纖維蛋白膠。
所述的經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白原是指將人纖維蛋白原的氨基或羧基 或羥基或巰基或N-末端，被聚乙二醇共價(jià)修飾。如單甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸鹽 (Methoxy-poly(ethylene glycol)-nitrophenylcarbonate,mPEG-NPC)或單甲氧聚乙^酉享 酰胼(mPEG-hydrazide)或單甲氧聚乙二醇環(huán)氧化物(mPEG-印oxide)或單甲氧聚乙二醇順7丁烯二酰亞胺(mPEG-maleimide)或單甲氧聚乙二醇乙醛(mPEG-aldehyde)。
上述方法中，所述培養(yǎng)基是無(wú)血清的合成培養(yǎng)基，其含有碳水化合物代謝調(diào)解劑、 轉(zhuǎn)鐵蛋白組合物、高濃度的核苷組合物、肝素鈉、抗氧化物、重組的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (EGF)、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、重組的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等，籍此維 持內(nèi)皮細(xì)胞的生存及促進(jìn)人肝祖先細(xì)胞集落形成。
上述方法中，所述的飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選為人內(nèi)皮細(xì)胞，具體的，人內(nèi)皮細(xì)胞是人臍帶靜 脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)或/和人肝竇內(nèi)皮細(xì) 胞(human liver sinusoidal endothelialcell，HLSEC)，或 / 和其他的內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種由權(quán)利要求
1所述的方法制備的體外擴(kuò)增傳代的人肝祖先細(xì) 胞，該人肝祖先細(xì)胞依共培養(yǎng)方法可傳代培養(yǎng)至少10代，而未見明顯的人肝祖先細(xì)胞自我 更新能力和克隆能力丟失。
按照本發(fā)明所述的方法，在共培養(yǎng)條件下的人肝祖先細(xì)胞，當(dāng)在無(wú)血清的培養(yǎng)基 中添加細(xì)胞分化因子時(shí)，人肝祖先細(xì)胞可在體外分化為成熟樣的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的方法可以體外選擇性地增強(qiáng)人肝祖先細(xì)胞的自我更新，優(yōu)選的實(shí)施方案 中，在胞外基質(zhì)人纖維蛋白膠上共培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞和人肝祖先細(xì)胞，優(yōu)先擴(kuò)增的細(xì)胞是人 肝祖先細(xì)胞。
本發(fā)明制備的人肝祖先細(xì)胞為肝細(xì)胞治療，包括肝細(xì)胞移植和生物人工肝支持系 統(tǒng)，藥物篩選中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)平臺(tái)，肝炎病毒感染及藥物篩選平臺(tái)等提供良好的人肝細(xì) 胞來源。
本發(fā)明公開的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及制備人肝祖先細(xì)胞的方法，可以在體外選擇性地增 強(qiáng)人肝干/祖先細(xì)胞的自我更新。該方法充分考慮了細(xì)胞相互作用(肝祖先細(xì)胞與非肝實(shí) 質(zhì)細(xì)胞的接觸)、生長(zhǎng)因子、及胞外基質(zhì)等各種因素的相互作用的微環(huán)境，使肝干細(xì)胞可以 在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)稱分裂(自我更新)，同時(shí)降低肝祖先細(xì)胞的分化(不對(duì)稱分裂)而大量擴(kuò) 增，該培養(yǎng)方法時(shí)也為下游的代傳培養(yǎng)、單細(xì)胞制備、和臨床應(yīng)用提供了條件。詳細(xì)地，在含 有人纖維蛋白膠胞外基質(zhì)上，用無(wú)血清的培養(yǎng)基共培養(yǎng)人肝祖先細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞(提供 生長(zhǎng)因子和細(xì)胞接觸甚至胞外基質(zhì))，擴(kuò)增得到大量人肝祖先細(xì)胞集落；在含有人纖維蛋 白膠胞外基質(zhì)上，該人肝祖先細(xì)胞集落，經(jīng)膠原酶簡(jiǎn)單的處理，易于脫離人纖維蛋白膠的表 面，經(jīng)更進(jìn)一步的酶降解等單細(xì)胞制備技術(shù)處理，人肝祖先細(xì)胞可被分離純化或/和傳代 培養(yǎng)。


圖1顯示人胎肝祖先細(xì)胞在共培養(yǎng)條件下不同時(shí)間點(diǎn)的人肝祖先細(xì)胞集落形態(tài) (A)、數(shù)量⑶及上清液中白蛋白(C)和甲胎蛋白⑶的含量。
圖2顯示用熒光活化細(xì)胞分選法分析人胎肝祖先細(xì)胞和不同的細(xì)胞共培養(yǎng)物中 EpCAM+肝祖先細(xì)胞的比例(A)、數(shù)量⑶及上清液中白蛋白(C)和甲胎蛋白⑶的含量。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述，說明但不限制本發(fā)明。
本發(fā)明是一種體外擴(kuò)增及制備人肝祖先細(xì)胞的方法。該方法包括(1)經(jīng)共培養(yǎng)法體外擴(kuò)增人肝祖先細(xì)胞；( 利用單細(xì)胞制備技術(shù)，從該擴(kuò)增的細(xì)胞中分離純化人肝祖先 細(xì)胞。
本發(fā)明優(yōu)先的實(shí)施的方案中，在胞外基質(zhì)人纖維蛋白膠上共培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞和人 肝祖先細(xì)胞，優(yōu)先擴(kuò)增的細(xì)胞是人肝祖先細(xì)胞。
本發(fā)明中所使用的“擴(kuò)增”，意思是在特殊的培養(yǎng)條件下的人肝祖先細(xì)胞數(shù)量的 增加。這也意味著增強(qiáng)人肝祖先細(xì)胞的對(duì)稱分裂或自我更新，同時(shí)降低或抑止不對(duì)稱分 裂和分化。本發(fā)明所涉及的人肝祖先細(xì)胞，可根據(jù)公開發(fā)表的文獻(xiàn)(13’16_18’3S或/和公開 的專利文獻(xiàn)(W003/078588A2, W02005/068612A2, W02004/009766A2, W02006/126236A1, W003/000848A2, CN1728946A, CN1742082A)等所述的方法分離純化，該細(xì)胞的分子標(biāo)志物 為EpCAM+、⑶44+、AC133+、CK19+、甲胎蛋白和白蛋白陽(yáng)性，但⑶45_、神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子 (NCAM-)陰性和HLA_a 。盡管本發(fā)明申請(qǐng)中的人肝祖先細(xì)胞最好是源于人肝臟，特別是人胎 肝臟。但是，基于人干細(xì)胞的可塑性，人肝祖先細(xì)胞也可從肝干細(xì)胞分化得到或從其他的來 源得到，例如從人胰臟、骨髓等器官，或人臍帶血、人脂肪組織以及分化的人胚胎干細(xì)胞中 分離得到。
本發(fā)明是一種體外擴(kuò)增及制備人肝祖先細(xì)胞的方法。該方法是在人纖維蛋白膠上 共培養(yǎng)人肝祖先細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使用一種無(wú)血清的、含細(xì)胞生長(zhǎng)因子的合成培養(yǎng)基，從而 擴(kuò)增人肝祖先細(xì)胞。
尤其是，本發(fā)明中人內(nèi)皮細(xì)胞最好是人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或人肝竇內(nèi)皮細(xì) 胞，或兩者的混合物。同其它的肝間質(zhì)細(xì)胞(如肝星狀細(xì)胞、肝膽管細(xì)胞、肝臟成纖維樣細(xì) 胞)相比，人內(nèi)皮細(xì)胞在共培養(yǎng)條件下，能更有效地增強(qiáng)人肝祖先細(xì)胞的自我更新(對(duì)稱分 裂)，同時(shí)降低人肝祖先細(xì)胞的分化(不對(duì)稱分裂)，能更好地保持人肝祖先細(xì)胞的特性。
本發(fā)明中的胞外基質(zhì)最好是人纖維蛋白膠或經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白膠 或它們與其他的胞外基質(zhì)的組合，例如與胞外基質(zhì)包括膠原蛋白，如III或IV、或非膠原糖 蛋白，如層粘連蛋白，纖維粘連蛋白、或蛋白多糖，如透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素糖蛋白或富含 胞外基質(zhì)的組織抽體物等的組合。人纖維蛋白膠或經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白膠是通 過凝血酶降解人纖維蛋白原或經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白膠原而制備的凝膠狀降解 物。在制備人纖維蛋白膠與其他的胞外基質(zhì)的組合時(shí)，其他的胞外基質(zhì)可在凝血酶加入之 前加入。人纖維蛋白膠或人纖維蛋白膠與其他的胞外基質(zhì)的組合可直接制備在培養(yǎng)皿的表
本發(fā)明所涉及的支持人肝祖先細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基，所述的 培養(yǎng)基包括碳水化合物、核苷組合物、代謝調(diào)節(jié)劑、轉(zhuǎn)鐵蛋白、肝素鈉、抗氧化物和細(xì)胞生 長(zhǎng)因子等，籍此維持內(nèi)皮細(xì)胞的生存及促進(jìn)人肝祖先細(xì)胞集落形成。一個(gè)典型的無(wú)血清 的培養(yǎng)基的組份是在等體積比的DMEM、F12K、M199、和RPMI1640中，包含IOmM煙酰胺 (nicotinamide) >0. 5mM L-抗壞血酸-2-磷酸酉旨鎂(ascorbic acid-2-phosphate Mg)、 1(Γ7Μ氫化可的松(hydrocortisone)、4mM谷氨酰胺(glutamine)、0. 45%葡萄糖(glucose)、 1 % ITS 組合物(Insulin-Transferring-運(yùn)elenious acid)組合物[6. 25 μ g/ml 胰島素 (insulin) >6. 25 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin) >6. 25 μ g/ml 亞石西酸(selenious acid)、 1. 25mg/ml小牛血清白蛋白(BSA) ]、2· 5 μ g/ml肝素鈉(h印arin)、0· ImM核苷組合物[胸 苷(Thymidine),尿苷(uridine),胞苷(cytidine),鳥苷(guanosine),及肌苷(inosine)]、910ng/ml重組的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(印ithelial growth factor, EGF)、重組的人血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)各 5ng/ml。也可選擇地加入 5ng/ml 重組的人 TWEAK (JNF-like weak inducer of apoptosis)來刺激人肝祖先細(xì)胞生長(zhǎng)。
在人內(nèi)皮細(xì)胞和人肝祖先細(xì)胞共培養(yǎng)前，所使用的人內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)預(yù)先培養(yǎng)在上述 的無(wú)血清的培養(yǎng)基中，以適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人纖維蛋白膠表面上共培養(yǎng)人肝祖先細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞，在無(wú) 血清的培養(yǎng)基中，能擴(kuò)增人肝祖先細(xì)胞。該人肝祖先細(xì)胞擴(kuò)增的形態(tài)方式可以是擴(kuò)散式的、 細(xì)胞集落式的或克隆形成式的，并能在體外長(zhǎng)期生存。
本發(fā)明也涉及一種從優(yōu)先擴(kuò)增的人肝祖先細(xì)胞共培養(yǎng)物中制備單個(gè)人肝祖先細(xì) 胞懸液的技術(shù)。該技術(shù)包括依次用(1)膠原酶或高度純化膠原酶Liberase Blendzyme3, (2)胰蛋白酶，( 分散酶和脫氧核糖核酸酶I三步降解優(yōu)先擴(kuò)增的人肝祖先細(xì)胞的共培 養(yǎng)物而產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。人肝祖先細(xì)胞可從單細(xì)胞懸液中通過免疫選擇法(CD44+或/和 EpCAM+)或者在體外選擇性的培養(yǎng)條件下更進(jìn)一步純化，例如FACS、免疫磁珠分選技術(shù)，組 織培養(yǎng)瓶鋪展貼壁等。
同其它的胞外基質(zhì)相比，在人纖維蛋白膠上共培養(yǎng)的人肝祖先細(xì)胞經(jīng)較短時(shí)間的 膠原酶降解，細(xì)胞即可脫離人纖維蛋白膠表面，因此極大地降低了因常規(guī)的膠原酶過度降 解而引起的肝干細(xì)胞損傷。
另外，需要說明的時(shí)，并不是每代經(jīng)共培養(yǎng)擴(kuò)增的人胎肝祖先細(xì)胞都需要制備為 單細(xì)胞懸浮液才能傳代。當(dāng)共培養(yǎng)物中的CD44+或/和EpCAM+細(xì)胞的比例大于50%時(shí)，該 共培養(yǎng)物經(jīng)膠原酶H或高度純化的膠原蛋白酶liberase Blendzyme3簡(jiǎn)短降解，離心收集 和清洗含內(nèi)皮細(xì)胞和人胎肝祖先細(xì)胞的共培養(yǎng)物，按1 2或1 3比例，能成功地直接傳代培 養(yǎng)該共培養(yǎng)物。直到共培養(yǎng)物中的CD44+或/和EpCAM+細(xì)胞的比例低于50%時(shí)，應(yīng)用上述 的單細(xì)胞制備技術(shù)分離純化CD44+或/和EpCAM+的細(xì)胞，再繼續(xù)經(jīng)共培養(yǎng)擴(kuò)增及傳代。
上述純化的人肝祖先細(xì)胞能在體外至少可共培養(yǎng)到第10代。
在上述的無(wú)血清的培養(yǎng)基中擴(kuò)增的人肝祖先細(xì)胞的數(shù)量可以用不同的方法檢測(cè)。 例如，可用血球記數(shù)器等記數(shù)總的細(xì)胞數(shù)，又可用流式細(xì)胞術(shù)記數(shù)⑶44+或/和EpCAM+的細(xì) 胞比例。一般地，按上述的共培養(yǎng)方法，培養(yǎng)到兩周左右，將增強(qiáng)人肝祖先細(xì)胞的對(duì)稱分裂 或自我更新，同時(shí)降低不對(duì)稱分裂或分化，能使人肝祖先細(xì)胞的數(shù)量增加5到20倍。
經(jīng)本體外擴(kuò)增及制備人肝祖先細(xì)胞的方法上述方法分離純化的人肝祖先細(xì)胞能 用標(biāo)準(zhǔn)冷凍保存方法在液氮中保存。冷凍保存培養(yǎng)基包含75%上述的無(wú)血清的培養(yǎng)基、 10%成人AB型血清或人血清白蛋白和15%二甲亞砜。該冷凍保存的人肝祖先細(xì)胞經(jīng)解凍 后，按上述的共培養(yǎng)方法培養(yǎng)仍然存活，仍能自我更新能力和形成克隆。
當(dāng)在上述的共培養(yǎng)條件下和在無(wú)血清的培養(yǎng)基中添加IO-7M地塞米松 (dexamethasone)、2ng/ml重組的人胰高血糖素(glycogen)，5ng/ml重組的人成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子4(FGF4)、5ng/ml重組的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和lOng/ml重組的人抑瘤素 (oncostatinM)時(shí)，人肝祖先細(xì)胞可在體外分化培養(yǎng)條件下分化為甲胎蛋白陰性、白蛋白陽(yáng) 性的成熟樣的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
經(jīng)本發(fā)明制備純化的人肝祖先細(xì)胞一方面可直接移植到病人組織或器官中，最好是病人的肝臟中。在病人的肝臟中，該擴(kuò)增后的人肝祖先細(xì)胞將在肝中分化為成熟肝實(shí)質(zhì) 細(xì)胞；另一方面，在人纖維蛋白膠上的該共培養(yǎng)物，不經(jīng)降解和純化也可直接應(yīng)用于人工肝 支持系統(tǒng)、藥物篩選中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)平臺(tái)、肝炎病毒感染及藥物篩選平臺(tái)。
盡管發(fā)明人在此公開了最適宜的人肝祖先細(xì)胞擴(kuò)增方法，本發(fā)明的范圍不只僅僅 限于下述所提供的特述的實(shí)例。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的變通方法也可被仔細(xì)考慮用來擴(kuò)增人 肝祖先細(xì)胞。
本發(fā)明中，除特別注明外，所有的化合物、培養(yǎng)基、抗體、生長(zhǎng)因子以及組合物均購(gòu) 自Sigma公司。
實(shí)例1人纖維蛋白膠的制備
在含有3 5mg/ml人纖維蛋白原(上海新興醫(yī)藥，中國(guó))的M199培養(yǎng)基中，加入 凝血酶(上海新興醫(yī)藥，中國(guó))至終濃度為0. 02單位/ml。很快地在六孔板的一個(gè)孔內(nèi)加 入0.5至2ml的上述溶液以覆蓋整個(gè)孔。將該六孔板置于37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在人纖維 蛋白原被降解至少兩小時(shí)后，加入抑肽酶(aprotinin)(杭州澳亞，中國(guó))到無(wú)血清培養(yǎng)基 至終濃度為20單位/ml，來抑制凝血酶活性至少兩小時(shí)。該制備的人纖維蛋白膠可密封置 于4°C長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。?dāng)人纖維蛋白膠和其他的胞外基質(zhì)(如與層粘連蛋白、纖維粘連蛋 白或兩者)共同使用時(shí)，可先加入到人纖維蛋白原的M199培養(yǎng)基中，然后加入凝血酶降解。 如果使用含膠原蛋白III或IV等酸性的溶液，該溶液可加入到人纖維蛋白原的DMEM/F12K 培養(yǎng)基中，并用0. IN NaOH調(diào)節(jié)pH至中性(pH7. 0_7. 4)，然后加入凝血酶降解。
當(dāng)制備聚乙二醇化的人纖維蛋白膠時(shí)，先制備聚乙二醇化的人纖維蛋白原“7)，再 用如上的人纖維蛋白膠的制備法制備聚乙二醇化的人纖維蛋白膠。簡(jiǎn)單地，聚乙二醇化的 人纖維蛋白原可按如下的方法制備將單甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸鹽(Meth oxy-poly (ethyleneglycol)-nitrophenyl carbonate，NC_mPEG，平均分子量:5kDa)或聚乙 ^If 雙石肖基苯基碳酸鹽(nitrophenyl carbonate-poly(ethyleneglycol)-nitr ophenyl carbonate, NPC-PEG-NPC，平均分子量3. 4kDa) (Nektar, San Carlos, CA，美 國(guó))同人纖維蛋白原(MW :340kDa)以2 1摩爾比混合在TBS緩沖鹽中(0. 05M Tris-HCl, 0.138M NaCl,0. 0027M KCl ；pH7. 8)，并置于37°C至少1個(gè)小時(shí)，其中的人纖維蛋白原的終 濃度為3 5mg/ml。為了將以上聚乙二醇修飾的人纖維蛋白原降解為人纖維蛋白膠，加入 凝血酶至終濃度為0. 02單位/ml，并置于37°C過夜降解。之后，用IX磷酸鹽(PBQ緩沖 液清洗聚乙二醇化的人纖維蛋白膠六次，以去除多余的單甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸鹽或 聚乙二醇雙硝基苯基碳酸鹽。加入含有終濃度為20單位/ml抑肽酶的無(wú)血清培養(yǎng)基至六 孔板的一個(gè)孔內(nèi)，來抑制凝血酶活性至少兩小時(shí)。該制備的人纖維蛋白膠可密封置于4°C長(zhǎng) 期保存?zhèn)溆谩?br>實(shí)例2在人纖維蛋白膠上共培養(yǎng)人胎肝祖先細(xì)胞和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞
按文獻(xiàn)報(bào)道的方法，將16 22周妊娠齡的胎兒肝或成人肝臟，經(jīng)預(yù)熱的含0. 2mg/ ml脫氧核糖核酸酶I和0. 膠原酶H或120μ g/ml高度純化的膠原蛋白酶liberase Blendzyme 3 (Roche Applied Sciences，美國(guó))Hank，s 緩沖液(含Ca2+和Mg2+離子的Hank，s Balanced Salt Solution)降解，制備為人肝臟單細(xì)胞懸液。富含EpCAM+或/和CD44+但 CD45_、NCAM_、HLA_a 的人胎肝祖先細(xì)胞可用khmelzer等描述的方法經(jīng)FACS或免疫磁珠分 選技術(shù)分離純化(16)，或用Dan等(17)、Herraza等(18)、Turner等(19)描述的方法被富集。為了增加人胎肝祖先細(xì)胞的純度，以上分離純化的人胎肝祖先細(xì)胞(CD44+或/和EpCAM+)可 經(jīng)FACS分選技術(shù)再分離純化一次。在共培養(yǎng)前，低代次的人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞被先置 于無(wú)血清的培養(yǎng)基中適應(yīng)培養(yǎng)至少一代。在一個(gè)典型的共培養(yǎng)例子中，將2X105個(gè)人胎肝 祖先細(xì)胞和5X IO4個(gè)人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)加入無(wú) 血清的培養(yǎng)基中，置于人纖維蛋白膠的表面上過夜培養(yǎng)。第二天，更換新鮮的培養(yǎng)基。上述 的人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量可以在IX IO4 4X IO5的范圍內(nèi)變動(dòng)。一個(gè)良好的技術(shù) 人員可改變?nèi)搜軆?nèi)皮細(xì)胞和人胎肝祖先細(xì)胞兩者的比例和數(shù)量等來最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。在 不同的時(shí)間點(diǎn)，相差顯微鏡下觀察照相和計(jì)數(shù)細(xì)胞集落的數(shù)量。一個(gè)典型的人胎肝祖先細(xì) 胞集落在形態(tài)上可定義為10個(gè)以上緊密相連的、有完整的邊緣的一群細(xì)胞。每2 3天更 換共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基一次并收集培養(yǎng)上清液。上清液中的白蛋白和甲胎蛋白含量用標(biāo)準(zhǔn)的 白蛋白(羅氏診斷，中國(guó))和甲胎蛋白(廣州萬(wàn)孚，中國(guó))夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè) 定。由圖IA可以看出，經(jīng)共培養(yǎng)3天后，單個(gè)的人胎肝祖先細(xì)胞集落清析可見；6天后，人胎 肝祖先細(xì)胞集落變大但邊緣清析，并被人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞包圍；9天后，位于孔中央 的大的細(xì)胞集落之間開始接觸；15天后，細(xì)胞集落之間相互接觸，單個(gè)細(xì)胞集落不易于分 辨。盡管單獨(dú)培養(yǎng)的人胎肝祖先細(xì)胞也能在人纖維蛋白膠上形成人肝祖先細(xì)胞集落，但是， 在不同的時(shí)間點(diǎn)，其細(xì)胞集落數(shù)比共培養(yǎng)條件的人肝祖先細(xì)胞集落數(shù)少將近至少一倍(圖 1B)。在不同的時(shí)間點(diǎn)上，共培養(yǎng)條件下的人肝祖先細(xì)胞比單獨(dú)培養(yǎng)的人胎肝祖先細(xì)胞分泌 更多的白蛋白(圖1C)和甲胎蛋白(圖1D)。在另一組人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng) 的對(duì)照中，人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞不分泌白蛋白和甲胎蛋白。這一結(jié)果表明在人纖維蛋 白膠上共培養(yǎng)人胎兒肝祖先細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞，比單獨(dú)在人纖維蛋白膠上培養(yǎng)人胎兒 肝祖先細(xì)胞，能顯著地增強(qiáng)人胎兒肝祖先細(xì)胞集落的形成、白蛋白和甲胎蛋白的分泌。相同 的共培養(yǎng)試驗(yàn)已經(jīng)重復(fù)至少三次，每次使用不同批次的人胎肝祖先細(xì)胞。以上的結(jié)果僅代 表其中的一個(gè)典型批次的結(jié)果。
實(shí)例3從人胎肝祖先細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)物中制備人肝祖先細(xì)胞
用IX磷酸鹽(PBQ緩沖液清洗人胎肝祖先細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)物 兩次后，加入0. 5ml含有0. 1 %膠原酶H或120 μ g/ml高度純化的膠原蛋白酶Iiberase Blendzyme 3 (Roche Applied Sciences，美國(guó))的 Hank，s 緩沖液(含 Ca2+和 Mg2+離子的 Hank's Balanced Salt Solution)到每個(gè)孔中，于37°C降解1 4分鐘并伴有輕微的搖 動(dòng)，直到大部份的培養(yǎng)物脫離人纖維蛋白膠的表面，另外加入anl Hank’ s緩沖液到每個(gè)孔 中，收集培養(yǎng)物到無(wú)菌管中，低速離心(IOOXg) 10分鐘沉淀細(xì)胞培養(yǎng)物。將該細(xì)胞沉淀物 懸浮在不含Ca2+和Mg2+離子的Hank’ s緩沖液中，加入等體積的胰蛋白酶-EDTA至終濃度 為ImM EDTA、2. 5mg/ml胰蛋白酶，于10°C或室溫下消化細(xì)胞培養(yǎng)物1 5分鐘，并伴有輕 微的搖動(dòng)至白色的絮狀物出現(xiàn)，加入4倍體積的冷的含5%成人血清的DMEM/FUK培養(yǎng)基 或胰蛋白酶抑制劑來中和胰蛋白酶的活性。離心(300Xg) 10分鐘沉淀消化的細(xì)胞培養(yǎng)物。 將沉淀的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮在含有5mg/ml中性蛋白酶-分散酶(dispase)的Hank’ s緩沖 液(含Ca2+和Mg2+離子)中，并慢慢加入lmg/ml脫氧核糖核酸酶I (DNaseI)至白色的絮狀 物消失和細(xì)胞被釋放。加入2倍體積的冷的含5%成人血清的DMEM/FUK培養(yǎng)基到降解物 中，經(jīng)40微米的濾網(wǎng)除去未消化的培養(yǎng)物，濾液經(jīng)離心(300Xg) 10分鐘沉淀。沉淀的細(xì)胞 懸浮在含有0. 1 %牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS緩沖液(不含Ca2+和Mg2+離子)中，至濃度為2X IO7個(gè)細(xì)胞/100 μ 1。在80 μ 1細(xì)胞懸液中加入20 μ 1 EpCAM軛偶連的磁 性小球(Miltenyi biotech，CA，美國(guó))，置于4°C 15分鐘，富含人肝祖先細(xì)胞的EpCAM+細(xì)胞 用MiniMACS或AutoMACS (Miltenyibiotec，CA，美國(guó))經(jīng)生產(chǎn)商描述的方法分離純化?；蛴?DYNAL CELLection Epithelial Enrich 試劑盒 Qnvitrogen, CA，美國(guó))描述的方法分離純 化。細(xì)胞懸液中CD44+或/和EpCAM+的細(xì)胞也可經(jīng)FACS (FACSstar，BD Pharmingin，美國(guó))分 離純化。簡(jiǎn)單地，加入熒光染色劑PerCP-Cy5. 5軛偶連的鼠抗人EpCAM單克隆抗體(1:100， BD Pharmingin)或/和熒光染色劑FITC軛偶連的鼠抗人CD44 (1 100，BD Pharmingin)至 細(xì)胞懸液中，⑶44+或/和EpCAM+的細(xì)胞被分選純化。同時(shí)，PerCP-Cy5. 5軛偶連的鼠IgGl 或/和FITC軛偶連的鼠IgGl作為對(duì)照。高度純化的人肝祖先細(xì)胞可經(jīng)再次熒光活化細(xì)胞 分選或免疫磁珠分選技術(shù)分離純化而得到。
另外，需要說明的時(shí)，并不是每代經(jīng)共培養(yǎng)擴(kuò)增的人胎肝祖先細(xì)胞都需要制備為 單細(xì)胞懸浮液才能傳代。當(dāng)共培養(yǎng)物中的CD44+或/和EpCAM+細(xì)胞的比例大于50%時(shí)，該 共培養(yǎng)物經(jīng)0. 膠原酶H或120 μ g/ml高度純化的膠原蛋白酶liberase Blendzyme3簡(jiǎn) 短降解，離心收集和清洗含內(nèi)皮細(xì)胞和人胎肝祖先細(xì)胞的共培養(yǎng)物。按1:2或1:3比例可 成功地傳代培養(yǎng)該共培養(yǎng)物。直到共培養(yǎng)物中的CD44+或/和EpCAM+細(xì)胞的比例低于50 % 時(shí)，應(yīng)用上述的單細(xì)胞制備技術(shù)分離純化CD44+或/和EpCAM+的細(xì)胞，再繼續(xù)經(jīng)共培養(yǎng)擴(kuò)增 及傳代。
實(shí)例4人內(nèi)皮細(xì)胞最優(yōu)化地增強(qiáng)人胎肝祖先細(xì)胞的擴(kuò)增
為了比較不同種類的細(xì)胞對(duì)擴(kuò)增EpCAM+細(xì)胞的影響，將2X IO5個(gè)人胎肝祖先細(xì) 胞，同生長(zhǎng)停止的鼠胚胎纖維母細(xì)胞(mSTO)、人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、成人皮膚 成纖維細(xì)胞(human adult skin fibroblast, HASF)(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)、 成人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(HLSEC)、成人肝星狀細(xì)胞(HSTC)、成人肝膽管細(xì)胞(HBDC) (ScienCell ResearchLaboratories，美國(guó))和經(jīng)培養(yǎng)后第三代人胎肝EpCAM—(陰性)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞 組分(human fetal liver non-parenchymal cell，HFNPC)等各 1 X IO5 個(gè)細(xì)胞分別共培養(yǎng) 在人纖維蛋白膠上。在另一組試驗(yàn)中，將等數(shù)量的成人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(HLSEC)、成人肝星狀 細(xì)胞(HSTC)和成人肝膽管細(xì)胞(HBDC)等細(xì)胞混合后，構(gòu)成成人肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞混合物。按上 述的方法同人胎兒肝祖先細(xì)胞共培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)，每三天收集共培養(yǎng)物的上清液，簡(jiǎn) 單的離心后保存在-80°C用于ELISA。在共培養(yǎng)兩周后，共培養(yǎng)物按實(shí)例3的方法被制成單 細(xì)胞懸液。首先，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每組共培養(yǎng)物中總的細(xì)胞數(shù)，每組共培養(yǎng)物中的EpCAM+ 細(xì)胞的百分比例經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。簡(jiǎn)單地，在200μ 1含2X106個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液中， 加入2 μ lPerp-Cy5. 5軛偶連的鼠抗人EpCAM單克隆抗體(BD Pharmingin,中國(guó))，反應(yīng)液 置于4°C 45分鐘，簡(jiǎn)單的離心清洗后，懸浮在PBS緩沖液中。一個(gè)Perp-Cy5. 5軛偶連的鼠 IgGl被作為熒光染色試驗(yàn)的對(duì)照。在熒光活化細(xì)胞分選儀(FACSstar，BD Wiarmingin，中 國(guó))上，用Cellquest軟件(BDPharmingin)分析EpCAM+細(xì)胞的比例。由圖2A可以看出，當(dāng) 人肝祖先細(xì)胞和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)兩周時(shí)，導(dǎo)致EpCAM+細(xì)胞 分別占細(xì)胞總數(shù)的68. 5%或53. 8%。這一比例遠(yuǎn)高于其它的共培養(yǎng)組合，例如，和生長(zhǎng)停 止的鼠胚胎纖維母細(xì)胞、成人皮膚成纖維細(xì)胞、成人肝星狀細(xì)胞、成人肝膽管細(xì)胞和人胎肝 EpCA
的細(xì)胞組分等的共培養(yǎng)。有趣的是，由等數(shù)量的成人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、成人肝星狀細(xì)胞 和成人肝膽管細(xì)胞混合構(gòu)成的成人肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞混合物的共培養(yǎng)，導(dǎo)致EpCAM+細(xì)胞占細(xì)胞13總數(shù)的21. 6%，這明顯高于成人肝星狀細(xì)胞及成人肝膽管細(xì)胞等單個(gè)共培養(yǎng)時(shí)EpCAM+的細(xì) 胞的比例(3. 3%和7. 1%)，但低于成人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)的比例(53.8%)。同人胎肝祖先細(xì) 胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，將人胎肝祖先細(xì)胞和生長(zhǎng)停止的鼠胚胎纖維母細(xì)胞、成人皮膚成纖維細(xì) 胞及人胎肝EpCAif的細(xì)胞組分等共培養(yǎng)，并不能顯著地增強(qiáng)人胎肝祖先細(xì)胞組分的比例。 當(dāng)將每組EpCAM+細(xì)胞的比例乘以相應(yīng)組的細(xì)胞總數(shù)，就能推測(cè)出相應(yīng)共培養(yǎng)組中EpCAM+細(xì) 胞的數(shù)量。與起始培養(yǎng)時(shí)的人肝祖先細(xì)胞數(shù)量相比，人胎肝祖先細(xì)胞和人臍帶靜脈血管內(nèi) 皮細(xì)胞或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)導(dǎo)致近9倍或8倍的增加(圖2B)，但其他的共培養(yǎng)組僅有 少于1倍的增加。這表明和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)能增強(qiáng)人胎肝 祖先細(xì)胞的自我更新，降低其分化。圖2C和2D更進(jìn)一步表明和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的人胎肝祖先細(xì)胞，比其他的共培養(yǎng)條件下的人胎肝祖先細(xì)胞分泌 更多的白蛋白和甲胎蛋白。在單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中，例如，生長(zhǎng)停止的鼠胚胎纖維母細(xì) 胞、人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、成人皮膚成纖維細(xì)胞、成人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、成人肝星狀細(xì)胞、 成人肝膽管細(xì)胞、人胎肝EpCAM_(陰性)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞組分、及成人肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞混合 物等，它們均不分泌白蛋白和甲胎蛋白。因此，同其它的非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞相比，內(nèi)皮細(xì)胞最優(yōu) 化地增強(qiáng)人肝祖先細(xì)胞的自我更新。相同的試驗(yàn)已經(jīng)重復(fù)至少三次，每次使用不同批次的 人胎肝祖先細(xì)胞。以上的結(jié)果僅代表其中的一個(gè)典型批次的結(jié)果。
實(shí)例5人胎肝祖先細(xì)胞的低溫保存、復(fù)蘇及傳代
按實(shí)例3描述的方法，將從共培養(yǎng)物中分離純化的第八代5 X IO6個(gè)EpCAM+的人肝 祖先細(xì)胞，懸浮在由75%無(wú)血清培養(yǎng)基、15%二甲亞砜(DMSO)和10%成人血清(AB型)組 成的凍存液中，移至2ml凍存管中。先將其置于NalgeneTMCry0rC冷凍容器中在4°C 1小時(shí)， 然后轉(zhuǎn)移到_80°C過夜，最后置于液氮中長(zhǎng)期保存。該凍存的細(xì)胞也可經(jīng)下面的步驟活化。 將凍存的細(xì)胞很快置于37°C，直到完全凍融。然后緩緩加入IOml經(jīng)預(yù)熱至37°C的含90% 無(wú)血清培養(yǎng)基及10%成人血清(AB型)的培養(yǎng)基中并伴有很輕微的振動(dòng)，這一個(gè)過程將化 費(fèi)10 15分鐘。經(jīng)IOOXg離心10分鐘去除含二甲亞砜的上清液后，將4X IO5個(gè)活的人 肝祖先細(xì)胞懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)中，和5 X IO4人血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)在人纖維蛋白膠上。經(jīng) 培養(yǎng)兩周后，在相差顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)人肝祖先細(xì)胞集落的數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫保存 的人肝祖先細(xì)胞仍能形成克隆(12士3個(gè)/每孔)，并分泌高水平白蛋白(9810士 120ng/ml) 和甲胎蛋白(321 士62ng/ml)。盡管低溫保存的人肝祖先細(xì)胞的克隆形成能力(12士3個(gè)/ 每孔)低于原代的人肝祖先細(xì)胞的能力(21 士4個(gè)/每孔)，但低溫保存的人胎肝祖先細(xì)胞 的白蛋白分泌水平仍和原代的人胎肝祖先細(xì)胞可比。這些結(jié)果表明經(jīng)共培養(yǎng)制備的人胎肝 祖先細(xì)胞仍能低溫保存、并復(fù)蘇及傳代。
實(shí)例6在共培養(yǎng)條件下，人胎肝祖先細(xì)胞可分化為成熟樣的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞
當(dāng)在共培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)物中添加分化因子時(shí)，人胎肝祖先細(xì)胞可在體外分化為 成熟的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。簡(jiǎn)單地，在第三代含人胎肝祖先細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入 10_7mM地塞米松、5ng/ml重組的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5ng/ml重組的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 4(FGF4)、2ng/ml重組的人胰高血糖素和lOng/ml重組的人抑瘤素，在無(wú)血清的培養(yǎng)基中共 培養(yǎng)12天，每3天收集培養(yǎng)上清液并更換新鮮培養(yǎng)基。ELISA分析表明該培養(yǎng)物在第12天 分泌高水平的白蛋白(1210士98ng/ml)，但基礎(chǔ)水平的甲胎蛋白陰性(M士21ng/ml)。這表 明在此分化培養(yǎng)條件下的人胎肝祖先細(xì)胞已失去了肝祖先細(xì)胞的特性，而分化為成熟樣的人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
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權(quán)利要求
1.一種體外培養(yǎng)擴(kuò)增傳代的人肝祖先細(xì)胞的制備方法，該方法包括a、分離人肝祖先 細(xì)胞；b、在含有人纖維蛋白膠的胞外基質(zhì)上，用無(wú)血清的培養(yǎng)基共培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞和步驟a 分離到的人肝祖先細(xì)胞，擴(kuò)增得到人肝祖先細(xì)胞集落；所述的人肝祖先細(xì)胞，包括人肝祖先細(xì)胞、肝母細(xì)胞或卵圓細(xì)胞；步驟b中所述的飼養(yǎng)細(xì)胞為人內(nèi)皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其還包括步驟C、利用單細(xì)胞制備方法，將步驟b得到 的人肝祖先細(xì)胞集落制備成單細(xì)胞懸液，進(jìn)一步分離純化人肝祖先細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，步驟c所述的單細(xì)胞制備方法包括(a)將步驟b得到的人肝祖先細(xì)胞集落用膠原酶Collagenase或高度純化的膠原酶 liberase bIendzyme 3，或者其中之一與透明質(zhì)酸酶或其他的中性蛋白酶的混合，酶解不 超過4分鐘，收集培養(yǎng)物；(b)將步驟(a)的培養(yǎng)物，用胰蛋白酶或Accutase消化，在不超過室溫條件下，消化時(shí) 間不超過5分鐘，收集細(xì)胞培養(yǎng)物；(c)將步驟(b)的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮于含分散酶的緩沖液中，再加入脫氧核糖核酸酶I， 至白色絮狀物消失和細(xì)胞釋放，過濾、沉淀、收集沉淀細(xì)胞、加入緩沖液，得到單細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，所述的人肝祖先細(xì)胞，來源于人肝組織或人胰臟、骨 髓，或人臍帶血、人脂肪組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，所述的人纖維蛋白膠是通過凝血酶作用于人纖維蛋白 原或經(jīng)聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白原而制備的降解物。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，所述培養(yǎng)基是無(wú)血清的合成培養(yǎng)基，其含有碳水化合 物代謝調(diào)解劑、轉(zhuǎn)鐵蛋白組合物、高濃度的核苷組合物、肝素鈉、抗氧化物、人表皮細(xì)胞生長(zhǎng) 因子EGF、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF和人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，人內(nèi)皮細(xì)胞是人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或/和人肝竇 內(nèi)皮細(xì)胞，或/和其他的內(nèi)皮細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，所述擴(kuò)增的人肝祖先細(xì)胞可傳代培養(yǎng)至少10代。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種體外擴(kuò)增傳代的人肝祖先細(xì)胞(human hepaticprogenitor cell)的制備方法，該方法包括a、分離人肝祖先細(xì)胞；b、在含有人纖維蛋白膠或其類似物的胞外基質(zhì)上，用無(wú)血清的培養(yǎng)基共培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞和步驟a分離到的人肝祖先細(xì)胞，擴(kuò)增得到人肝祖先細(xì)胞集落。該人肝祖先細(xì)胞集落，經(jīng)膠原酶簡(jiǎn)單的處理，易于脫離人纖維蛋白膠的表面，經(jīng)更進(jìn)一步的酶降解等單細(xì)胞制備技術(shù)處理，人肝祖先細(xì)胞可被分離純化或/和傳代培養(yǎng)。本發(fā)明制備的人肝祖先細(xì)胞為肝細(xì)胞治療，包括肝細(xì)胞移植和生物人工肝支持系統(tǒng)，藥物篩選中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)平臺(tái)，肝炎病毒感染及藥物篩選平臺(tái)等提供良好的人肝細(xì)胞來源。
文檔編號(hào)C12N5/0735GKCN101275121 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710048724
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2007年3月26日
發(fā)明者蘆銀雪 申請(qǐng)人:蘆銀雪導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (5), 非專利引用 (1),