專(zhuān)利名稱(chēng)：:一種dna的熒光檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，特別涉及一種DNA的熒光檢測(cè)方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：基因(DNA或RNA)是遺傳信息的載體，在生物的個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異等生命過(guò)程中起著極為重要的作用?；驒z測(cè)在臨床診斷、單核苷酸多態(tài)性分析、基因測(cè)序、環(huán)境分析、反控等領(lǐng)域具有重要的意義。隨著人們對(duì)自身健康的日益關(guān)注，對(duì)腫瘤、癌癥等重大疾病早期診斷技術(shù)的要求也越來(lái)越高，因此迫切需要發(fā)展高靈敏度的基因檢測(cè)技術(shù)?；蛲蛔兪菃魏塑账岫鄳B(tài)性的形式之一，與多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，最新研究表明，有四百多種疾病的發(fā)生與基因突變有關(guān)。為了在發(fā)病早期就能檢測(cè)到極微量致病基因的存在，常常需要對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增或采用其它形式的信號(hào)放大方法，如納米金放大、共軛高分子放大、酶聯(lián)放大等(L.Pang，J.Li，J.Jiang，G.Shen，R.Yu，Anal.Biochem.2006，358，99;D.Q.Tang，D.J.Zhang，D.Y.Tang，H.Ai，J.Immunol.Methods2006，316，144;X.Yao，X.Li，F(xiàn).Toledo,C.Zurita-Lopez，M.Gutova，J.Momand，F(xiàn).Zhou，Anal.Biochem.2006，354，220)。本申請(qǐng)人公開(kāi)號(hào)為CN1808101A的專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)了一種DNA的熒光檢測(cè)方法及其試劑盒，該檢測(cè)方法包括利用連接于磁性顆粒上的捕獲探針將待檢DNA從生物樣品中進(jìn)行磁性富集和分離；然后加入熒光基團(tuán)(FAM)標(biāo)記的信號(hào)探針，使磁性分離和富集后的待檢DNA與信號(hào)探針雜交配對(duì)，并用低鹽緩沖液洗滌；再加入水溶性導(dǎo)電高分子材料，即共軛高分子(如聚芴衍生物PF)實(shí)現(xiàn)信號(hào)倍增，用該導(dǎo)電高分子材料的激發(fā)波長(zhǎng)作熒光光譜，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測(cè)方法檢測(cè)分析出待檢DNA。該方法具有較高的特異度和敏感度。但是，一方面低鹽洗滌的過(guò)程會(huì)增加操作的步驟，延長(zhǎng)反應(yīng)和檢測(cè)時(shí)間；另一方面，低鹽溶液也會(huì)使完全互補(bǔ)的雙鏈DNA部分解鏈，從而使互補(bǔ)與突變的可區(qū)分性減小，即會(huì)降低對(duì)突變的選擇性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種選擇性更佳的DNA的熒光檢測(cè)方法，而且該方法靈敏度高，無(wú)需擴(kuò)增，操作快速簡(jiǎn)便，綜合性能高。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種采用上述DNA的檢測(cè)方法的試劑盒。[0006]本發(fā)明人在上述CN1808101A公開(kāi)的技術(shù)方案基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)采用競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，磁性顆粒對(duì)靶向DNA的富集、分離，以及水溶性共軛高分子與熒光基團(tuán)之間的FRET技術(shù)相結(jié)合，可以大大提高DNA檢測(cè)的特異度和靈敏度，縮短了反應(yīng)時(shí)間，綜合性能更佳，特別可用于基因及突變基因的檢測(cè)，更有希望應(yīng)用于一些與基因突變有關(guān)的病癥，如腫瘤的診斷。其中，競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制是生物檢測(cè)中經(jīng)常采用的一種用于提高選擇性的檢測(cè)方法，如ELISA競(jìng)爭(zhēng)法和競(jìng)爭(zhēng)性PCR等。在基因(DNA)檢測(cè)中，也常采用這種方法。與線性DNA分子相比，莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA探針由于可以形成特定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與其互補(bǔ)的靶向DNA結(jié)合時(shí)具有更窄的融解溫度范圍和更高的選擇性(G.Bonnet,S.Tyagi，A.Libchaber，F(xiàn).Kramer,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，6171)，常用于單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。因此，莖環(huán)結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)探針的引入將會(huì)進(jìn)一步提高DNA生物傳感器的綜合性能。因此，本發(fā)明解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種DNA的熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟1)將捕獲探針連接在磁性顆粒表面；2)加入待測(cè)的靶向DNA和熒光素修飾的信號(hào)探針，該捕獲探針能與靶向DNA的一段核苷酸序列雜交，該信號(hào)探針能與靶向DNA的另一段核苷酸序列雜交，通過(guò)DNA之間的雜交，形成磁性顆粒_靶向DNA-熒光素修飾的信號(hào)探針的三明治夾心結(jié)構(gòu)；3)最后除去游離的熒光素修飾的信號(hào)探針后，加入具有信號(hào)倍增功能的水溶性的共軛高分子，對(duì)該信號(hào)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行放大檢測(cè)，從而檢測(cè)出靶向DNA;其中，步驟2)在雜交時(shí)還加入上述捕獲探針或信號(hào)探針的競(jìng)爭(zhēng)性探針，與靶向DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。優(yōu)選的，所述的捕獲探針可以是莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針，同時(shí)所述的信號(hào)探針是線性DNA探針，所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針無(wú)任何修飾，其序列組成與捕獲探針僅相差一個(gè)堿基。優(yōu)選的，所述的捕獲探針可以是線性DNA探針，同時(shí)所述的信號(hào)探針是莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針，所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針無(wú)任何修飾，其序列組成與信號(hào)探針僅相差一個(gè)堿基。優(yōu)選的，步驟2)中所述的雜交反應(yīng)的溫度可以是29t:39t:，優(yōu)選的是37t:左右。通過(guò)控制反應(yīng)的溫度條件，使磁性顆粒_靶向DNA-熒光素修飾的信號(hào)探針的三明治夾心結(jié)構(gòu)中含有單點(diǎn)突變的雙鏈在此條件下解鏈，成為游離狀態(tài)，而完全互補(bǔ)的雙鏈不受影響。優(yōu)選的，所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針加入的摩爾量可以是被競(jìng)爭(zhēng)探針的17倍，優(yōu)選的是2倍左右。根據(jù)本發(fā)明，步驟1)所說(shuō)的磁性顆粒同現(xiàn)有技術(shù)，如上述CN1808101A中所述，其已被廣泛用于生物活性物質(zhì)的富集、分離、藥物的磁靶向以及疾病的診斷和治療等方面。功能化后的磁性顆粒不僅可以通過(guò)表面的配體(或受體)與受體(或配體)之間的特異相互作用，如親和素-生物素(biotin)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向生物目標(biāo)的快速分離，而且可以作為固相載體用于連接生物分子。與傳統(tǒng)分離方法相比，使用磁性顆粒進(jìn)行分離的速度明顯縮短，在30秒內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)快速分離。此外，利用磁性顆粒可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向物質(zhì)分析時(shí)反應(yīng)與檢測(cè)分開(kāi)進(jìn)行，避免了反應(yīng)體系中其它組分的干擾。本發(fā)明中的磁性顆粒通常選用可市購(gòu)的鏈親和素包覆的微米級(jí)的磁珠(匪Ps)商品，也可以是根據(jù)現(xiàn)有方法合成的直徑為50100nm的磁性納米粒子。當(dāng)采用微米級(jí)的匪Ps時(shí)，為了避免磁珠對(duì)光的散射，在熒光檢測(cè)前通常需使固定在磁珠上的DNA變性解鏈，而所選用的變性解鏈方法可以是常規(guī)方法，如加入NaOH等強(qiáng)堿(具體可參見(jiàn)CN1808101A)。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)中所述的共軛高分子優(yōu)選水溶性聚芴(PF)。本發(fā)明采用微米級(jí)的磁珠匪Ps為例來(lái)說(shuō)明，在含有變性分離下來(lái)的信號(hào)探針的上清液中，加入水溶性的共軛高分子PF再進(jìn)行熒光檢測(cè)，通過(guò)PF與熒光素之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。本發(fā)明解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種DNA熒光檢測(cè)的試劑盒，包括[0019]1)連接于磁性顆粒上的捕獲探針，熒光素修飾的信號(hào)探針；2)上述捕獲探針或信號(hào)探針的競(jìng)爭(zhēng)性探針；3)水溶性聚荷。本發(fā)明引入競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，特別是具有高選擇性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭(zhēng)性探針，提高了DNA檢測(cè)的選擇性；同時(shí)以功能化的磁性顆粒作為磁性顆粒，實(shí)現(xiàn)游離組分的快速分離，進(jìn)一步提高了選擇性。本發(fā)明同時(shí)選擇熒光素修飾的信號(hào)探針，在最后檢測(cè)時(shí)直接加入共軛高分子，通過(guò)其與熒光素之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)信號(hào)倍增。不但提高了DNA檢測(cè)的靈敏度，而且無(wú)需對(duì)信號(hào)探針進(jìn)行擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)便。本發(fā)明可以顯著提高DNA及DNA突變檢測(cè)，特別是基因，如乳腺癌易感基因BRCA1及其突變基因檢測(cè)的選擇性和靈敏度，在生物檢測(cè)、疾病的早期診斷和治療中有著重要的意義。圖1為本發(fā)明引入競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針的DNA檢測(cè)方法的工作原理圖；其中，A為檢測(cè)互補(bǔ)靶向DNA的工作原理圖，B為檢測(cè)突變靶向DNA的工作原理圖。圖2為本發(fā)明引入競(jìng)爭(zhēng)性信號(hào)探針的DNA檢測(cè)方法的工作原理圖；其中，A為檢測(cè)互補(bǔ)靶向DNA的工作原理圖，B為檢測(cè)突變靶向DNA的工作原理圖。圖3為引入競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度為37t:時(shí)靶向DNA(a)和突變靶向DNA(b)的熒光檢測(cè)信號(hào)，耙濃度為lnM。圖4為分別引入兩種競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制反應(yīng)溫度均為37t:時(shí)的靶向DNA和突變靶向DNA的熒光檢測(cè)信號(hào)。a，b分別為引入競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針時(shí)的靶向DNA和突變靶向DNA的熒光檢測(cè)信號(hào)；c，d分別為引入競(jìng)爭(zhēng)性信號(hào)探針時(shí)的靶向DNA和突變靶向DNA的熒光檢測(cè)信號(hào)。具體實(shí)施方式下面用乳腺癌易感基因BRCA1及其突變基因的檢測(cè)為實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于檢測(cè)乳腺癌易感基因及其突變基因，也并不受實(shí)施例中其它條件的限制。以下是部分本發(fā)明實(shí)施例中所用的儀器和設(shè)備，其他未具體注明的實(shí)驗(yàn)條件按照常規(guī)或藥品或以其制造廠商所建議的條件。熒光檢測(cè)所用儀器為熒光分光光度計(jì)(HitachiF-4500，日本)。熒光光譜測(cè)量條件氙燈激發(fā)，激發(fā)和發(fā)射狹峰寬度均為2.5nm，電壓PMT950V，響應(yīng)時(shí)間2S，激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍390-700nm;用3mL石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積lml;室溫。鏈親和素修飾的超順磁性顆粒(magneticmicro-particles，MMPs)購(gòu)于Promega公司，顆粒直徑為l.Oiim左右，固含量為lmg/mL，結(jié)合能力為1.25nmo1探針/mg匪Ps。水溶性共軛高分子為陽(yáng)離子的聚芴衍生物(PF)，根據(jù)文獻(xiàn)(F.Huang，H.Wu，D.Wang，W.Yang，Y.Cao，Chem.Mater.2004，16，708)合成，其結(jié)構(gòu)式如下[0033]其中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br。各種DNA序列如表1所示，均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。表1寡聚核苷酸堿基組成表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>[0037]實(shí)施例所用各種溶液成分如表2所示。表2所用各種溶液成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>[0040]實(shí)施例1如圖1所示，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求，匪Ps在使用前首先用0.5XSSC緩沖液洗滌3次，然后將biotin標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的捕獲探針DNA1加入到含有TTL緩沖液的匪Ps中，輕輕混合約10分鐘。捕獲探針的表面密度約為46X1011鏈/cm2。然后將匪Ps和捕獲探針的復(fù)合物(匪Ps-captureprobe，記為匪Ps-cp1)用TTA緩沖液洗兩次，懸浮于雜交液中，4t:冷藏備用。然后將莖環(huán)結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針DNA2、耙向DNA4(或突變耙向DNA5)和線性信號(hào)探針DNA3的混合物加入到預(yù)先制備好匪Ps-cp1的懸浮液中，其中靶向DNA或突變靶向DNA5的濃度均為lnM，競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針DNA2:捕獲探針DNA1:互補(bǔ)靶向DNA4或突變靶向DNA5:信號(hào)探針DNA3的摩爾濃度比約為2:1:1:2。在37t:反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完畢，磁性分離去除游離組分。然后用洗滌液洗滌35次，直至洗滌得到的分離上清液中無(wú)熒光信號(hào)為止。然后向磁性顆粒復(fù)合物中加入100iiL濃度為50mM的NaOH，室溫變性5分鐘，磁性分離，收集變性上清液，向其中加入等量HCL進(jìn)行中和，再加入200iiL10mMTris-HCl(pH8.0)緩沖溶液禾口400ii1^20進(jìn)行熒光檢測(cè)(Ex:480nm，Em:490-700nm)，最后再加入PF溶液使其終濃度為200nM，進(jìn)行共軛高分子信號(hào)放大的檢測(cè)(Ex:380nm，Em:390700nm)。結(jié)果見(jiàn)圖3。37t:反應(yīng)時(shí)，可以使含有單點(diǎn)突變的DNA雙鏈解離，而完全互補(bǔ)的雙鏈不受影響。二者的信號(hào)比為3.8，具有顯著性差異，因此可以將互補(bǔ)和突變的信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。與現(xiàn)有技術(shù)(CN1808101A專(zhuān)利申請(qǐng))中互補(bǔ)靶向與突變DNA的信號(hào)比為2.2相比，可見(jiàn)本發(fā)明大大提高了DNA檢測(cè)的選擇性。實(shí)施例2參照實(shí)施例1中的條件進(jìn)行反應(yīng)，不同之處在于雜交反應(yīng)的溫度為29°C。結(jié)果是互補(bǔ)靶向與突變DNA的信號(hào)比為2.25。實(shí)施例3參照實(shí)施例1中的條件進(jìn)行反應(yīng)，不同之處在于雜交反應(yīng)的溫度為39°C。結(jié)果是互補(bǔ)靶向與突變DNA的信號(hào)比為2.31。實(shí)施例4參照實(shí)施例1中的條件進(jìn)行反應(yīng)，不同之處在于競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針DNA2:捕獲探針DNA1:互補(bǔ)耙向DNA4或突變耙向DNA5:信號(hào)探針DNA3的摩爾濃度比約為7:1:1:2。結(jié)果是互補(bǔ)靶向與突變DNA的信號(hào)比為2.36。實(shí)施例5參照實(shí)施例1中的條件進(jìn)行反應(yīng)，不同之處在于競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針DNA2:捕獲探針DNA1:互補(bǔ)耙向DNA4或突變耙向DNA5:信號(hào)探針DNA3的摩爾濃度比約為1:1:1:2。結(jié)果是互補(bǔ)靶向與突變DNA的信號(hào)比為2.97。實(shí)施例6參照實(shí)施例1中的條件進(jìn)行反應(yīng)，不同之處在于使用線性捕獲探針DNA6制備匪Ps和捕獲探針的復(fù)合物(匪Ps-captureprobe，記為匪Ps-cp6)，信號(hào)探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA7，競(jìng)爭(zhēng)探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA8，待檢DNA為耙向DNA4或突變耙向DNA9，兩組均在37t:左右反應(yīng)。本實(shí)施例待檢DNA的濃度也為lnM。其它試劑和步驟與實(shí)施例1相同。其反應(yīng)原理如圖2所示。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，對(duì)引入競(jìng)爭(zhēng)性信號(hào)探針的策略而言，信號(hào)探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的形成而使部分堿基對(duì)FAM的猝滅增強(qiáng)，因此FAM的熒光發(fā)射效率較低，與PF之間發(fā)生FRET時(shí)，F(xiàn)RET效率較低。此外，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在產(chǎn)生的空間位阻也是影響其FRET效率的一個(gè)重要因素。結(jié)果表明引入競(jìng)爭(zhēng)性捕獲探針對(duì)單點(diǎn)突變的選擇性更好。這是因?yàn)樵谝敫?jìng)爭(zhēng)性捕獲探針的策略中，信號(hào)探針為線性結(jié)構(gòu)，其自身不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此其熒光發(fā)射效率較高，與PF之間發(fā)生FRET時(shí)，F(xiàn)RET效率較高。權(quán)利要求一種DNA的熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟1)將捕獲探針連接在磁性顆粒表面；2)加入待測(cè)的靶向DNA和熒光素修飾的信號(hào)探針，該捕獲探針能與靶向DNA的一段核苷酸序列雜交，該信號(hào)探針能與靶向DNA的另一段核苷酸序列雜交，通過(guò)DNA之間的雜交，形成磁性顆粒-靶向DNA-熒光素修飾的信號(hào)探針的三明治夾心結(jié)構(gòu)；3)最后除去游離的熒光素修飾的信號(hào)探針后，加入具有信號(hào)倍增功能的水溶性的共軛高分子，該水溶性的共軛高分子是陽(yáng)離子聚芴，對(duì)該信號(hào)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行放大檢測(cè)，從而檢測(cè)出靶向DNA；其特征是步驟2)在雜交時(shí)還加入上述捕獲探針或信號(hào)探針的競(jìng)爭(zhēng)性探針，與靶向DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征是所述的捕獲探針是莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針，所述的信號(hào)探針是線性DNA探針，所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針無(wú)任何修飾，其序列組成與捕獲探針僅相差一個(gè)堿基。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的熒光檢測(cè)方法，其特征是所述的捕獲探針是線性DNA探針，所述的信號(hào)探針是莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針，所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針無(wú)任何修飾，其序列組成與信號(hào)探針僅相差一個(gè)堿基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征是步驟2)中雜交反應(yīng)的溫度是29°C39°C。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光檢測(cè)方法，其特征是所述的雜交反應(yīng)溫度是37°C。6.根據(jù)權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述的熒光檢測(cè)方法，其特征是所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針加入的摩爾量是被競(jìng)爭(zhēng)探針的17倍。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光檢測(cè)方法，其特征是所述的競(jìng)爭(zhēng)性探針加入的摩爾量是被競(jìng)爭(zhēng)探針的2倍。8.—種DNA熒光檢測(cè)的試劑盒，其特征是其包括1)連接于磁性顆粒上的捕獲探針，熒光素修飾的信號(hào)探針；2)上述捕獲探針或信號(hào)探針的競(jìng)爭(zhēng)性探針；3)水溶性聚芴，該水溶性聚芴是陽(yáng)離子聚芴。專(zhuān)利摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種DNA的熒光檢測(cè)方法及其試劑盒。該方法將捕獲探針連接在磁性顆粒表面后通過(guò)DNA之間的雜交捕獲靶向DNA，靶向DNA的另一段核苷酸序列與熒光素修飾的信號(hào)探針雜交，形成磁性顆粒一靶向DNA一熒光標(biāo)記的信號(hào)探針的三明治夾心結(jié)構(gòu)，同時(shí)加入上述的捕獲探針或信號(hào)探針的競(jìng)爭(zhēng)性探針與靶向DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，最后加入具有信號(hào)倍增功能的水溶性的共軛高分子對(duì)信號(hào)放大檢測(cè)，從而檢測(cè)出靶向DNA。本發(fā)明可以顯著提高基因及基因突變檢測(cè)的選擇性和靈敏度，無(wú)需進(jìn)行核酸擴(kuò)增，操作快速簡(jiǎn)便，在生物檢測(cè)、疾病的早期診斷和治療中有著重要的意義。文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN101240329B發(fā)布類(lèi)型授權(quán)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N200710048129公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2007年11月13日發(fā)明者劉興奮,宋世平,李江,樊春海,王麗華申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專(zhuān)利引用(3),非專(zhuān)利引用(1),