背景技術(shù)：
1、很多基于蛋白的療法，包括抗體片段和融合蛋白，在施用后會迅速從機體清除。其循環(huán)半衰期短通常歸因于其尺寸小，這允許通過腎臟過濾進(jìn)行有效清除，缺乏對胞內(nèi)降解的保護(hù)。在這種情況下，需要頻繁施用或長時間輸注以在較長時間段內(nèi)維持藥物的有效濃度。為改善給藥，已采用若干策略來延長循環(huán)半衰期。這些包括通過附接柔性親水性分子(如碳水化合物或peg(聚乙二醇))來增加蛋白的流體力學(xué)半徑，以及通過附接抗體fc結(jié)構(gòu)域或血清白蛋白來利用通過新生兒fc受體(fcrn)的再循環(huán)(konnteman,curr?opinbiotechnol.2011dec；22(6):868-76)。
2、利用fcrn介導(dǎo)的再循環(huán)策略特別有吸引力，因為在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性的風(fēng)險較低，并且可以實現(xiàn)較長的半衰期延長。例如，據(jù)報道，在附接fc結(jié)構(gòu)域后，形式的t細(xì)胞接合雙特異性抗體的半衰期超過200h(lorenczewski等，blood?2017.130(增刊1)，2815)。類似地，據(jù)報道，引入白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的形式的雙特異性抗體具有超過四天的半衰期(wesche等，cancer?res?2018；78(13增刊)：摘要nr?3814)。
3、包含與抗cd3抗體片段融合的可溶性t細(xì)胞受體(tcr)的融合蛋白是一類相對較新的免疫細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)接合雙特異性融合蛋白，其體內(nèi)半衰期在6-8h范圍內(nèi)(sato等，2018j?clin?onc?201836,no.15,增刊9521-9521；middleton等，j?clin?onc?2016?34,no.15,增刊3016-3016)。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)單克隆抗體，后者的半衰期通常在260-720小時范圍內(nèi)(ovacik&lin,2018clin?transl?sci,11:540)。此外，tcr-抗cd3融合蛋白已展現(xiàn)出有利的治療性質(zhì)，包括皮摩爾效力(lowe等，2019cancer?treatment?reviews,vol.77?35-43)。因此，需要鑒定延長tcr-免疫細(xì)胞接合結(jié)構(gòu)域融合蛋白，如tcr-抗cd3融合蛋白和其他含tcr蛋白半衰期的適宜方法，以降低給藥頻率，并在長時間內(nèi)保持有效濃度，而不影響其他治療性質(zhì)。
4、與傳統(tǒng)抗體不同，tcr被設(shè)計為識別來源于細(xì)胞內(nèi)抗原并由人白細(xì)胞抗原(肽-hla)呈遞在細(xì)胞表面的短肽?？乖蔬f細(xì)胞上的肽hla復(fù)合物與t細(xì)胞等免疫細(xì)胞上的相應(yīng)受體之間的有效免疫突觸形成依賴于例如精心設(shè)計的相互作用，這些相互作用可能會受到膜間距離增加的干擾(choudhuri等，2005nature?jul28；436(7050):578-82；holland等，jclin?invest.2020；130(5):2673-2688)。因此，增加含tcr蛋白的半衰期的融合方法，如附接抗體fc結(jié)構(gòu)域或血清白蛋白，由于干擾tcr結(jié)合所需的相互作用幾何結(jié)構(gòu)的風(fēng)險而具有高度挑戰(zhàn)性。類似的挑戰(zhàn)也適用于含有與肽-hla復(fù)合物結(jié)合的抗體的融合蛋白，將這些抗體稱為tcr樣或tcr模擬抗體。
5、wo?2020/157211描述了一種通過將tcr-抗cd3融合蛋白融合到免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域或白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域來延長tcr-抗cd3融合蛋白半衰期的方法。然而，這種多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子是大且復(fù)雜的蛋白，因而存在多種可能的形式，即每個結(jié)構(gòu)域(及每個結(jié)構(gòu)域中的每個區(qū))在一個或多個多肽鏈上的位置和取向的可能組合。在分子中每個結(jié)構(gòu)域(及其區(qū))的位置和取向以及所存在的多肽鏈的數(shù)量可能影響結(jié)合分子的特征，如活性、半衰期和可制備性。因此，仍需要鑒定此類多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的有利形式。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明一般地涉及多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子。本發(fā)明特別地涉及多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其包含i)肽-主要組織相容性復(fù)合物(pmhc)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含與恒定區(qū)連接的第一可變區(qū)(vc1)和與恒定區(qū)連接的第二可變區(qū)(vc2)；ii)免疫細(xì)胞接合(ice)結(jié)構(gòu)域(如t細(xì)胞接合免疫效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)，其包含例如抗體輕鏈可變區(qū)(tce-vl)和抗體重鏈可變區(qū)(tce-vh)；以及iii)半衰期延長結(jié)構(gòu)域，其包含第一igg?fc區(qū)(fc1)和第二igg?fc區(qū)(fc2)，其中所述fc1區(qū)和所述fc2區(qū)二聚化以形成fc結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)合分子能夠用于治療疾病，如癌癥、感染性疾病和自身免疫性疾病。
1.一種多結(jié)構(gòu)域單鏈結(jié)合分子，其包含：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述免疫細(xì)胞接合結(jié)構(gòu)域包含：
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述免疫細(xì)胞是t細(xì)胞且所述免疫細(xì)胞接合結(jié)構(gòu)域選自：
4.一種多結(jié)構(gòu)域單鏈結(jié)合分子，其包含：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述t細(xì)胞接合免疫效應(yīng)子是scfv。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中vc1包含所述tcrβ可變和恒定區(qū)且vc2包含所述tcrα可變和恒定區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的或者從屬于權(quán)利要求4的權(quán)利要求5至8中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述tce-vl區(qū)通過其c末端連接至所述tce-vh區(qū)的n末端且所述tce-vh區(qū)通過其c末端連接至vc1的n末端。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述免疫細(xì)胞接合結(jié)構(gòu)域或所述t細(xì)胞接合免疫效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是cd3效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其通過與cd3和/或tcr/cd3復(fù)合物的相互作用活化t細(xì)胞。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述免疫細(xì)胞接合結(jié)構(gòu)域或所述t細(xì)胞接合免疫效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是抗cd3?scfv。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述pmhc結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合與mhc復(fù)合的腫瘤相關(guān)抗原肽。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述ice、所述tce-vh、所述tce-vl、所述vc1、所述vc2、所述fc1和所述fc2區(qū)的兩個或更多個通過接頭和/或igg鉸鏈序列彼此連接。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中一個或多個所述接頭具有選自以下的序列：ggggs(seq?id?no:18)、gggsg(seq?id?no:20)、ggsgg(seq?id?no:21)、gsggg(seq?id?no:22)、gsgggp(seq?id?no:23)、ggeps(seq?id?no:24)、ggegggp(seq?id?no:25)、ggegggsegggs(seq?id?no:26)、
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中vc1通過包含igg鉸鏈序列的序列連接至所述fc1區(qū)和/或vc2通過包含igg鉸鏈序列的序列連接至所述fc2區(qū)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述igg鉸鏈序列與seq?id?no:44至少80％相同。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中將vc1連接至所述fc1區(qū)的序列還包含甘氨酸-絲氨酸接頭，和/或?qū)c2連接至所述fc2區(qū)的序列還包含甘氨酸-絲氨酸接頭。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述甘氨酸-絲氨酸接頭具有在seq?id?no:47中提供的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求4所述的或者從屬于權(quán)利要求4的權(quán)利要求5至18中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述tce-vl區(qū)通過包含甘氨酸-絲氨酸接頭的序列連接至所述tce-vh區(qū)，任選地其中所述序列在seq?id?no:39中提供。
20.根據(jù)權(quán)利要求4所述的或者從屬于權(quán)利要求4的權(quán)利要求5至19中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述tce-vh區(qū)通過包含甘氨酸-絲氨酸接頭的序列連接至vc1，任選地其中所述序列在seq?id?no:18中提供。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述fc1區(qū)通過包含甘氨酸-絲氨酸接頭的序列連接至vc2，任選地其中所述序列在seq?id?no:47中提供。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述半衰期延長結(jié)構(gòu)域包含促進(jìn)所述fc1區(qū)和所述fc2區(qū)的二聚化的一個或多個氨基酸取代。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中：
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中：
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述半衰期延長結(jié)構(gòu)域包含減弱所述fc結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能的一個或多個氨基酸取代。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述半衰期延長結(jié)構(gòu)域包含一個或多個選自以下的氨基酸取代：s228p、e233p、l234a、l235a、l235e、l235p、g236r、g237a、p238s、f241a、v264a、d265a、h268a、d270a、n297a、n297g、n297q、e318a、k322a、l328r、p329g、p329a、a330s、a330l、p331a和p331s，根據(jù)eu編號方案。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述半衰期延長結(jié)構(gòu)域包含阻止或減少與fcγr的結(jié)合的一個或多個氨基酸取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述fc1區(qū)和/或所述fc2區(qū)包含n297g氨基酸取代，根據(jù)eu編號方案。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述半衰期延長結(jié)構(gòu)域包含促進(jìn)與fcrn的結(jié)合的一個或多個氨基酸取代。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述fc1區(qū)和/或所述fc2區(qū)包含m252y、s254t和t256e氨基酸取代，根據(jù)eu編號方案編號。
31.根據(jù)權(quán)利要求4所述的或者從屬于權(quán)利要求4的權(quán)利要求5至30中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述t細(xì)胞接合免疫效應(yīng)結(jié)構(gòu)域包含：
32.根據(jù)權(quán)利要求4所述的或者從屬于權(quán)利要求4的權(quán)利要求5至31中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述t細(xì)胞接合免疫效應(yīng)結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no:31的序列至少80％相同的vl區(qū)和與seq?id?no:32的序列至少80％相同的vh區(qū)。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中所述fc1區(qū)和所述fc2區(qū)是igg1?fc區(qū)。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其中：
35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，其從n末端至c末端按照以下順序包含下述氨基酸序列：
36.一種核酸，其編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子。
37.一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸。
38.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸或根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體。
39.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的方法，其包括根據(jù)使權(quán)利要求38所述的宿主細(xì)胞保持在用于表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸或根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體的最佳條件下，以及分離所述多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子。
40.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體或者根據(jù)權(quán)利要求38所述的宿主細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體，根據(jù)權(quán)利要求38所述的宿主細(xì)胞或者根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其用作藥物。
42.一種治療方法，其包括向有此需要的患者施用根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項所述的結(jié)合分子，根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體，根據(jù)權(quán)利要求38所述的宿主細(xì)胞或者根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子，根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體，根據(jù)權(quán)利要求38所述的宿主細(xì)胞或者根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其用于治療癌癥、自身免疫性疾病或感染性疾病。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的多結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子、核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或藥物組合物，其中所述癌癥與prame表達(dá)相關(guān)。