本發(fā)明涉及擴增編碼運動神經(jīng)元存活(survival?motor?neuron，smn)1的核酸且不擴增編碼運動神經(jīng)元存活(smn)2的核酸的引物組、含有引物組的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定試劑盒、以及使用引物組的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定方法。

背景技術(shù)：

1、脊髓性肌萎縮癥(spinal?muscular?atrophy;?sma)為由脊髓的運動神經(jīng)細(xì)胞(脊髓前角細(xì)胞)的變性引起的神經(jīng)源性肌萎縮癥，被分類為運動神經(jīng)元病。sma根據(jù)發(fā)病時期、癥狀而分類為多種類型，但出生后6個月內(nèi)發(fā)病的i型容易被漏診且癥狀容易加重。

2、已知幾乎全部sma患者都起因于運動神經(jīng)元存活1(smn1)基因的純合缺失，因此以smn1基因為對象的篩查對于早期發(fā)現(xiàn)sma風(fēng)險而言有效。另外，攜帶smn1基因雜合缺失者的后代有可能發(fā)生純合缺失，因此被稱為攜帶者。篩查也被要求判定是否為sma攜帶者。

3、作為利用pcr等分子生物學(xué)方法來篩查sma的相關(guān)技術(shù)，已知如下技術(shù)：使用由干燥濾紙血液得到的一定尺寸的穿孔片，通過直接實時pcr對穿孔片所含的smn1基因進行特異性檢測和定量的方法和該方法中使用的引物(專利文獻1)；適合于sma篩查的引物組、實時pcr用探針(非專利文獻1～3)等。

4、現(xiàn)有技術(shù)文獻

5、專利文獻

6、專利文獻1：日本專利第6850402號公報

7、非專利文獻

8、非專利文獻1：vill,?katharina?et?al.,?journal?of?neuromusculardiseases,?2019年

9、非專利文獻2：pan,?jianyan?et?al.,?annals?of?laboratory?medicine,?2022年

10、非專利文獻3：feldkotter,?markus?et?al.,?american?journal?of?humangenetics,?2002年

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明所要解決的問題

2、位于smn1基因附近的smn2基因與smn1基因相比僅5個堿基不同，因此，為了sma的篩查，需要構(gòu)建能夠特異且高靈敏度地僅檢測smn1基因的方法。

3、另外，根據(jù)發(fā)明人們調(diào)查的結(jié)果，對于現(xiàn)有文獻中記載的引物組而言，使用smn1基因無缺損的dna樣品作為模板時的擴增效率與用作內(nèi)標(biāo)的rpph1基因、rpp20基因相比顯著低，并且與使用純合缺損和/或雜合缺損的dna樣品作為模板時相比為幾乎不變或稍高的程度。因此，現(xiàn)有文獻中記載的技術(shù)難以以通過實時pcr得到的ct值為指標(biāo)來區(qū)分無缺損的dna、有純合缺損和/或雜合缺損的dna。另外，現(xiàn)有文獻中記載的技術(shù)在通過電泳圖分析、側(cè)向?qū)游鰴z測判定是否為sma患者方面也極為困難。

4、用于解決問題的方法

5、即，本發(fā)明為判定脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病有無和/或脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病風(fēng)險的引物組，其擴增運動神經(jīng)元存活(smn)1基因，上述引物組中所含的正向引物和反向引物具有與將smn1基因與smn2基因比對時不同的smn1基因上的堿基進行雜交的堿基。

6、本發(fā)明的一個方式為上述正向引物和反向引物所具有的上述堿基位于上述正向引物和反向引物的3’末端側(cè)的引物組。本發(fā)明的另一方式可以為上述正向引物和反向引物所具有的上述堿基位于上述正向引物和反向引物的3’末端起第1～5位的引物組。

7、本發(fā)明的一個方式可以為上述正向引物所具有的上述堿基與和序列號1所示的堿基序列的第152位、第201位、第349位和第464位中的任一堿基互補的堿基進行雜交、上述反向引物所具有的上述堿基與和序列號1所示的堿基序列的第201位、第349位、第464位和第929位中的任一堿基相同的堿基進行雜交的引物組。

8、另外，本發(fā)明的另一方式可以為上述正向引物為(f1)～(f4)中任一者、上述反向引物為(r1)～(r4)中任一者的引物組。

9、(f1)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第152位的堿基相同的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第152位的堿基起5’末端方向的堿基序列連續(xù)相同的序列

10、(f2)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第201位的堿基相同的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第201位的堿基起5’末端方向的堿基序列連續(xù)相同的序列

11、(f3)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第349位的堿基相同的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第349位的堿基起5’末端方向的堿基序列連續(xù)相同的序列

12、(f4)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第464位的堿基相同的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第464位的堿基起5’末端方向的堿基序列連續(xù)相同的序列

13、(r1)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第201位的堿基互補的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第201位的堿基起3’末端方向的堿基序列連續(xù)互補的序列

14、(r2)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第349位的堿基互補的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第349位的堿基起3’末端方向的堿基序列連續(xù)互補的序列

15、(r3)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第464位的堿基互補的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第464位的堿基起3’末端方向的堿基序列連續(xù)互補的序列

16、(r4)在3’末端起第1～5位中具有與序列號1所示的堿基序列的第929位的堿基互補的堿基，從該堿基起朝向5’末端方向具有與序列號1所示的堿基序列的第929位的堿基起3’末端方向的堿基序列連續(xù)互補的序列

17、另外，本發(fā)明的另一方式可以為上述正向引物和上述反向引物為選自由以下的(a)～(d)組成的組中的一個或兩個以上的引物組。

18、(a)正向引物為上述(f1)，反向引物為上述(r1)～上述(r4)中任一者

19、(b)正向引物為上述(f2)，反向引物為上述(r2)～上述(r4)中任一者

20、(c)正向引物為上述(f3)，反向引物為上述(r3)和上述(r4)中任一者

21、(d)正向引物為上述(f4)，反向引物為上述(r4)

22、本發(fā)明的另一方式可以為正向引物和/或反向引物具有與smn1基因形成錯配堿基對的錯配堿基的引物組。上述錯配堿基可以與對將smn1基因與smn2基因比對時不同的smn1基因上的堿基進行雜交的堿基相鄰。

23、本發(fā)明的另一方式為特異性擴增smn1基因的引物組，也可以為不擴增smn2基因或不易擴增smn2基因的引物組。

24、本發(fā)明的另一方式可以為上述正向引物和上述反向引物為8～40個堿基長度的引物組。

25、進而，本發(fā)明的另一方式可以為上述正向引物為(f5)～(f7)中任一者、上述反向引物為(r5)～(r7)中任一者的引物組。

26、(f5)具有序列號3～18、序列號35～41、序列號49～56和序列號75中任一者所示的堿基序列的核酸

27、(f6)具有在(f5)記載的堿基序列中缺失、置換、添加和/或插入一個或兩個以上堿基而成的堿基序列的核酸

28、(f7)與具有與(f5)和(f6)記載的堿基序列互補的堿基序列的核酸在嚴(yán)格條件下雜交的核酸

29、(r5)具有序列號19～34、序列號42～48和序列號57～74中任一者所示的堿基序列的核酸

30、(r6)具有在(r5)記載的堿基序列中缺失、置換、添加和/或插入一個或兩個以上堿基而成的堿基序列的核酸

31、(r7)與具有與(r5)和(r6)記載的堿基序列互補的堿基序列的核酸在嚴(yán)格條件下雜交的核酸

32、上述正向引物可以為由序列號3～18、序列號35～41、序列號49～56和序列號75中任一者所示的堿基序列構(gòu)成的核酸，也可以為含有上述堿基序列的核酸。上述反向引物可以為由序列號19～34、序列號42～48和序列號57～74中任一者所示的堿基序列構(gòu)成的核酸，也可以為含有上述堿基序列的核酸。

33、進而，本發(fā)明提供含有上述引物組的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定試劑盒。本發(fā)明可以為通過pcr產(chǎn)物的側(cè)向?qū)游鰴z測來進行判定的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定試劑盒。另外，本發(fā)明可以為能夠判定是否為脊髓性肌萎縮癥的攜帶者的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定試劑盒，可以為能夠判定待檢體所含的dna中的smn1基因的純合缺損、smn1基因的雜合缺損以及smn1基因無缺損的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定試劑盒。

34、進而，本發(fā)明為包括使用上述引物組進行pcr的pcr步驟的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定方法。上述pcr步驟可以不為定量pcr、實時pcr，可以為非定量pcr。進而，可以為通過上述pcr步驟中得到的pcr產(chǎn)物的側(cè)向?qū)游鰴z測來進行判定的脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病和/或發(fā)病風(fēng)險判定方法。

35、發(fā)明效果

36、使用本發(fā)明的引物組的pcr能夠特異且高靈敏度地擴增smn1基因，因此可以得到排除了smn2基因的影響的結(jié)果。使用本發(fā)明的引物組的實時pcr與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠以極高的精度評價被檢體(被檢者)的sma發(fā)病有無、sma發(fā)病風(fēng)險。

37、進而，通過將本發(fā)明的引物組用于非定量pcr的擴增產(chǎn)物的電泳圖分析、pcr產(chǎn)物的側(cè)向?qū)游鰴z測等簡便的方法，可以評價被檢體(被檢者)的sma發(fā)病有無、sma發(fā)病風(fēng)險。此時，本發(fā)明的判定不需要用于實時pcr的昂貴設(shè)備、可迅速且簡便地得到結(jié)果等，這些方面與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)越。