本發(fā)明屬于分子生物學中糖工程
技術領域：
，涉及一種來源于海藻糖巴氏桿菌(bibersteiniatrehalosi)中的n糖基轉移酶btngt及其應用。
背景技術：
：糖蛋白是由寡糖和多肽鏈共價修飾鏈接而形成的一類重要的生理活性物質，它廣泛存在于細胞膜，細胞間質，血漿以及粘液中。它在細胞信號識別，神經(jīng)調控，細胞間的信息傳達以及免疫調節(jié)的過程中扮演著非常重要的角色。蛋白質的糖基化修飾按照重要性依次分為n-o-p-c-和g-糖基化，其中n-連接最為普遍，它的研究最為透徹。研究發(fā)現(xiàn)將糖抗原與載體蛋白相結合，形成的糖蛋白疫苗可以刺激機體產(chǎn)生免疫記憶，因此糖蛋白疫苗的研究引起了廣泛關注。而糖蛋白的獲得以往是通過生物體內直接提取，或者是體外進行化學合成，這兩種方法均存在步驟繁雜，成本較高的缺點。經(jīng)檢索，有關來源于海藻糖巴氏桿菌(bibersteiniatrehalosi)中的n糖基轉移酶btngt及其酶學性質與其在對多肽進行n連接糖基化修飾中的應用還未見報。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種來源于海藻糖巴氏桿菌(bibersteiniatrehalosi)中的n糖基轉移酶btngt及其在對多肽進行n連接糖基化修飾中的應用。本發(fā)明所述n糖基轉移酶btngt，其特征在于：所述n糖基轉移酶btngt來源于海藻糖巴氏桿菌(bibersteiniatrehalosi)，其氨基酸序列如seqidno.1所示。上述n糖基轉移酶btngt利用來源于海藻糖巴氏桿菌(bibersteiniatrehalosi)的btngt基因由南京金斯瑞公司負責合成并構建于載體pet45b上，通過大腸桿菌bl21發(fā)酵誘導表達、純化回收獲得。本發(fā)明所述n糖基轉移酶btngt在對多肽進行n連接糖基化修飾中的應用。其中，所述應用的方法是：以n糖基轉移酶btngt作為一種多肽糖基化修飾的工具酶，將udp-glc或udp-gal轉移至含n-x-s/t序列的多肽，形成糖肽。本發(fā)明公開的n糖基轉移酶btngt屬于n-糖基化修飾的一種重要的糖基轉移酶，其可以簡單快速的利用udp-glc或udp-gal將含有n-x-s/t序列的多肽進行糖基化，接著可以利用其他的糖基轉移酶對糖肽的糖鏈進行修飾，從而獲得目的糖肽。這為多肽與蛋白的糖基化修飾提供了一種新的途徑，為糖蛋白疫苗的合成提供了一種簡便的方法。附圖說明圖1：含btngt基因的pet-45b質粒提取的瓊脂糖凝膠電泳結果其中：m表示瓊脂糖凝膠電泳marker，1號泳道是從bl21實驗菌株中提取的質粒bl21pet45b-btngt，2號泳道是原始構建質粒pet45b-btngt作為陽性對照。圖2：btngt蛋白的sds-page考馬斯亮藍染色結果其中：m表示蛋白maker，btngt分子量大約在70kda左右，圖中1號泳道為誘導后的菌體；2號泳道為超聲破壁后的上清，3號泳道為超聲破壁后的沉淀；4號泳道為上樣流出液，5，6號泳道是低濃度咪唑洗脫目的蛋白流出液；7號泳道是250mm咪唑洗脫的目的蛋白液。圖3：hplc檢測btngt酶活結果圖。圖4：質樸鑒定結果圖。圖5：btngt最適溫度結果圖。圖6：btngt最適ph結果圖。圖7：金屬離子btngt酶活影響結果圖。具體實施方式如下通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所有的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明的實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行各種變動或者改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。下面結合附圖對本發(fā)明提供的來源于海藻糖巴氏桿菌bibersteiniatrehalosi的btngt及其具體應用進行詳細說明。本試驗所采用的底物肽是由南京金斯瑞公司合成的在n端帶有tamra標記的六肽danytk，本試驗酶學反應之后均將反應液進行處理，利用hplc對反應進行分析，所采用的分析柱為c18反向柱，采用的分離程序如表1-1所示：表1-1hplc分析程序時間min色譜乙腈(0.1％三氟乙酸)超純水(0.1％三氟乙酸)05％95％2565％35％3095％5％405％95％本發(fā)明設計的菌種和質粒來源見表1-2。表1-2本發(fā)明所用菌株和質粒實施例1：n糖基轉移酶btngt的制備1.表達菌株的構建將金斯瑞公司合成的質粒轉入bl21感受態(tài)細胞中，42℃熱擊1min，涂amp平板。將單菌落挑至5ml的試管培養(yǎng)基37℃200rpm培育12h，提質粒驗證。質粒瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。2.btngt蛋白的表達與純化將單菌落bl21pet45b-btngt挑入50mllb培養(yǎng)基中，(含50ug/ml的氨芐青霉素amp)37℃200rpm活化12h。接著擴大培養(yǎng)，將菌液轉移至1l培養(yǎng)基中(含50ug/ml的氨芐青霉素amp)，200rpm37℃培育大約3.5h后，測od值，當od600值為0.6時，冰浴20min，之后加入400μl0.5m的iptg，誘導蛋白表達(16℃200rpm)。誘導20h后，10000rpm離心10min收集菌體，用bindingbuffer沖洗菌體，然后按每克濕菌體加入10ml的bindingbuffer的量懸浮菌體，冰浴條件下超聲破碎菌體(40w，工作2s休息4s，破碎40min)，然后4℃12000rpm離心，收集上清。將上清用0.22um的濾膜過濾之后，加入到經(jīng)bindingbuffer平衡過得ni-nta重力柱中，4℃孵育10min后，讓液體經(jīng)重力流經(jīng)填料，依次用含10mm20mm咪唑的bindingbuffer除去雜蛋白，用含250mm咪唑的bindingbuffer洗脫目的蛋白，并收集目的蛋白。收集30ml左右的目的蛋白后，用10kd的超濾管4℃3500g離心脫鹽。3.目的蛋白的檢測通過sds-page的方法檢測目的蛋白，蛋白檢測結果見圖2。目的蛋白即為n糖基轉移酶btngt，其氨基酸序列如seqidno.1所示。實施例2：n糖基轉移酶btngt在多肽糖基化修飾中的應用1.酶活的測定：測定酶活的底物肽為南京金斯瑞公司合成的帶熒光標記的六肽danytk，在ngt的催化下，分別于udp-glc或udp-gal反應，反應液經(jīng)hplc熒光檢測器檢測，反應體系如表1-3：表1-3aangt與btngt酶活檢測反應體系反應結果見圖3，實驗證明btngt可以利用udp-glc和udp-gal，完成對多肽的糖基化修飾。接著對產(chǎn)物進行質樸驗證，質樸結果圖見圖4。2.最適ph的測定：為了探究btngt的最適ph，我們選取不同ph的緩沖液，hac(5.0，6.0)pbs(6.0，7.0，8.0)tris(8.0，9.0，10.0)hepes(7.0，8.0)。并做10μl的反應體系，反應15min后煮沸5min停止反應，接著用hplc進行分析。反應體系如表1-4：表1-4最適ph的測定反應結果見圖5，實驗證明btngt在ph為8.0的pbs溶液中活性最強。3.最適溫度的測定：為了探究btngt的最適溫度，我們做10μl的反應體系，在不同的溫度下反應15min(分別在10℃，20℃，30℃，37℃，40℃，50℃和60℃下進行反應)，接著煮沸5min停止反應，并用hplc進行分析，反應體系如表1-5：表1-5最適溫度的測定反應結果見圖6，實驗證明btngt在20℃下反應效率最高。4.金屬離子對活性的影響：選取了8中金屬離子，研究金屬離子對btngt酶活的影響，反應體系如表1-6：表1-6金屬離子對酶活的影響反應結果如圖7，發(fā)現(xiàn)其中btngt在有無金屬離子的條件下下都有活性，其中ca2+與cu2+對于btngt的活性有著明顯的抑制，mg2+的存在會使其活性略微增強。序列表<110>山東大學<120>一種n糖基轉移酶btngt及其應用<141>2017-6-20<160>1<210>1<211>690<212>prt<213>人工序列<221>btngt的氨基酸序列<222>（1）…（690）<400>1msqeqktpsvirfeqavkakqyesacnelldilsqidsnfggingiefncpeqlnnpnls60kektiyfstrmadlitelfsdeslsltvggavrffsyqrwiallfacspyinsdhilqvy120nrnpdksnpnsvhlsanpndlvkfcimylpesnislnldaiwqlnptlcasmcfalqspr180figtkeafgkrgailqwfpeklaqlpnldnlpssishdvymhcsydvaankhdvkralnq240vmrrhlvtsgwvdrdiskigktngkpvmvvllehfhsahsiyrthstsmraarehfhlig300iggsavdkagqevfddfrlvegntifeklsfvkrlceeygaaifympsigmdlttifasn360trlapiqaialghpgtthsefieyvvveddyvgseacfsekllrlpkdalpyvpsalapa420sveyrlrenpevvnigiasttmklnpyfldalkairdrakvkvhfhfalgqssgithpyv480erfikshlgdsatahphspyhqymqilhncdmlvnpfpfgntngiidmvtlglvgicktg540pevhehideglfkrlglpewliantvdeyveravrlaenhaerlalrrhiiennglqtlf600tgdpkpmgqvfvqklnewaglhnidvsdfafaqssgkkvtksaktaakktvkvtvkksaq660pkestktksktekkktssakdaaktskkka690當前第1頁12