-噻唑啉-4-羧酸合成l-半胱氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種酶法轉化化-2-氨基-A2-喔哇 晰-4-駿酸值kATC)合成k半脫氨酸的方法。
【背景技術】
[0002] k半脫氨酸是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中唯一具有還原性基團琉基（-SH)的 氨基酸，具有重要的生理功能。目前已在醫(yī)藥、食品添加劑和化妝品中廣泛應用。我國是 k半脫氨酸生產(chǎn)大國，占全球總產(chǎn)量的80%，產(chǎn)品不僅占領了國內(nèi)市場，而且大量出口到 世界各地。目前，國內(nèi)生產(chǎn)心半脫氨酸主要是依靠人或動物的毛發(fā)中的角蛋白經(jīng)酸水解 提取k脫氨酸后，再經(jīng)過電解還原制得k半脫氨酸。該方法收率低，能耗高，水解過程產(chǎn) 生大量刺激性氣體，廢液處理困難，對環(huán)境污染嚴重。近年來，隨著k半脫氨酸生產(chǎn)技術 的發(fā)展，國際上逐步W微生物轉化法取代了毛發(fā)水解制備心半脫氨酸。微生物轉化法中W 化-ATC酶法轉化最具優(yōu)勢?；?ATC酶法轉化是利用微生物細胞內(nèi)所含有的轉化酶系（包 括化-ATC消旋酶a-ATC水解酶、硫-氨甲醜半脫氨酸水解酶、氮一氨甲醜半脫氨 酸水解酶）將化-ATC生物轉化為k半脫氨酸。送個方法是1977年日本Sano等人提出的， 他們從±壤中篩選到的假單胞菌（Pseudomonassp.)可將化-2-氨基-A2-喔哇晰-4-駿 酸值kATC)生物轉化為心半脫氨酸。此法具有特異性強、生產(chǎn)工藝簡單、副反應和副產(chǎn)物 少、產(chǎn)物均一、易提取等優(yōu)點，很適宜合成用發(fā)酵法生產(chǎn)比較困難的氨基酸。
[0003] 雖然國際上微生物酶法轉化化-ATC合成k半脫氨酸送一技術已有較為成熟的應 用，但由于存在菌體使用壽命不長（由于L-ATC水解酶在生理溫度的熱穩(wěn)定性不高，易變 性，其半衰期很短），酶促反應途徑中的酶均為誘導酶，對底物響應時間長，野生菌株中酶量 不足、活力相對較低等使得整套工藝的連續(xù)生產(chǎn)能力被大大限制，生產(chǎn)成本居高不下，一般 該法只用于醫(yī)用級高純度k半脫氨酸的產(chǎn)生。特別是野生菌中存在半脫氨酸的分解代謝 途徑，轉化過程中積累的心半脫氨酸被分解，釋放出大量的的&S氣體，嚴重影響了產(chǎn)率。 而目前由于對菌株基因組信息的缺乏W及一些未知的原因，對野生假單胞菌的基因工程改 造工作難度很大，一直進展不前。
[0004] 由此可見，創(chuàng)立一套高效、高產(chǎn)率的微生物酶法轉化化-ATC合成k半脫氨酸的新 方法就顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術存在的利用野生型假單胞菌法轉化化-2-氨 基-A2-喔哇晰-4-駿酸值L-ATC)合成k半脫氨酸工藝中遇到的技術問題，提供一種更 為高效的酶法轉化化-ATC合成k半脫氨酸的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：
[0007] -種酶法轉化化-ATC合成k半脫氨酸的方法，包括如下步驟：
[000引 （1)基因工程菌細胞膜的透膜處理
[0009] 將經(jīng)誘導表達后的用于轉化化-ATC合成心半脫氨酸的基因工程菌先后用正己焼 和二甲苯進行透膜處理，離必收集透膜處理的菌體，用磯酸鹽緩沖液洗涂后備用。其中，用 于轉化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程菌為敲除半脫氨酸脫琉基酶基因且能異源共 表達由化-ATC消旋酶、剛性連接膚和kATC水解酶所組成的融合蛋白AtcAB和氮一氨甲 醜-k半脫氨酸水解酶AtcC的大腸桿菌；
[0010] 所述的融合蛋白AtcAB的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示；所述的氮一氨甲 醜-k半脫氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0011] 似固定化細胞的制備
[0012] 通過海藻酸巧包埋法將步驟（1)所獲得的經(jīng)透膜處理的基因工程菌固定得到固 定化細胞。
[001引 （3)固定化細胞轉化化-ATC生成心半脫氨酸
[0014] 將步驟似得到的固定化細胞加入到含有反應物化-atc、kh2P〇4、山梨醇的體系中 進行反應得到k半脫氨酸。
[0015] 步驟（1)中所述的大腸桿菌為染色體上整合有受A瞻菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動 子控制的T7瞻菌體RNA聚合酶基因的大腸桿菌，如化21 0E3)、JM109 〇)E3)等中的任意一 株，送些菌株可從NovageruPromega等生物技術公司購買。該類菌株有利于在T7啟動子控 制下的外源基因的表達。
[0016] 步驟（1)中所述的半脫氨酸脫琉基酶基因為tnaA和malY基因，其優(yōu)選通過Red重 組系統(tǒng)進行敲除。根據(jù)Genbank公布的大腸桿菌基因組序列，設計引物對tnaA及malY基 因進行敲除。WpKD4質(zhì)粒為模板，用所設計的引物通過PCR(聚合酶鏈式反應）擴增帶有 卡郝霉素抗性基因的同源重組片段。將地D46質(zhì)粒導入大腸桿菌中，誘導產(chǎn)生同源重組所 需的酶后，收獲菌體并制備電轉化感受態(tài)細胞；將50-200yL的感受態(tài)細胞與10-20ng的同 源重組片段混合后加入電擊杯中（于Bio-Rad公司購買），通過電穿孔儀（于Bio-Rad公司 購買）電擊，電壓設置1700-2500V。將電擊液用800yLS0C培養(yǎng)基稀釋，然后通過卡郝霉 素抗性平板篩選重組子，然后設計引物，PCR驗證敲除的正確性。然后培養(yǎng)重組大腸桿菌 并制備感受態(tài)細胞，轉化PCP20質(zhì)粒，通過溫度誘導表達FLP內(nèi)切酶將抗性基因從基因組上 切除掉。
[0017] 敲除基因tnaA及malY所用的引物分別為：
[0018]tnaAup：
[0019] 5^-ATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGCATTCGTGTTATTGAGCAAGTGTAGGCTGGA GCTGCTTC-3'，
[0020] tnaAdown：
[0021] 5^-TTAAACTTCTTTAAGTTTTGCGGTGAAGTGACGCAATACTTTCGGTTCGTACATGGGAATTAGCCA TGGTCC-3';
[0022] mal化p:
[0023] 5，-ATGTTCGATTTTTCAAAGGTCGTGGATCGTCATGGCACATGGTGTACACAGTGGGAAAGTGTAGGC TGGAGCTGCTTC-3>，
[0024]malYdown：
[00巧]5，-TCCAGCCACACCTTTTTCCAGTTTCGAACGTGGGCAGCCGGCATTGAGACGGATGGGAATTAGCCA TGGTCC-3'。
[0026] 驗證上述tnaA及malY基因敲除所用的引物分別為：
[0027]tnaAtestup;5, -TTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3，，
[0028]tnaAtestdown;5' -AGGATGTAGGGTAAGAGAGTGG-3'；
[0029]malYtestup;5, -TCGGGCAATTGGCGTAGTAC-3，，
[0030]malYtestdown;5' -GCAATTGGGTTAACGAACAG-3'。
[0031] 上述質(zhì)粒地D4含有兩邊為FRT位點的卡郝霉素抗性基因，是Red重組系統(tǒng)中的常 規(guī)質(zhì)粒，其可在市場上隨意購買得到。質(zhì)粒地046(〇1'11?10山日9410118?日拘8-旨日111-6日1：-6又〇 Amp)是溫度敏感型質(zhì)粒，能在阿拉伯糖的誘導下表達同源重組需要的H個A瞻菌體重 組酶Gam、Bet和Exo,其是Red重組系統(tǒng)中提供重組酶的質(zhì)粒，可在市場上隨意購買得 至IJ。質(zhì)粒PCP20為溫度敏感型質(zhì)粒，熱誘導后表達FLP重組酶，能識別FRT位點并促進 重組的發(fā)生，其亦可在市場上隨意購買得到。所述質(zhì)粒地D46、P邸4及PCP20的構建及 應用見下述文獻：1.D曰tsenkoKA,W曰nnerBL.One-stepin曰ctiv曰tionofchromosom曰 1 genesinEscherichiacoliK-12usingPC民products.ProNatlAcadSciUSA 2000,97:6640-6645 ;2.Red重組技術研究進展，中國生物工程雜志，2006, 26(1) ;81-86; 3.Red重組系統(tǒng)及在微生物基因敲除中的應用，遺傳，2003, 25巧）=628-632。
[0032] 步驟（1)中的化-ATC消旋酶a-ATC水解酶和氮一氨甲醜半脫氨酸水解酶的 編碼基因均來源于假單胞菌PseudomonasSP.BS株，送些編碼基因的序列均經(jīng)過密碼子優(yōu) 化。編碼由化-ATC消旋酶、剛性連接膚和心41'(：水解酶所組成的融合蛋白的核巧酸序列如 SEQIDNO. 2所示，編碼氮一氨甲醜-k半脫氨酸水解酶的核巧酸序列如SEQIDNO. 5所 /J、- 〇
[0033] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述的用于轉化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程菌通過 包括如下步驟的方法構建得到：
[0034]a.將序列如SEQIDNO. 3所示的DNA片段通過NdeI、EcoRI酶切位點連接到復制 子為n的祀T-28a(+)載體上構建得到表達由化-ATC消旋酶、剛性連接膚和kATC水解酶 所組成的融合蛋白的表達載體（pET-atcAB)。所述表達載體祀T-28a(+)為Novagen公司產(chǎn) 品，可隨意從市場購買。
[0035]b.將序列如SEQIDNO. 6所示的DNA片段通過EcoRI、化01酶切位點連接到 復制子為P15A的PACYC184載體上構建得到氮一氨甲醜半脫氨酸水解酶表達載體 (pAC-atcC)。所述載體pACYC184為化W化glandBiol油S公司產(chǎn)品，亦可隨意從市場購買。
[0036]C.將上述兩種因具有不同的復制子從而具備相容性的表達載體共同轉入敲除半 脫氨酸脫琉基酶基因的大腸桿菌中，即得到用于轉化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程 菌。
[0037] 步驟（1)中所述的基因工程菌的干重與正己焼的體積比優(yōu)選為lmg:5-40uL，基 因工程菌的