本發(fā)明屬于以等溫?cái)U(kuò)增為代表的分子生物學(xué)檢測方法在肺炎支原體檢測方面的應(yīng)用，即肺炎支原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)及其專用引物、檢測方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

支原體(mycoplasma)是介于細(xì)菌與病毒之間的一種原核細(xì)胞型微生物。迄今為止，能夠?qū)е氯梭w感染的支原體大約有20種，其中以肺炎支原體(m.pneumoniae,mp)最為多見。mp是引起人類呼吸道感染的重要病原菌之一，每年約有10％～30％的社區(qū)獲得性肺炎是由其感染引起。mp感染呈全球性分布，它可以通過飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播，人群普遍易感。當(dāng)mp侵入呼吸道后，借滑行運(yùn)動(dòng)定位于纖毛氈的隱窩內(nèi)，以其尖端特殊結(jié)構(gòu)(頂器)牢固的黏附于上皮細(xì)胞表面的受體上，抵抗黏膜纖毛的清除和吞噬細(xì)胞的吞噬，由此在呼吸道立足。除呼吸道感染外，mp還可引發(fā)嚴(yán)重的肺外并發(fā)癥，常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚及肝腎器官等。此外，有研究報(bào)道m(xù)p感染還是某些自身免疫病(如自身免疫性溶血性貧血)的風(fēng)險(xiǎn)因素，因此，對于臨床上疑似mp感染的患者進(jìn)行早期實(shí)驗(yàn)室診斷變得尤為重要。

目前支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)為分離培養(yǎng)，但分離培養(yǎng)法通常存在兩個(gè)弊端，一是檢測時(shí)間過長，固體平板生長出典型菌落至少需要3周時(shí)間，對臨床快速診斷意義不大。二是分離培養(yǎng)難度大、要求苛刻，一般醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室難以推廣。盡管指示細(xì)胞培養(yǎng)法能大大縮短分離培養(yǎng)所需時(shí)間，但培養(yǎng)過程中菌株容易死亡，亦不適用于臨床快速檢測。血清學(xué)方法在臨床上廣泛使用，盡管一些商品化試劑盒市面有售，但各試劑盒的包被抗原不同以及臨界值設(shè)定不同導(dǎo)致各試劑盒的特異性和敏感性存在差異。此外，血樣的采集時(shí)間和患者年齡對依賴血清學(xué)方法的實(shí)驗(yàn)室診斷影響較大，而某些支原體在血清學(xué)上又存在交叉反應(yīng)性。pcr的出現(xiàn)雖克服了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)敏感度低的弊端，但需要特殊儀器，不以普及，亦不適用于基層單位、現(xiàn)場監(jiān)測和床旁檢測。因此，開發(fā)一種針對mp的即時(shí)檢驗(yàn)方法成為了臨床和實(shí)驗(yàn)室中亟待解決的問題。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，它具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展迅速，已被廣泛應(yīng)用于核酸快速檢測領(lǐng)域。lamp的原理是針對靶基因上6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對引物(fip[f1c+f2]、bip[b2+b1c]、f3、b3)，在鏈置換型dna聚合酶的作用下，于等溫條件在短時(shí)間內(nèi)(15～60min)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。在dna擴(kuò)增反應(yīng)中，當(dāng)一個(gè)dntp分子結(jié)合到dna鏈上時(shí)會(huì)解離下一個(gè)焦磷酸根離子，后者與鎂離子結(jié)合形成大量副產(chǎn)物焦磷酸鎂，反應(yīng)結(jié)果無需電泳檢測，肉眼可見白色沉淀，加入熒光染料后可觀察到綠色熒光。與傳統(tǒng)pcr相比，lamp具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，判定簡單，成本低廉等特點(diǎn)。其檢測靈敏度至少高于普通pcr2個(gè)數(shù)量級。此外，等溫?cái)U(kuò)增僅需一個(gè)水浴鍋或恒溫裝置，對設(shè)備的要求簡單，其操作過程耗時(shí)較短，可在1小時(shí)內(nèi)完成。lamp反應(yīng)結(jié)果的檢測不需要像普通pcr進(jìn)行凝膠電泳，只需通過肉眼觀察白色渾濁或者綠色熒光即可，是一種簡便、快捷、高通量的檢測方法。

lamp在國內(nèi)外已有報(bào)道其在肺炎支原體檢測方面的應(yīng)用，但是迄今為止，市場上還未見用于檢測mp的lamp專用引物與試劑盒問世。因此開發(fā)一種針對mp的快速可靠的核酸檢測方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要內(nèi)容是提供一種用于檢測mp的lamp檢測專用引物、檢測方法及試劑盒，該法不依賴于dna提純過程，粗提模板亦可進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，尤其適用于各基層單位及現(xiàn)場監(jiān)測。

1.mp的lamp檢測專用引物

引物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)為mycoplasmapneumoniam129chromosome，completegenome，ncbireferencesequencenc_000912.1應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorerv5，上傳靶序列后，即可初步得到多組引物序列。

根據(jù)lamp引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素，主要包括引物末端的穩(wěn)定性、gc含量、引物間的距離和二級結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行篩選，最終得到的lamp引物。具體來說，為了在反應(yīng)中能使f1c和b1c更加容易彎轉(zhuǎn)，可以形成雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)，引物f1c和b1c要高于其他幾條引物的tm值5℃左右。為提高核苷酸越與模板退火結(jié)合效率，每條引物最末端的六個(gè)堿基的吉普斯自由能變⊿g值<＝-4kcal/mol，f3/b3，f2/b2，lf/lb的3’末端⊿g值<＝-4kcal/mol，f1c和b1c的5’端的⊿g值<＝-4kcal/mol。對于引物的gc含量設(shè)定范圍在40～60％之間。對于引物之間的距離，從f2的5’端到b2的5’端應(yīng)在120～180bp之間，從f2的5’端到f1c的3’端也就是莖環(huán)段在40～60bp之間，從f2的5’端到f3的3’端在0～20bp之間。最后要特別注意引物之間不能形成二級結(jié)構(gòu)。通過以上設(shè)計(jì)原則篩選即得到最終引物如下。f35’-gtgagtgggtggcttgtg-3’；b35’-tgtggaccagtgtcagct-3’；fip5’-aacccccaccacatcattccccaagcacgagtgacggaa-3’；bip5’-ctttctgaaagcaacgccgcaa-ccccatctaacagttcagcg-3’。

2.mp的lamp檢測方法

本發(fā)明所提供的mp的lamp檢測方法，主要包括以下步驟：

[1]dna提取：采用粗提、商品化試劑盒提取dna或純化dna均可。

1)粗提：樣本不經(jīng)過提純，直接煮沸10min后收集上清亦可作為lamp模板進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。

2)純化：可采用商品化試劑盒，或傳統(tǒng)酚氯仿等方法進(jìn)行提取。

[2]lamp擴(kuò)增

以上述提取的待測物基因組dna為模板，在專用引物的介導(dǎo)下進(jìn)行擴(kuò)增。其中，25μllamp反應(yīng)體系包括：含uu、mg或mh的基因組dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜堿(betaine)，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(購自neb公司)，引物用量為：5pmolf3和b3，40pmolfip和bip。lamp擴(kuò)增條件可設(shè)定為55～67℃恒溫30～90min(推薦設(shè)置63℃60min)。

[3]結(jié)果判定

1)肉眼觀察

反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察產(chǎn)物是否渾濁。與陰性對照相比，明顯出現(xiàn)渾濁物的樣本為陽性，陽性產(chǎn)物經(jīng)離心后在試管底部出現(xiàn)沉淀物。若無渾濁現(xiàn)象，則為陰性標(biāo)本。

2)熒光顯色

反應(yīng)結(jié)束后加入1μlsybr(1:100稀釋),在紫外光激發(fā)下觀察結(jié)果，產(chǎn)物呈熒光綠色表示該樣品存在支原體感染，顏色無變化表示待測樣品中不存在支原體。

3)檢測濁度

使用濁度測定儀器，可間接反應(yīng)核酸擴(kuò)增情況。陽性樣品的濁度隨反應(yīng)時(shí)間的延長呈s型上升趨勢，濁度無變化表示待檢樣品中不存在支原體感染。根據(jù)儀器功能不同，可檢測實(shí)時(shí)濁度或終點(diǎn)濁度，評估反應(yīng)前后濁度的變化來判斷結(jié)果。

3.mp的lamp檢測試劑盒

本發(fā)明所提供的mp的lamp檢測試劑盒，包含有上述lamp檢測的專用引物、主要試劑和反應(yīng)參數(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

[1]高特異性

4條引物對支原體靶序列的6個(gè)特異區(qū)域的識別保證了lamp擴(kuò)增的高度特異性，即lamp能夠從相差僅一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中尋找出相應(yīng)的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增；

[2]高效擴(kuò)增

靈敏度比普通pcr高約100倍；

[3]操作簡便

只需將待檢樣品(靶核酸)和檢測試劑置于約63℃恒溫水浴鍋中60min左右即可判斷結(jié)果；

[4]結(jié)果直觀

可通過肉眼、濁度儀判斷或添加熒光指示劑觀察結(jié)果。本發(fā)明可以在等溫條件下簡便快速(63℃60min)、高效特異地檢測到mp。該法不需要復(fù)雜儀器，為支原體的檢測提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)，尤其適用于人群篩查，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，適于大范圍推廣應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)以本發(fā)明技術(shù)方案為前提，列舉出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例子。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1、用于對mp進(jìn)行l(wèi)amp檢測的引物設(shè)計(jì)

從美國基因數(shù)據(jù)庫檢索獲得mp特異性保守靶序列(mycoplasmapneumoniam129chromosome，completegenome，ncbireferencesequencenc_000912.1)，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorerv5，上傳靶序列后，即可初步得到多組引物序列。根據(jù)lamp引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素，主要包括引物末端的穩(wěn)定性、gc含量、引物間的距離和二級結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行篩選，最終得到的lamp引物(詳見發(fā)明內(nèi)容)。

實(shí)施例2、本發(fā)明mp的lamp檢測方法的建立

用實(shí)施例1獲得的用于對mp進(jìn)行l(wèi)amp檢測的引物對咽拭子標(biāo)本進(jìn)行l(wèi)amp檢測，具體操作步驟如下：

[1]反應(yīng)體系

采用天根細(xì)菌基因組dna提取試劑盒提取待測樣品中的核酸或煮沸10min后收集上清作為模板，在實(shí)施例1獲得的lamp專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。其中，25μllamp反應(yīng)體系包括：含mp的基因組dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜堿(betaine)，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(購自neb公司)，引物用量為：5pmolf3和b3，40pmolfip和bip。

[2]結(jié)果判定

反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察產(chǎn)物是否渾濁。與陰性對照相比，明顯出現(xiàn)渾濁物的樣本為陽性，陽性產(chǎn)物經(jīng)離心后在試管底部出現(xiàn)沉淀物。若無渾濁現(xiàn)象，則為陰性標(biāo)本。亦可在反應(yīng)液中添加1μl的sybrgreen(1:100稀釋)，在紫外光激發(fā)下觀察結(jié)果，產(chǎn)物呈熒光綠色表示該樣品存在支原體感染，顏色無變化表示待測樣品中不存在支原體感染。或利用濁度儀監(jiān)測反應(yīng)中的濁度變化來判斷結(jié)果，濁度上升表示待測樣品中存在mp(陽性)，濁度無變化表示待測樣品為陰性。

實(shí)施例3、制備mp的lamp檢測試劑盒

將lamp反應(yīng)發(fā)生混合物即特異擴(kuò)增引物(5pmolf3；5pmolb3；40pmolfip；40pmolbip)、bstdna聚合酶(8u)、2×反應(yīng)緩沖液(40mmtris-hcl，ph8.8；20mmkcl；16mmmgso4；20mm(nh4)2so4；0.2％tween20；1.6mbetaine；2.8mmdntpeach)、sybrgreen和陽性對照共同包裝，得到本發(fā)明mp的lamp檢測試劑盒。