本發(fā)明涉及一株產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌及其在制備三萜化合物中的應(yīng)用,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
近年來(lái),食藥用高等真菌越來(lái)越受到廣泛關(guān)注,不僅因?yàn)樗哂袠O高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,更重要的是其能夠產(chǎn)生具有各種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。高等真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中,藥理作用研究較清楚的是三萜類化合物,近年的研究表明,三萜類化合物具有抗腫瘤、抗艾滋病病毒hiv-1、解毒保肝、抗菌和抑制前列腺增生等功能。
目前對(duì)三萜類化合物產(chǎn)生菌的研究主要集中在靈芝菌科ganodermatoideae和多孔菌科polyporaceae。由于高等真菌的子實(shí)體培養(yǎng)周期較長(zhǎng),三萜的產(chǎn)量受外界因素影響較大,因此,從子實(shí)體中提取三萜酸成分具有較大的局限性。通過(guò)液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)三萜類化合物具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)影響、可以大批量生產(chǎn)、三萜類化合物含量相對(duì)穩(wěn)定,適合工廠化生產(chǎn)等特點(diǎn),有望成為生產(chǎn)三萜類化合物的主要方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一株可產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌菌株及其在制備三萜類化合物中的應(yīng)用。利用本發(fā)明所述菌株可以產(chǎn)生三萜類化合物,實(shí)現(xiàn)通過(guò)微生物液體發(fā)酵法獲得以三萜類化合物為主要目的產(chǎn)物的愿望。
本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌a-9屬于多孔菌科滴孔菌屬,其特征在于:該菌株名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9,菌株已于2017年5月25日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”,保藏號(hào)為cgmccn0.13895。
上述產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯及三萜類化合物的滴孔菌a-9是一株發(fā)明人自主野外采摘分離純化得到的滴孔菌,其生物學(xué)特征是:子實(shí)體無(wú)柄,呈現(xiàn)半圓形,大小約20×15cm,單片菌蓋厚度約0.5-1.5cm,菌蓋覆瓦狀排列。子實(shí)體正面呈現(xiàn)淡黃色至橙色,邊緣顏色較深,呈現(xiàn)波浪狀或瓣?duì)睿^圓滑,子實(shí)體背面呈現(xiàn)白色,邊緣黃色,布滿菌孔。菌絲系統(tǒng)二體型,具有生殖菌絲和骨架菌絲。生殖菌絲具有擔(dān)子菌菌絲的顯著特點(diǎn),即鎖狀聯(lián)合。同時(shí)該菌生殖菌絲還具有簡(jiǎn)單隔膜,但是簡(jiǎn)單隔膜的數(shù)量較少,且往往出現(xiàn)于菌絲的前端。生殖菌絲的直徑從2-3μm到5-7μm不等。
對(duì)本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌a-9cgmccn0.13895測(cè)定18srrna以及its的基因序列的結(jié)果顯示,其18srdna序列長(zhǎng)度為1679bp,其核苷酸序列如seqidno.1所示;其its序列片段大小為727bp,其核苷酸序列如seqidno.2所示。通過(guò)形態(tài)觀察和18srrna以及its的基因序列比對(duì),初步鑒定為piptoporussp.。
本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌a-9菌種選育的基本方法是:
菌種系采自于野外的擔(dān)子菌子實(shí)體。將新鮮的子實(shí)體以無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi),用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板,30℃培養(yǎng)。待菌絲墊直徑達(dá)2-3厘米時(shí),從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板,經(jīng)反復(fù)多次轉(zhuǎn)接,直至分離得到純菌種。將該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9,該菌株已于2017年5月25日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”,保藏號(hào)為cgmccn0.13895。
本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌(piptoporussp.)a-9在制備三萜類化合物中的應(yīng)用。
其中,所述應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下:
(1)菌種選擇:選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895;
(2)斜面培養(yǎng)活化:將菌種接種于斜面培養(yǎng)基,30~35℃條件下,靜止培養(yǎng)96~102小時(shí),備用;
(3)種子培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)的菌株,在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1~2環(huán)于90~100ml液體種子培養(yǎng)基中,置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為160~180轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上,27~33℃培養(yǎng)72~96小時(shí),得種子液;
(4)以三萜類化合物為目的產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng):
搖瓶發(fā)酵:以8~10%的體積比的接種量,將種子液接種于裝有80~100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中,27~33℃,轉(zhuǎn)速為150~180轉(zhuǎn)/分鐘,ph為6.0±0.5,搖瓶發(fā)酵144~168小時(shí),即獲得含三萜類化合物的發(fā)酵產(chǎn)物;
其中:上述斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯180~220g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,去離子水1l,將馬鈴薯去皮后切成小塊,在水中煮沸30min,以8層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入葡萄糖,補(bǔ)足水至1l,ph自然;固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉,即pda;
上述液體種子培養(yǎng)基組成:馬鈴薯180~220g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,去離子水1l,將馬鈴薯去皮后切成小塊,在水中煮沸30min,以8層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入葡萄糖,補(bǔ)足水至1l,ph自然;
上述以三萜類化合物為目的產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖10~40g/l,豆粕粉10~40g/l,七水合硫酸鎂0.5g/l,磷酸二氫鉀0.46g/l,十二水合磷酸氫二鈉1.2g/l;去離子水1l;ph6,滅菌117℃,30min。
上述的應(yīng)用中,步驟(2)、(3)、(4)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選30℃。
上述的應(yīng)用中,步驟(2)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選100小時(shí)。
上述的應(yīng)用中,步驟(3)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選80小時(shí)。
上述的應(yīng)用中,步驟(4)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選150~160小時(shí)。
上述的應(yīng)用中,步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基初始蔗糖濃度優(yōu)選20g/l~30g/l。
上述的應(yīng)用中,步驟(4)所述發(fā)酵過(guò)程中搖瓶發(fā)酵的ph優(yōu)選6.0。
上述三萜類化合物按下述方法測(cè)定:
三萜類化合物提?。焊稍镏梁阒氐牡慰拙鷄-9菌體粉碎,置于50ml離心管中,加無(wú)水乙醇50ml,超聲處理(400w,55khz)30min,濾過(guò),濾渣重復(fù)上述操作1次,合并濾液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干,用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。將離心后的發(fā)酵液,加2倍無(wú)水乙醇,醇沉,離心,8000rpm,10min,除去沉淀多糖,之后得到的乙醇與發(fā)酵液混合液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干,用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。
吸光度檢測(cè):將所得樣品分別搖勻,用移液槍吸取適量溶液,水浴蒸干后各加入0.3ml5%香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解),再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封,于70℃水浴加熱25min,取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml,快速搖勻,放置20min,在540nm處測(cè)量吸光度。
本發(fā)明公開(kāi)了一株產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌(piptoporussp.)a-9,作為自主采摘分離鑒定的新菌株,發(fā)明人未檢索到有關(guān)利用滴孔菌a-9以生產(chǎn)三萜類化合物為目的產(chǎn)物的文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用本發(fā)明所述滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895可直接發(fā)酵生成并獲得目的產(chǎn)物三萜類化合物,菌種發(fā)酵性能穩(wěn)定,是一株極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的三帖類化合物生產(chǎn)菌株。其為液體發(fā)酵生產(chǎn)三萜類化合物探索了新的方向與途徑,為將來(lái)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明采用生物發(fā)酵的方法,以蔗糖、豆粕粉等為原料生產(chǎn)三萜類化合物,具有生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單,條件溫和,原料來(lái)源豐富,生產(chǎn)成本低等特點(diǎn),發(fā)酵生產(chǎn)的三萜類化合物產(chǎn)量最高可達(dá)2.1g/l以上,具有較高的應(yīng)用價(jià)值,極具工業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌菌株分離純化
菌種系采自于野外的擔(dān)子菌子實(shí)體。將新鮮的子實(shí)體以無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi),用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板,30℃培養(yǎng)。待菌絲墊直徑達(dá)2-3厘米時(shí),從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板,經(jīng)反復(fù)多次轉(zhuǎn)接,直至分離得到純菌種。將目的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩和進(jìn)一步分離篩選,得到一株性能穩(wěn)定的三萜類化合物產(chǎn)生菌,該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9。
上述菌株滴孔菌a-9已于2017年5月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵政編碼:100101,其保藏編號(hào)為cgmccn0.13895。
上述液體種子培養(yǎng)基組成(g/l):鈴薯180~220g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,去離子水1l,將馬鈴薯去皮后切成小塊,在水中煮沸30min,以8層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入葡萄糖,補(bǔ)足水至1l,ph自然。
上述斜面培養(yǎng)基組成為(g/l):馬鈴薯180~220g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,去離子水1l,將馬鈴薯去皮后切成小塊,在水中煮沸30min,以8層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入葡萄糖,補(bǔ)足水至1l,ph自然。固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉,即pda。
實(shí)施例2滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895菌株18srdna及its序列測(cè)序
將實(shí)施例1分離純化得到的產(chǎn)三萜類化合物菌株即cgmccn0.13895菌株委托博尚生物公司進(jìn)行18srdna測(cè)序。
實(shí)驗(yàn)方法是:挑取斜面培養(yǎng)物,提取基因組作為模板,分別以通用引物ns1,ns8擴(kuò)增18srrna基因,片段大小為約1.8kb,以通用引物its1,its4擴(kuò)增its序列,片段大小約為750bp。
取5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,使用takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0(codeno.dv805a)切膠回收目的片斷,對(duì)上述回收產(chǎn)物進(jìn)行dna測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果:cgmccn0.13895菌株18srdna序列長(zhǎng)度為1679bp,其核苷酸序列如seqidno.1所示;cgmccn0.13895菌株its序列片段大小為727bp,其核苷酸序列如seqidno.2所示。所用引物如表1所示。
表1所用引物列表
實(shí)施例3滴孔菌a-9cgmccn0.13895在制備三萜類化合物中的應(yīng)用
應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下:
(1)菌種選擇:選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895;
(2)斜面培養(yǎng)活化:將菌種接種于斜面培養(yǎng)基,30℃條件下,靜止培養(yǎng)100小時(shí),備用;
(3)種子培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)的菌株,在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1~2環(huán)于90~100ml(500ml三角瓶)液體種子培養(yǎng)基中,置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上,30℃培養(yǎng)80小時(shí),得種子液;
(4)搖瓶發(fā)酵:以8~10%的體積比的接種量,將種子液接種于裝有90-100ml(500ml三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中,30℃,轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘,搖瓶發(fā)酵160小時(shí),即獲得含三萜類化合物的發(fā)酵產(chǎn)物;
上述斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯180~220g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,去離子水1l,將馬鈴薯去皮后切成小塊,在水中煮沸30min,以8層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入葡萄糖,補(bǔ)足水至1l,ph自然。固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉,即pda;
上述液體種子培養(yǎng)基組成:馬鈴薯180~220g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,去離子水1l,將馬鈴薯去皮后切成小塊,在水中煮沸30min,以8層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入葡萄糖,補(bǔ)足水至1l,ph自然;
上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖30g/l,豆粕粉30g/l,硫酸鎂(七水合)0.5g/l,磷酸二氫鉀0.46g/l,磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l,ph6,滅菌117℃,30min。
(5)產(chǎn)物檢測(cè):取適量樣品水浴蒸干后加入0.3ml5%香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解),再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封,于70℃水浴加熱25min,取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml,快速搖勻,放置20min,在540nm處測(cè)量吸光度;
經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和上清的總?cè)祁惢衔锏暮繛?.1g/l。
上述三萜類化合物按下述方法測(cè)定:
三萜類化合物提?。喝∵m量培養(yǎng)物離心3000rpm,10min,沉淀的菌體于100℃烘箱中干燥至恒重,粉碎成末,置于50ml離心管中,加無(wú)水乙醇50ml,超聲處理(400w,55khz)30min,濾過(guò),濾渣重復(fù)上述操作1次,合并濾液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干,用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。將離心后的上清液,加2倍無(wú)水乙醇,醇沉,離心,8000rpm,10min,除去沉淀多糖,之后得到的乙醇與發(fā)酵液混合液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干,用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。
吸光度檢測(cè):將所得樣品分別取適量于10ml離心管中,水浴蒸干后各加入0.3ml5%香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解),再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封,于70℃水浴加熱25min,取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml,快速搖勻,放置20min,在540nm處測(cè)量吸光度。
序列表
<110>山東大學(xué)
<120>一株產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌及其應(yīng)用
<141>2017-06-14
<160>2
<210>1
<211>1679
<212>rdna
<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9
<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的18srdna序列
<222>(1)…(1679)
<400>1
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<210>2
<211>727
<212>dna
<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9
<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的its序列
<222>(1)…(727)
<400>2
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