本發(fā)明涉及一株產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌及其在制備三萜化合物中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，食藥用高等真菌越來(lái)越受到廣泛關(guān)注，不僅因?yàn)樗哂袠O高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更重要的是其能夠產(chǎn)生具有各種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。高等真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中，藥理作用研究較清楚的是三萜類化合物，近年的研究表明，三萜類化合物具有抗腫瘤、抗艾滋病病毒hiv-1、解毒保肝、抗菌和抑制前列腺增生等功能。

目前對(duì)三萜類化合物產(chǎn)生菌的研究主要集中在靈芝菌科ganodermatoideae和多孔菌科polyporaceae。由于高等真菌的子實(shí)體培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，三萜的產(chǎn)量受外界因素影響較大，因此，從子實(shí)體中提取三萜酸成分具有較大的局限性。通過(guò)液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)三萜類化合物具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)影響、可以大批量生產(chǎn)、三萜類化合物含量相對(duì)穩(wěn)定，適合工廠化生產(chǎn)等特點(diǎn)，有望成為生產(chǎn)三萜類化合物的主要方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一株可產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌菌株及其在制備三萜類化合物中的應(yīng)用。利用本發(fā)明所述菌株可以產(chǎn)生三萜類化合物，實(shí)現(xiàn)通過(guò)微生物液體發(fā)酵法獲得以三萜類化合物為主要目的產(chǎn)物的愿望。

本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌a-9屬于多孔菌科滴孔菌屬，其特征在于：該菌株名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，菌株已于2017年5月25日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為cgmccn0.13895。

上述產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯及三萜類化合物的滴孔菌a-9是一株發(fā)明人自主野外采摘分離純化得到的滴孔菌，其生物學(xué)特征是：子實(shí)體無(wú)柄，呈現(xiàn)半圓形，大小約20×15cm，單片菌蓋厚度約0.5-1.5cm，菌蓋覆瓦狀排列。子實(shí)體正面呈現(xiàn)淡黃色至橙色，邊緣顏色較深，呈現(xiàn)波浪狀或瓣?duì)睿^圓滑，子實(shí)體背面呈現(xiàn)白色，邊緣黃色，布滿菌孔。菌絲系統(tǒng)二體型，具有生殖菌絲和骨架菌絲。生殖菌絲具有擔(dān)子菌菌絲的顯著特點(diǎn)，即鎖狀聯(lián)合。同時(shí)該菌生殖菌絲還具有簡(jiǎn)單隔膜，但是簡(jiǎn)單隔膜的數(shù)量較少，且往往出現(xiàn)于菌絲的前端。生殖菌絲的直徑從2-3μm到5-7μm不等。

對(duì)本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌a-9cgmccn0.13895測(cè)定18srrna以及its的基因序列的結(jié)果顯示，其18srdna序列長(zhǎng)度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。通過(guò)形態(tài)觀察和18srrna以及its的基因序列比對(duì)，初步鑒定為piptoporussp.。

本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌a-9菌種選育的基本方法是：

菌種系采自于野外的擔(dān)子菌子實(shí)體。將新鮮的子實(shí)體以無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板，30℃培養(yǎng)。待菌絲墊直徑達(dá)2-3厘米時(shí)，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板，經(jīng)反復(fù)多次轉(zhuǎn)接，直至分離得到純菌種。將該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，該菌株已于2017年5月25日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為cgmccn0.13895。

本發(fā)明所述產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌(piptoporussp.)a-9在制備三萜類化合物中的應(yīng)用。

其中，所述應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；

(2)斜面培養(yǎng)活化：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30～35℃條件下，靜止培養(yǎng)96～102小時(shí)，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于90～100ml液體種子培養(yǎng)基中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為160～180轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，27～33℃培養(yǎng)72～96小時(shí)，得種子液；

(4)以三萜類化合物為目的產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)：

搖瓶發(fā)酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于裝有80～100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，27～33℃，轉(zhuǎn)速為150～180轉(zhuǎn)/分鐘，ph為6.0±0.5，搖瓶發(fā)酵144～168小時(shí)，即獲得含三萜類化合物的發(fā)酵產(chǎn)物；

其中：上述斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖，補(bǔ)足水至1l，ph自然；固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養(yǎng)基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖，補(bǔ)足水至1l，ph自然；

上述以三萜類化合物為目的產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，七水合硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，十二水合磷酸氫二鈉1.2g/l；去離子水1l；ph6，滅菌117℃，30min。

上述的應(yīng)用中，步驟(2)、(3)、(4)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選30℃。

上述的應(yīng)用中，步驟(2)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選100小時(shí)。

上述的應(yīng)用中，步驟(3)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選80小時(shí)。

上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選150～160小時(shí)。

上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基初始蔗糖濃度優(yōu)選20g/l～30g/l。

上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述發(fā)酵過(guò)程中搖瓶發(fā)酵的ph優(yōu)選6.0。

上述三萜類化合物按下述方法測(cè)定：

三萜類化合物提?。焊稍镏梁阒氐牡慰拙鷄-9菌體粉碎，置于50ml離心管中，加無(wú)水乙醇50ml，超聲處理(400w,55khz)30min,濾過(guò)，濾渣重復(fù)上述操作1次，合并濾液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。將離心后的發(fā)酵液，加2倍無(wú)水乙醇，醇沉，離心，8000rpm，10min，除去沉淀多糖，之后得到的乙醇與發(fā)酵液混合液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。

吸光度檢測(cè)：將所得樣品分別搖勻，用移液槍吸取適量溶液，水浴蒸干后各加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封，于70℃水浴加熱25min，取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml，快速搖勻，放置20min，在540nm處測(cè)量吸光度。

本發(fā)明公開(kāi)了一株產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌(piptoporussp.)a-9，作為自主采摘分離鑒定的新菌株，發(fā)明人未檢索到有關(guān)利用滴孔菌a-9以生產(chǎn)三萜類化合物為目的產(chǎn)物的文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用本發(fā)明所述滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895可直接發(fā)酵生成并獲得目的產(chǎn)物三萜類化合物，菌種發(fā)酵性能穩(wěn)定，是一株極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的三帖類化合物生產(chǎn)菌株。其為液體發(fā)酵生產(chǎn)三萜類化合物探索了新的方向與途徑，為將來(lái)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用生物發(fā)酵的方法，以蔗糖、豆粕粉等為原料生產(chǎn)三萜類化合物，具有生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，條件溫和，原料來(lái)源豐富，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的三萜類化合物產(chǎn)量最高可達(dá)2.1g/l以上，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，極具工業(yè)化應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌菌株分離純化

菌種系采自于野外的擔(dān)子菌子實(shí)體。將新鮮的子實(shí)體以無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板，30℃培養(yǎng)。待菌絲墊直徑達(dá)2-3厘米時(shí)，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板，經(jīng)反復(fù)多次轉(zhuǎn)接，直至分離得到純菌種。將目的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩和進(jìn)一步分離篩選，得到一株性能穩(wěn)定的三萜類化合物產(chǎn)生菌，該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9。

上述菌株滴孔菌a-9已于2017年5月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101，其保藏編號(hào)為cgmccn0.13895。

上述液體種子培養(yǎng)基組成(g/l)：鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖，補(bǔ)足水至1l，ph自然。

上述斜面培養(yǎng)基組成為(g/l)：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖，補(bǔ)足水至1l，ph自然。固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda。

實(shí)施例2滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895菌株18srdna及its序列測(cè)序

將實(shí)施例1分離純化得到的產(chǎn)三萜類化合物菌株即cgmccn0.13895菌株委托博尚生物公司進(jìn)行18srdna測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)方法是：挑取斜面培養(yǎng)物,提取基因組作為模板，分別以通用引物ns1，ns8擴(kuò)增18srrna基因，片段大小為約1.8kb，以通用引物its1，its4擴(kuò)增its序列，片段大小約為750bp。

取5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0(codeno.dv805a)切膠回收目的片斷，對(duì)上述回收產(chǎn)物進(jìn)行dna測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果：cgmccn0.13895菌株18srdna序列長(zhǎng)度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；cgmccn0.13895菌株its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。所用引物如表1所示。

表1所用引物列表

實(shí)施例3滴孔菌a-9cgmccn0.13895在制備三萜類化合物中的應(yīng)用

應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；

(2)斜面培養(yǎng)活化：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30℃條件下，靜止培養(yǎng)100小時(shí)，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于90～100ml(500ml三角瓶)液體種子培養(yǎng)基中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，30℃培養(yǎng)80小時(shí)，得種子液；

(4)搖瓶發(fā)酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于裝有90-100ml(500ml三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃，轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘，搖瓶發(fā)酵160小時(shí)，即獲得含三萜類化合物的發(fā)酵產(chǎn)物；

上述斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖，補(bǔ)足水至1l，ph自然。固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養(yǎng)基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖，補(bǔ)足水至1l，ph自然；

上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖30g/l，豆粕粉30g/l，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l，ph6，滅菌117℃，30min。

(5)產(chǎn)物檢測(cè)：取適量樣品水浴蒸干后加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封，于70℃水浴加熱25min，取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml，快速搖勻，放置20min，在540nm處測(cè)量吸光度；

經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和上清的總?cè)祁惢衔锏暮繛?.1g/l。

上述三萜類化合物按下述方法測(cè)定：

三萜類化合物提?。喝∵m量培養(yǎng)物離心3000rpm，10min，沉淀的菌體于100℃烘箱中干燥至恒重，粉碎成末，置于50ml離心管中，加無(wú)水乙醇50ml，超聲處理(400w,55khz)30min,濾過(guò)，濾渣重復(fù)上述操作1次，合并濾液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。將離心后的上清液，加2倍無(wú)水乙醇，醇沉，離心，8000rpm，10min，除去沉淀多糖，之后得到的乙醇與發(fā)酵液混合液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。

吸光度檢測(cè)：將所得樣品分別取適量于10ml離心管中，水浴蒸干后各加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封，于70℃水浴加熱25min，取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml，快速搖勻，放置20min，在540nm處測(cè)量吸光度。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>一株產(chǎn)三萜類化合物的滴孔菌及其應(yīng)用

<141>2017-06-14

<160>2

<210>1

<211>1679

<212>rdna

<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9

<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的18srdna序列

<222>（1）…（1679）

<400>1

cagtttgtactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttgatggta60

ccttgctacatggataactgtggtaattctagagctaatacatgcaatcaaagccccgac120

ttctggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaacgcggttcgccgctccattggtga180

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ttggcttcggggagccggcaacggcaccttgctgctgagaacttgatcaaacttggtca1679

<210>2

<211>727

<212>dna

<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9

<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的its序列

<222>（1）…（727）

<400>2

tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattatcgaattttgaattgggttgtagctggcct60

ccgggcatgtgcacatccttttctttaacacacacacacacacacaccttgtgcactcac120

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