本發(fā)明涉及一種翻白草三萜化合物及其在治療糖尿病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中藥翻白草是薔薇科委陵菜屬植物翻白草(Potentilla discolor Bunge)的干燥全草，始載于《救荒本草》。翻白草廣泛分布于北半球的溫帶和寒帶，我國(guó)以山東、遼寧、安徽三省該藥材產(chǎn)量最大，此外，河北、河南、內(nèi)蒙古、湖南、江蘇和廣西等省份也有分布。其性甘、苦、平，具有清熱解毒、止血消腫之功效，可用于治療痢疾、瘧疾、肺癰等癥。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)翻白草的研究集中于單一環(huán)節(jié)的療效評(píng)價(jià)方面，針對(duì)翻白草的化學(xué)成分、分離提取、藥理活性、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等方面的系統(tǒng)性研究較少，有待進(jìn)一步深入。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種翻白草三萜化合物(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)如式(I)所示翻白草三萜類化合物(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸的應(yīng)用，具體地說(shuō)，是指該化合物在制備治療2型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述藥物用于非胰島素狀態(tài)下促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)糖的攝取利用。

附圖說(shuō)明

圖1為翻白草提取分離過(guò)程示意圖；

圖2-1、2-2為(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸¹H NMR譜圖；

圖3-1、3-2、3-3為(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸¹³C NMR譜圖；

圖4-1、4-2為(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸2D-NMR譜圖；

圖5-1、5-2、5-3為(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸ROESY譜圖。

具體實(shí)施方式

(一)化合物的提取

1、實(shí)驗(yàn)方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料

熔點(diǎn)用X-4型雙目鏡顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(溫度未校正，北京泰克儀器有限公司制造)測(cè)定；UV用Shimadzu UV-2501PC型可見-紫外分光光度計(jì)測(cè)定；NMR：Bruker AV-500型核磁共振儀，δ為ppm，J為Hz。

薄層層析硅膠H、薄層色譜硅膠GF₂₅₄、柱層析硅膠(100-200目，200-300目，青島海洋化工廠)；ODS柱(40-60μm，F(xiàn)uji)，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(購(gòu)自Pharmacia公司)；MCI柱(日本三菱化工株式會(huì)社)。

所用試劑均為分析純級(jí)。

1.2植物來(lái)源

翻白草(Potentilla discolor Bunge)藥材采自廣西，植物標(biāo)本經(jīng)鑒定為薔薇科委陵菜屬植物翻白草，標(biāo)本存放于中國(guó)藥科大學(xué)中藥分析教研室。

1.3提取分離

取采自廣西的干燥翻白草全草14kg，如圖1所示，用90％乙醇水溶液加熱回流提取3次，每次3h，合并提取液，減壓蒸去大部分乙醇，用水混懸，然后用石油醚萃取三次，回收溶劑后得到石油醚部分160g，然后用乙酸乙酯萃取三次，回收溶劑后，得乙酸乙酯部分300g。

乙酸乙酯部分(300g)用400g硅膠(100-300目)拌樣，3.0kg(200-300目)進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿-甲醇(1:0-0:1，v：v)梯度洗脫，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同流分。

將30-50體積％和50-70體積％的流分合并后減壓干燥，進(jìn)行小孔樹脂(MCI)柱層析，用水-甲醇(10：0-0:10，v：v)梯度洗脫，收集70％-90％甲醇洗脫的成分，減壓回收溶劑至浸膏狀，得到有效部位。取少量該有效部位，經(jīng)顏色反應(yīng)、Libermann-Burchard、Molish反應(yīng)，提示為三萜類化合物。再用甲醇溶解有效部位，進(jìn)行反向C18柱層析，丙酮-水(1:0-0:1，v：v)梯度洗脫，反復(fù)純化，得化合物1(17mg)，2(25mg)，3(8mg)，4(20mg)，5(8mg)，6(100mg)，7(5mg)，8(4mg)，9(5mg)，10(120mg)。

化合物5較多地來(lái)自于反相C18柱層析的50-70體積％丙酮-水洗脫的流分。

翻白草分離流程如圖1所示。

依據(jù)與對(duì)照品TLC比對(duì)以及各種譜圖數(shù)據(jù)[IR、MS、¹H NMR、¹³C NMR和2D NMR(HMQC、HMBC、COSY)]最終確證了所得到的化合物分別為：薔薇酸(euscaphic acid,1)、2α-羥基烏蘇酸(corosolic acid,2)、2α,3β,19α-三羥基-熊果酸(tormentic acid,3)、3α,30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸(3α,30-dihydroxylup-20(29)-en-27-oic acid,4)、(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸((20S)-3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid,5)和熊果酸(ursolic acid,6)、山楂酸(maslinic acid,7)、19α-羥基熊果酸(pomolic acid,8)、2α,3α-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸(2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid,9)、齊墩果酸(oleanolic acid,10)。

其中，化合物(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸((20S)-3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid,5)未見文獻(xiàn)報(bào)道，為新化合物。

2、結(jié)構(gòu)鑒定

化合物5：性狀：白色無(wú)定形粉末(MeOH)，易溶于甲醇；

${\[a\]}_D^{24}=-5.4(c=5\×{10}^{-4},MeOH);$

顏色反應(yīng)：10％硫酸乙醇溶液反應(yīng)顯紫紅色，Libermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陰性，以上信息提示為三萜類化合物。HR-TOF-MS給出分子量m/z[M-H]^-517.3900(calcd for C₃₂H₅₃O₅，517.3898)，結(jié)合¹³C-NMR和¹H-NMR譜推測(cè)其分子式為C₃₂H₅₄O₅。

IR(KBr)νmax cm-1 3447,1685；

¹H-NMR(C₅D₅N),δ(ppm):1.79–1.56(m,2H,H-1),2.00–1.72(m,2H,H-2),3.54(s,H-3),1.73(m,1H,H-5),1.49–1.20(m,2H,H-6),1.99–1.96(m,2H,H-7),2.21(m,1H,H-9),1.71–1.36(m,2H,H-11),2.71–1.82(m,2H,H-12),1.89(m,1H,H-13),2.29–1.68(m,2H,H-15),1.76–1.72(m,2H,H-16),1.61(m,1H,H-18),1.93(m,1H,H-19),2.50(m,1H,H-20),1.72–1.50(m,2H,H-21),1.41–1.05(m,2H,H-22),1.04(s,3H,CH₃-23),0.87(s,3H,CH₃-24),0.97(s,3H,CH₃-25),1.21(s,3H,CH₃-26),0.88(s,3H,CH₃-28),4.18(d,J＝8.15Hz,1H,H-29),1.05(d,J＝5.6Hz,3H,CH₃-30),3.30(s,3H,CH₃-31),3.38(s,3H,CH₃-32)；

¹³C-NMR(C₅D₅N),δ(ppm):34.23(C-1),26.63(C-2),75.06(C-3),38.91(C-4),49.57(C-5),18.75(C-6),38.21(C-7),40.92(C-8),51.23(C-9),37.41(C-10),21.20(C-11),28.22(C-12),38.38(C-13),60.79(C-14),25.73(C-15),38.04(C-16),42.60(C-17),50.57(C-18),39.38(C-19),38.07(C-20),22.66(C-21),40.98(C-22),29.10(C-23),22.78(C-24),16.96(C-25),17.59(C-26),178.31(C-27),18.96(C-28),108.75(C-29),9.31(C-30),53.01(C-31),53.58(C-32).

¹H NMR譜上有六個(gè)角甲基信號(hào)(如圖2-1)：δ0.87、0.88、0.97、1.04、1.21(s,3H,each)及1.05(d,J＝5.60Hz)，另外在δ3.30附近還有兩個(gè)明顯的甲基單峰信號(hào)3.30(3H,s)、3.38(3H,s)，提示含有兩個(gè)甲氧基。質(zhì)子信號(hào)δ5.30(H,s)、4.18(H,d，J＝8.15Hz)、3.54(H,s)暗示與羥基等含氧基團(tuán)相連(如圖2-2)。

¹³C NMR譜中有32個(gè)碳信號(hào)，包括六個(gè)角甲基碳信號(hào)δ_C9.31、16.61、17.59、18.75、18.96和21.20(如圖3-1)，兩個(gè)甲氧基碳信號(hào)δ_C53.01、53.58(如圖3-2)，兩個(gè)連氧碳信號(hào)δ_C75.06和60.79以及一個(gè)羧基碳信號(hào)δ_C178.31(如圖3-2和3-3)。

綜合以上信息，推定該化合物為3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸(3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid)，結(jié)構(gòu)如式(I)所示。

根據(jù)2D-NMR可以對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證和全歸屬，如下：

在¹H–¹H COSY譜中2H-1(δ1.56/1.79)與2H-2(δ1.72/2.00)相關(guān)，而后者同時(shí)與H-3(δ3.54)相關(guān)；H-5(δ1.73)與2H-6(δ1.49/1.40)相關(guān)，同時(shí)后者也與2H-7(δ1.96/1.99)信號(hào)發(fā)生耦合；H-9(δ2.21)與2H-11(δ1.71/1.36)相關(guān)，2H-12(δ2.71/1.82)與H-13(δ1.89)相關(guān)，而2H-11(δ1.71/1.36)與2H-12(δ2.71/1.82)也同時(shí)相關(guān)。H-13(δ1.89)與H-19(δ1.93)相關(guān)，后者同時(shí)與2H-21(δ1.50/1.72)相關(guān)，同時(shí)2H-21也與2H-22(δ1.05/1.41)相關(guān)。

在¹HMBC譜中(圖4-1、4-2)，羧基碳信號(hào)δ_c178.31與H-13(δ1.89)相關(guān)；δ1.21(3H-26)、δ1.89(H-13)及δ1.61(H-18)與C-14(δ60.78)相關(guān)；C-28(δ18.96)與H-18(δ1.61)、H-22(δ1.41)相關(guān)。

在ROESY譜中(圖5-1、5-2、5-3)、δ0.88(3H-28)與13β、15β、16β、19β、21β和22βH相關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)，以上信息確證了該化合物為C-27羧基。

在¹H-NMR中,H-3(δ3.54,s)表明H-3處于e鍵上。ROESY中(圖5-1、5-2、5-3)H-3(δ3.54)與H-1β(δ1.79)、H-2β(δ2.0)、3H-24β(δ0.87)相關(guān)，可歸屬A環(huán)上的H，同時(shí)也確證了該構(gòu)型。

此外，HMBC譜中(圖4-1、4-2)、3H-31(δ3.30,s)、3H-32(δ3.38,s)與108.7(C-29)相關(guān)，表明C-29上連有兩個(gè)甲氧基。

另外，通過(guò)C-30的化學(xué)位移大小來(lái)確定C-20的絕對(duì)構(gòu)型，因?yàn)槿绻鸆-20為S構(gòu)型，則C-30的化學(xué)位移為δ_c10.3；如果C-20為R構(gòu)型，則C-30的化學(xué)位移處于較低場(chǎng)，為δ_c17.7。因此，化合物5中C-20為S構(gòu)型。

綜所上述，化合物5的結(jié)構(gòu)確定為(20S)-3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，化合物5為一新化合物，波譜數(shù)據(jù)如下(表1)。

表1化合物5的¹H-NMR、¹³C-NMR數(shù)據(jù)(C₅D₅N,δppm,J Hz).

根據(jù)文獻(xiàn)查閱，從委陵菜屬中分離得到的三萜類化合物幾乎都是游離苷元，主要是五環(huán)三萜，按其分類，主要有烏蘇烷型、齊墩果烷型和羽扇豆烷型；其結(jié)構(gòu)中大多有雙鍵、羥基和羧基，且雙鍵的位置幾乎都是12(13)位，羧基的位置大多都是28位；其結(jié)構(gòu)的變化就主要體現(xiàn)在羥基數(shù)量、取代位置和立體化學(xué)的變化上，最常見的羥基取代模式為2α，2β，3α，3β，19α，23，24位，其它位置則少見。

值得一提的是，在發(fā)明人得到的10個(gè)三萜類化合物中有兩個(gè)為羽扇豆烷型三萜(其中一個(gè)為新化合物)，且羧基都存在于C-27位。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，大多數(shù)天然存在的羽扇豆烷型三萜多為C-28位羧基，C-27位羧基的天然化合物僅有七個(gè)，分別是從唇形科植物Hyptis suaveolens，鼠李科植物Gouania microcarpa以及本植物翻白草中分離得到。現(xiàn)在發(fā)明人又從翻白草中也分離得到一個(gè)新的C-27羧基的羽扇豆烷型三萜，極大地豐富了這一類型的化合物。

二、化合物活性研究

(一)糖消耗

AMP蛋白激酶(AMPK,AMP即腺苷—磷酸)主要控制細(xì)胞新陳代謝：它會(huì)決定身體中的脂肪是儲(chǔ)存還是燃燒，這主要取決于細(xì)胞中總能量。當(dāng)細(xì)胞能量水平較高時(shí)，細(xì)胞中存在高濃度的能量分子ATP(三磷酸腺苷)，因此AMPK會(huì)促使細(xì)胞進(jìn)行“合成代謝”，將多余能量作為脂肪儲(chǔ)存下來(lái)；當(dāng)ATP水平較低時(shí)，AMPK將關(guān)閉合成代謝，反而激發(fā)分解代謝，讓脂肪燃燒為能量。已有研究表明，AMPK能作為治療2型糖尿病的一種有效手段。當(dāng)AMPK探測(cè)到細(xì)胞中ATP濃度較低時(shí)，它們會(huì)利用各種機(jī)制使細(xì)胞中的葡萄糖變?yōu)锳TP。對(duì)于嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，AMPK對(duì)于降低血糖是有效的。

本實(shí)驗(yàn)就是利用糖消耗實(shí)驗(yàn)來(lái)探索翻白草總?cè)撇课缓推渲械娜茊误w能否通過(guò)AMPK途徑對(duì)2型糖尿病實(shí)現(xiàn)治療作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1樣品

①3α,30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸，②本發(fā)明的新化合物(即(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸)，③科羅索酸，④翻白草總?cè)?，其中樣品④用少量DMSO(二甲亞砜)溶解(確保DMSO在培養(yǎng)體系中的終濃度不大于0.1％)，再用PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋，使細(xì)胞上清液中樣品最終濃度依次為10μmol/L，10μmol/L，10μmol/L和100μg/ml，二甲雙胍用PBS溶解，使細(xì)胞上清液中樣品終濃度為1mmol/L。

1.2試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：1115806)；

應(yīng)用液另加0.06g/L青霉素(80萬(wàn)單位)和0.1g/L硫酸鏈霉素(100萬(wàn)單位)及3.7g/L碳酸氫鈉，pH調(diào)至7.2；

注射用青霉素鈉(蘇州二葉制藥有限公司，批號(hào)100501)；

硫酸鏈霉素(南京生興生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0E100E10)；

碳酸氫鈉(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：11022610211)；

新生小牛血清(Newborn calfserum,NCS)(上海微科生化試劑有限公司，批號(hào)：A10110-0904)；

胰蛋白酶(Sunshine公司，批號(hào)：1C221H04)；

DMSO(Snshine公司，批號(hào)：2A022A02)；

二甲雙胍(ALEXIS BIOCHEMICALS，批號(hào)：L20508/a)

葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20101115)；

葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20120701)；

1.3細(xì)胞株

前脂肪細(xì)胞3T3-L1，小鼠源。

1.4動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，18-22g，由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1條件培養(yǎng)液CM(conditioned-medium)的制備

取小鼠脫頸椎處死，75％的酒精中浸泡3-5min，移至超凈臺(tái)中，腹腔注射PBS 5ml/只，輕揉小鼠的腹部2min，用移液槍吸出以6×10⁵接種于6孔板內(nèi)，于5％CO₂，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，4h后吸棄未貼壁細(xì)胞，以PBS洗2次，貼壁細(xì)胞換以KRH(Krebs'-Ringer's-Henseleit)液培養(yǎng)，每孔加KRH液2ml，并在每孔加入10μl的LPS(終溶度為5μg/ml)，48h后收集上清液作為巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液(conditioned-medium，CM)，濾菌，分裝，貯于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

取出凍存的3T3-L1細(xì)胞置37℃水浴中，使其快速融化，轉(zhuǎn)入5ml含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，重懸細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入75ml培養(yǎng)瓶中于5％CO₂，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。前脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，接種后1-2天，表現(xiàn)為單層密集生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，有分支。待細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，用PBS清洗兩遍，0.25％胰蛋白酶消化30s，按1：6傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)排斥法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為10⁶/ml接種于48孔培養(yǎng)板，5％CO₂，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，當(dāng)細(xì)胞基本融合時(shí)，用KRH清洗兩遍換用KRH液饑餓，每孔200μL饑餓4h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3藥物處理與測(cè)定

2.3.1生理?xiàng)l件下篩選

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、樣品組及陽(yáng)性對(duì)照(二甲雙胍)組。先將饑餓好的細(xì)胞用KRH液清洗兩遍，然后用KRH體系加樣品，培養(yǎng)板孔內(nèi)分別加入預(yù)定濃度的樣品①②③④(①②③終濃度10μmol/L，④終濃度100μg/ml)和二甲雙胍(終濃度25μmol/L)，空白組加入同體積的KRH液；各組均加入葡萄糖溶液，使其終濃度為11mmol/L，5％CO₂，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用葡萄糖試劑盒測(cè)定。

2.3.2炎性條件下篩選

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、模型組、樣品組及陽(yáng)性對(duì)照(二甲雙胍)組。培養(yǎng)板孔內(nèi)分別加入預(yù)定濃度的樣品①②③④(①②③終濃度10μmol/L，④終濃度100μg/ml)和二甲雙胍(終濃度1mmol/L)，5％CO₂，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5h，培養(yǎng)板孔內(nèi)模型組、樣品組及陽(yáng)性對(duì)照加入相同體積的CM，空白組加入同體積的KRH液，各組均加入葡萄糖溶液，使其終濃度為11mmol/L，5％CO₂，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用葡萄糖試劑盒測(cè)定。

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1生理?xiàng)l件下篩選結(jié)果

細(xì)胞孵育4h后，用葡萄糖測(cè)定試劑盒于492nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，由此，計(jì)算出細(xì)胞上清中的糖含量，進(jìn)而得出糖消耗量。結(jié)果見表2-1。

表2-1生理?xiàng)l件下糖消耗量(n＝6)

*與空白組相比P<0.05

2.4.2炎性條件下篩選結(jié)果

細(xì)胞孵育4h后，用葡萄糖測(cè)定試劑盒于492nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，由此，計(jì)算出細(xì)胞上清中的糖含量，進(jìn)而得出糖消耗量。結(jié)果見表2-2。

表2-2炎性條件下糖消耗量(n＝8)

*與模型組相比P<0.05

3、結(jié)論

由表2-1可看出，陽(yáng)性對(duì)照組與空白組有顯著差異，提示了實(shí)驗(yàn)的可靠性。三種樣品與空白組相比，糖消耗雖均有升高，但無(wú)顯著差異，提示藥物在激活A(yù)MPK方面無(wú)顯著作用。二甲雙胍為AMPK特異性抑制劑，抑制生理?xiàng)l件下糖的消耗，提示這一途徑與AMPK活化有關(guān)系。

由表2-2可看出，模型組與空白組有顯著差異，顯示造模成功，提示實(shí)驗(yàn)的可靠性。四種樣品中，①、②、③號(hào)樣品的糖消耗量升高，且與模型組相比有顯著差異，說(shuō)明它們?cè)谘仔詶l件下顯著促進(jìn)3T3-L1對(duì)葡萄糖的攝取，提示這三種樣品在炎性條件下可能激活A(yù)MPK，進(jìn)而促進(jìn)糖消耗，②號(hào)樣品的糖消耗量接近陽(yáng)性對(duì)照二甲雙胍。二甲雙胍作為一胰島素敏感性具有AMPK活性，同時(shí)亦具有抗炎活性(可能通AMPK途徑所介導(dǎo))，作為一陽(yáng)性藥，顯著增加糖消耗，提示了AMPK途徑的參與。

糖消耗實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)的是非胰島素狀態(tài)下脂肪細(xì)胞對(duì)糖的攝取利用，這一過(guò)程主要是通過(guò)AMPK途徑而介導(dǎo)。炎性刺激可通過(guò)抑制AMPK的活化而抑制細(xì)胞對(duì)糖的氧化利用。

(二)細(xì)胞毒活性研究

腫瘤是全世界醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)，目前使用的抗腫瘤藥物多是通過(guò)干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)、死亡、分化以及功能等相關(guān)的機(jī)制，來(lái)達(dá)到抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至殺死細(xì)胞的目的?？鼓[瘤藥物的篩選包括體內(nèi)和體外兩種方法。對(duì)于樣品量極少時(shí)，一般以樣品對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用作為初篩。由于癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有相對(duì)的獨(dú)立性，故可在體外建立具有無(wú)限增殖能力的細(xì)胞系，該法具有耗藥量少(2-10mg)，周期短，費(fèi)用低等特點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)中我們采用MTT法研究從翻白草中分離得到的三萜成分化合物(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸和3α,30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸對(duì)人體HepG2，MCF-7和Hela癌細(xì)胞株系的細(xì)胞毒性。

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器及設(shè)備

超凈工作臺(tái)(吳縣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器材廠)恒溫CO₂培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus)96孔培養(yǎng)板(NUNCLON)酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise)倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)全自動(dòng)雙蒸水機(jī)(上海玻璃儀器一廠)超速離心機(jī)OPTIMAXL-100K(貝克曼公司)。

1.2試劑與化合物

RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)；胰蛋白酶(SIGMA)；胎牛血清(HYCLONE)；MTT(SIGMA)；DMSO(SIGMA)。

3α,30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，化合物經(jīng)HPLC分析，純度≥98％。

(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，化合物經(jīng)HPLC分析，純度≥98％。

1.3細(xì)胞株及培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)和人肝癌細(xì)胞株(HepG2)(均由北京協(xié)和藥物所提供)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，含10％小牛血清，37℃，5％CO₂。

2、實(shí)驗(yàn)部分

2.1實(shí)驗(yàn)原理

MTT比色法是一種經(jīng)典的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞礬(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法己廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。

2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成5000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以8×103個(gè)/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種200μl，37℃，5％CO₂培養(yǎng)24小時(shí)。設(shè)置一系列不同濃度，同時(shí)對(duì)照組換含有等體積的PBS培養(yǎng)基，每組設(shè)3平行孔，37℃，5％CO₂培養(yǎng)2天。1500r/min離心，棄去上清液，每孔加入5mg/ml新鮮配置的含MTT工作液20μl，37℃，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小心棄去上清液，用胰酶消化后，每孔加入150μl DMSO溶解MTT甲臜沉淀，用微型超聲震蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長(zhǎng)為490nm測(cè)定光密度值。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(1-藥物組A₄₉₀值/對(duì)照組A₄₉₀)×100％。然后求得該化合物的半數(shù)殺傷濃度IC₅₀。

3、結(jié)果

經(jīng)過(guò)初步的細(xì)胞毒活性測(cè)試，計(jì)算得3α,30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)的IC₅₀分別為24.9，17.5和20.1mmol/L，(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)的IC₅₀分別為21.7，13.8和14.9mmol/L。提示(20S)-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)具有良好的抑制活性，可用于乳腺癌、子宮癌、肝癌的臨床治療。

表3翻白草三萜化合物的細(xì)胞毒活性(n＝8)