本發(fā)明涉及一種線粒體靶向的粘度熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

粘度是衡量一種濃稠流體的流動性和擴散性的主要因素，同時是流體擴散速率的主要參考指標。微環(huán)境的粘度在病理學研究中起到非常重要的作用，因為粘度的變化往往會影響到細胞內(nèi)環(huán)境中各種新陳代謝的進行。從細胞生物力學的角度看，細胞結(jié)構(gòu)可以分為細胞質(zhì)，細胞膜和細胞骨架。其中細胞骨架被認為是剛性的結(jié)構(gòu)，而細胞膜和細胞質(zhì)則具有一定的粘彈性。當細胞處于病理狀態(tài)時，細胞內(nèi)粘度就會發(fā)生變化。所以粘度就是衡量這種粘彈性的參考指標。粘度極大地影響細胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)量和信號的運輸，生物大分子之間的相互作用，以及活性代謝ROS和RNS在細胞內(nèi)水平上的擴散。

細胞內(nèi)不同區(qū)域的粘度在生物系統(tǒng)中起著非常重要的作用，而不同區(qū)域的粘度變化就會引起相應(yīng)的生理功能的改變或疾病的發(fā)生。線粒體是細胞產(chǎn)生能量的倉庫，粘度的改變可以通過降低線粒體膜的流動性，增加ROS的產(chǎn)生。被廣泛證明，增加線粒體粘度可能會導致一些疾病，如阿茲海默癥，帕金森病，糖尿病等。因此，量化細胞內(nèi)線粒體粘度十分重要。

本專利通過分子設(shè)計合成了線粒體靶向的粘度熒光探針，隨著粘度的增加，探針的熒光強度顯著增強，具有高度的靈敏性。并且可以對細胞內(nèi)微環(huán)境的粘度進行熒光成像。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前粘度熒光探針檢測所面臨的問題的現(xiàn)狀，本發(fā)明通過分子設(shè)計，合成出一種具有線粒體靶向的粘度熒光探針，本發(fā)明還提供了該探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種線粒體靶向的粘度熒光探針，該探針分子的分子式為：C₃₇H₄₃N₄O₃⁺，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

上述的粘度熒光探針的制備方法，它包括以下步驟：

1)將1eq的N，N-二乙基水楊醛，1eq的米氏酸溶于50mL乙醇中，攪拌過程中加入0.5mL哌啶，常溫反應(yīng)20min，然后90℃加熱回流反應(yīng)2h，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，減壓過濾，真空干燥，得到粗產(chǎn)品，用二氯甲烷溶解后通過柱色譜進行分離純化得到化合物1-1；

2)將1eq的化合物1-1溶于5mLDMF中，然后依次加入1eq的N-羥基琥珀酰亞胺，1.1eq的EDCI，常溫反應(yīng)12h，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液倒入100mL冰水中，有固體析出，減壓過濾，水洗，真空干燥，得到粗產(chǎn)品，用二氯甲烷溶解，通過柱色譜分離得到化合物1-2；

3)將1eq的化合物1-2溶于10mLDCM中，然后依次加入1.5eq的3-溴丙胺氫溴酸，1.5eq的TEA，黑暗條件下，常溫反應(yīng)6h，反應(yīng)完全后，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并通過柱色譜分離得到化合物1-3；

4)將1eq的化合物1-3和1eq的2,3,3,-三甲基吲哚溶于1mLDMF中，氮氣保護，100℃加熱回流反應(yīng)12h，反應(yīng)完全后，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并通過柱色譜分離得到化合物1-4；

5)將1eq的化合物1-4和1eq的4-二甲氨基苯甲醛溶于10mL乙醇中，氮氣保護，90℃加熱回流反應(yīng)10h，反應(yīng)完全后，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用通過柱色譜分離得到目標探針化合物，簡記為CI-Vis。

所述步驟1)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。

所述步驟2)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:50。

所述步驟3)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。

所述步驟4)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。

所述步驟5)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:15。

上述的粘度熒光探針的合成路線如下：

本發(fā)明所述的線粒體靶向的粘度熒光探針的用途，該熒光探針可以應(yīng)用于水環(huán)境和生物細胞體系中粘度變化的傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)探針的合成只需要幾步就可以完成，且后處理過程相對簡單；(2)本發(fā)明實現(xiàn)了粘度探針的高靈敏性，靶向性好的特點。此外，用肉眼就可以觀察到隨著溶液粘度的增加而發(fā)生的顏色的變化，伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到熒光顏色變化，是一種具有生色傳感功能的熒光探針。基于其特異性且顯著的顏色變化，該試劑可作為顯示水溶液中和生物細胞內(nèi)粘度變化的指示劑，可進行實時定性及定量的目視比色法檢測。故而，本發(fā)明是一種簡單，快速，靈敏的粘度特異性檢測試劑，在生物分子檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其性能將在實施例中結(jié)合附圖給予詳細說明。

附圖說明

圖1是實施例1中探針CI-Vis的¹H NMR圖譜；

圖2是探針CI-Vis隨粘度的增加熒光譜圖的變化情況；

圖3是探針CI-Vis溶液在粘度(甘油0％)和粘度(甘油95％)的溶液顏色的變化；

圖4是探針CI-Vis溶液在粘度(甘油0％)和粘度(甘油95％)溶液用紫外燈照射后熒光顏色的變化；

圖5是探針CI-Vis應(yīng)用于細胞中粘度進行熒光成像，圖中a)探針濃度為5μM加入到HeLa細胞中培養(yǎng)30min后明場圖；b)對a的藍通道熒光成像圖；c)對a的紅通道熒光成像圖；d)紅通道對藍通道的比率成像圖；e)經(jīng)過制菌霉素刺激30min再與5μM探針培養(yǎng)30min后的明場圖；f)對e的藍通道熒光成像圖；g)對e的紅通道熒光成像圖；h)紅通道對藍通道的比率成像圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制，實施例中化合物的號碼對于上述方案中化合物的號碼。

實施例1

化合物CI-Vis粘度熒光探針的合成

化合物1-1的合成：

將N，N-二乙基水楊醛(3.0g,15.5mmol,1eq)，米氏酸(2.24g,15.5mmol,1eq)溶于50mL乙醇中，攪拌過程中加入0.5mL哌啶，常溫反應(yīng)20min，然后90℃加熱回流反應(yīng)2h。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，減壓過濾，真空干燥，得到粗產(chǎn)品，用二氯甲烷溶解，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。產(chǎn)率為85％。

化合物1-2的合成：

將化合物1-1(940mg，3.76mmol，1eq)溶于5mLDMF中，然后依次加入N-羥基琥珀酰亞胺(432.4mg，3.76mmol，1eq)EDCI(793mg，4.14mmol，1.1eq)，常溫反應(yīng)12h。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液倒入100mL冰水中，有固體析出，減壓過濾，水洗，真空干燥，得到粗產(chǎn)品。用二氯甲烷溶解，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:50。產(chǎn)率為81％。

化合物1-3的合成：

將化合物1-2(1.17g，3.36mmol，1eq)溶于10mLDCM中，然后依次加入3-溴丙胺氫溴酸(1.15g，5.04mmol，1.5eq)TEA(509mg，5.04mmol，1.5eq)，黑暗條件下，常溫反應(yīng)6h，TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。產(chǎn)率為72％。

化合物1-4的合成：

將化合物1-3(400mg，1.05mmol，1eq)和2,3,3,-三甲基吲哚(156mg，1.05mmol，1eq)溶于1mLDMF中,氮氣保護，100℃加熱回流反應(yīng)12h。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥。減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。產(chǎn)率為42％。

探針化合物CI-Vis的合成：

將化合物1-4(100mg，0.217mmol，1eq)和4-二甲氨基苯甲醛(32.4mg，0.217mmol，1eq)溶于10mL乙醇中,氮氣保護，90℃加熱回流反應(yīng)10h。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥。減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:15。產(chǎn)率為60％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.82(t,J＝5.7Hz,1H),8.57(s,1H),8.31(d,J＝15.5Hz,1H),7.96(d,J＝9.2Hz,2H),7.77(dd,J＝11.7,7.6Hz,2H),7.63(d,J＝9.0Hz,1H),7.54(t,J＝7.2Hz,1H),7.47(t,J＝7.4Hz,1H),7.15(d,J＝15.6Hz,1H),6.79(dd,J＝9.1,2.3Hz,1H),6.70(d,J＝9.1Hz,2H),6.62(d,J＝2.0Hz,1H),4.57(t,J＝7.1Hz,2H),3.54–3.47(m,3H),3.47–3.39(m,3H),3.07(s,6H),2.20–2.07(m,2H),1.76(s,6H),1.15(t,J＝7.0Hz,7H).如圖1所示。

實施例2

化合物CI-Vis粘度熒光探針隨粘度的增加熒光譜圖的變化

取實施例1制備的CI-Vis粘度熒光探針溶于二甲基亞砜(DMSO)中，制成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出100μL加入到10mL的離心管當中，用乙醇和甘油配成不同比例的粘度值，以420nm為激發(fā)光，測量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖2所示。由圖2可見，隨著粘度的增加熒光逐漸增強。

實施例3

化合物CI-Vis熒光探針對粘度的可視化檢測

從實施例2中熒光探針儲備液中取出分別40μL加入到兩個5mL的樣品管當中，一個加入3mL乙醇，一個加入3mL 95％的甘油，觀察溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從玫紅色變成粉紅色(圖3)。伴隨著紫外燈下肉眼可視的粘度熒光探針發(fā)出明亮的紅色熒光(圖4)，說明是一種具有生色傳感功能的熒光探針。

實施例4

化合物CI-Vis熒光探針對細胞的熒光成像

我們將本發(fā)明探針應(yīng)用于HeLa細胞中對線粒體中的粘度的變化進行熒光成像應(yīng)用，結(jié)果如圖5所示。具體操作步驟如下：將5μM探針DMSO溶液加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中在37度條件下培養(yǎng)30min后用共聚焦顯微鏡進行成像。通過對HeLa細胞進行明場、藍通道(λ_ex＝405nm；λ_em＝425-475nm)和紅通道(λ_ex＝561nm；λ_em＝570-620nm)進行熒光成像。并進行紅通道/藍通道的比率成像。我們利用制霉菌素作為刺激物來改變細胞中線粒體內(nèi)的粘度，并利用CI-Vis探針進行熒光成像，來研究粘度變化前后藍通道和紅通道熒光強度的變化，并通過兩個通道的比率成像，進一步說明探針可以應(yīng)用于細胞線粒體中對其粘度的變化進行熒光成像的應(yīng)用。將10μM的制霉菌素加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中在37度條件下培養(yǎng)30min后加入5μM探針DMSO溶液，并繼續(xù)孵育30min。通過對HeLa細胞進行明場、藍通道和紅通道進行熒光成像，并進行紅通道/藍通道的比率成像。發(fā)現(xiàn)制霉菌素刺激前后比率成像圖有了明顯的改變，說明探針可以對細胞線粒體中粘度變化進行熒光成像。