本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§119要求2014年3月26日提交的臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/970,794的優(yōu)先權(quán)，其整體援引加入本文。序列表本申請(qǐng)包含以ASCII形式通過(guò)EFS-Web提交的序列表，并且其整體援引加入本文。2015年3月22日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝名UofMaryland，大小為16,384字節(jié)。發(fā)明背景動(dòng)物基因組的改造具有多種用途。當(dāng)通過(guò)例如沉默基因、阻止蛋白的表達(dá)、改變表達(dá)產(chǎn)物或表達(dá)水平來(lái)改造基因時(shí)，基因或基因區(qū)域的功能變得明顯?；虻母淖冞€可以導(dǎo)致修改為更期望的表型。當(dāng)可以改造缺陷基因時(shí)，疾病的治療也是可能的。動(dòng)物，特別是其中受精卵中的原核難以視覺(jué)上識(shí)別的大型馴養(yǎng)動(dòng)物的有效基因靶向具有許多挑戰(zhàn)，阻止靶向構(gòu)建體的可靠遞送以便有效靶向這樣的動(dòng)物基因組中的特定區(qū)域。發(fā)明概述本方法允許將核酸分子注射入大型動(dòng)物的受精卵，然后核酸分子并入細(xì)胞核，從而不需要視覺(jué)上識(shí)別受精卵的原核。所述方法提供在精子使卵受精之后和形成原核之前將核酸分子注射入受精卵。一實(shí)施方案中的方法采用同源重組，導(dǎo)致形成的核具有靶向的所關(guān)注的核酸分子。在本發(fā)明的實(shí)施方案中可以在靶基因座誘導(dǎo)雙鏈斷裂。向所關(guān)注的異源核酸分子以及與雙鏈斷裂位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有同源性的序列提供核酸酶以及單鏈寡核苷酸或雙鏈靶向載體，這允許在所述位點(diǎn)同源重組。在一實(shí)施方案中，當(dāng)使用單鏈寡核苷酸時(shí)，側(cè)翼序列可以是50個(gè)堿基對(duì)(bp)或更多，當(dāng)使用雙鏈靶向載體時(shí)，可以是500bp或更多。所述方法可以用于通過(guò)例如抑制表達(dá)、缺失、等位基因的置換或?qū)⒃谝粚?shí)施方案中表達(dá)獨(dú)特蛋白的序列引入動(dòng)物基因組來(lái)修改動(dòng)物中序列的表達(dá)。附圖說(shuō)明圖1是豬和小鼠受精卵的顯微照片。圖2示出CRISPR介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)基因敲入PRNP基因座。A)是靶向載體的示意圖，其示出與內(nèi)源PRNP基因座同源的靶向臂。術(shù)語(yǔ)“上”指切割位點(diǎn)上游的500bp的靶向PRNP基因座，而“下”指1000bp的下游側(cè)翼序列。UBC指(人泛素C啟動(dòng)子)，GFP指綠色熒光蛋白；bPA(牛多腺苷酸化轉(zhuǎn)錄終止序列)；PGK/EM7–驅(qū)動(dòng)新霉素(或者真核的G418)和卡那霉素抗性(原核)選擇標(biāo)記Neo/kan的表達(dá)的混合真核(磷酸甘油激酶)和原核(EM7，使得能夠在大腸桿菌中組成型表達(dá)抗生素抗性的源自T7啟動(dòng)子的合成細(xì)菌啟動(dòng)子，專(zhuān)利/US7244609)RNA聚合酶II啟動(dòng)子序列。將線(xiàn)性化的靶向載體與Cas9mRNA和靶向PRNP的單鏈導(dǎo)向(sgRNA)注射入豬受精卵。B)是示出所述方法的實(shí)施方案的原理圖。Cas9在PRNP的第三外顯子中誘導(dǎo)雙鏈斷裂。然后用靶向載體修復(fù)斷裂的DNA，導(dǎo)致靶向等位基因。圖3A和B是示出已發(fā)育至胚泡階段的代表性胚胎表現(xiàn)出GFP表達(dá)的照片，A)示出綠色熒光顯微鏡下的胚胎，而B(niǎo))示出明視野顯微鏡視野。圖4是使用引物的凝膠，一個(gè)在靶向載體內(nèi)，另一個(gè)在同源區(qū)外，顯示正確大小的特異性條帶，證實(shí)靶向至預(yù)期的基因座。圖5A和B示出CRISPR介導(dǎo)的同源性指導(dǎo)的豬基因組的修復(fù)和編輯，利用單鏈寡核苷酸并入受精卵。A)是注射入豬受精卵的Cas9載體、靶向ZBED6基因座的sgRNA以及包含LoxP位點(diǎn)和EcoR1限制性酶位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸的原理圖。CMV和T7指HA標(biāo)簽中的啟動(dòng)子HA，NLS為核定位信號(hào)。B)是示出包含重組EcoRI位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增子的凝膠，可以將其消化以產(chǎn)生兩個(gè)片段，證實(shí)功能性EcoR1酶位點(diǎn)的重組。圖6示出重組ZBED6等位基因的測(cè)序(示出的整個(gè)序列為SEQIDNO:13)，示出插圖中的EcoR1位點(diǎn)(下劃線(xiàn))和LoxP(SEQIDNO:11)。圖7示出A)具有l(wèi)oxP靶向的原核的原理圖；和兩個(gè)凝膠，B)示出具有l(wèi)oxP靶向的ZBED6的凝膠以及C)具有l(wèi)oxP靶向的PRNP。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述50年以前當(dāng)通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染使得細(xì)胞耐受次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)選擇培養(yǎng)基時(shí)首先報(bào)道了遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Szybalska,E.etal.Geneticsofhumancellline.IV.DNA-mediatedheritabletransformationofabiochemicaltrait.ProcNatlAcadSciUSA48,2026-2034(1962))。通過(guò)在顯微操作器上安裝的微吸管的輔助下將DNA直接注射入組織培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)一步提高了外源轉(zhuǎn)移的效率。(Graessmann,etal.Retransformationofasimianvirus40revertantcellline,whichisresistanttoviralandDNAinfections,bymicroinjectionofviralDNA.JVirol32,989-994(1979)；Capecchi,etal.HighefficiencytransformationbydirectmicroinjectionofDNAintoculturedmammaliancells.Cell22,479-488(1980))。這是將轉(zhuǎn)基因注射入小鼠受精卵的原核(PN)(Gordon,Jetal.GenetictransformationofmouseembryosbymicroinjectionofpurifiedDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,7380-7384(1980))并產(chǎn)生第一只轉(zhuǎn)基因小鼠的前奏。(Brinster,R.L.etal.Somaticexpressionofherpesthymidinekinaseinmicefollowinginjectionofafusiongeneintoeggs.Cell27,223-231(1981))。在通過(guò)PN注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的第一次證實(shí)的成功之后不久，相似的方法用來(lái)產(chǎn)生生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因豬。(Hammer,R.E.etal.Productionoftransgenicrabbits,sheepandpigsbymicroinjection.Nature315,680-683(1985))。PN注射方法仍然是廣泛使用的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因馴養(yǎng)的大型動(dòng)物如豬、牛、綿羊、山羊、駱駝、狗、貓等的技術(shù)，但是，僅1％注射的受精卵產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因奠基者。(Niemann,H.Transgenicpigsexpressingplantgenes.ProcNatlAcadSciUSA101,7211-7212(2004)；Prather,etal.Geneticallymodifiedpigsformedicineandagriculture.Biotechnology&GeneticEngineeringReviews25,245-265(2008))。除了產(chǎn)生奠基動(dòng)物的低效率，該技術(shù)在豬和其他大型動(dòng)物模型中具有挑戰(zhàn)性，其中胚胎是混濁的，并且難以定位原核用于注射大DNA構(gòu)建體(圖1)。除了PN注射，已嘗試產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他方式，包括精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)座子，具有不同程度的成功。(Park,etal.RoleofstemcellsinlargeanimalgeneticengineeringintheTALENs-CRISPRera.ReprodFertilDev26,65-73(2013))。特別地結(jié)合使用CRISPR/Cas系統(tǒng)或其他位點(diǎn)特異性核酸酶，這類(lèi)DNA構(gòu)建體可以靶向基因的特定區(qū)域，允許候選基因的位點(diǎn)特異性敲入、核苷酸的修飾或等位基因的置換。但是，所有方法均具有一些相似的限制，包括(但不限于)：(1)基因組中的隨機(jī)整合；(2)插入誘變；(3)位置沉默；(4)在整合體的數(shù)量和表達(dá)中缺少控制；(5)不能在胚胎轉(zhuǎn)移之前預(yù)先篩選穩(wěn)定整合；以及(6)不能缺失內(nèi)源基因(即基因“敲除”或“KO”，其中基因表達(dá)失活或失效)。“基因靶向”抵消了上述所有缺點(diǎn)，由此可以靶向預(yù)期的基因序列用于缺失或外源DNA整合?；虬邢虻某晒梢詺w因于發(fā)現(xiàn)側(cè)翼同源等基因序列組合陽(yáng)性和陰性選擇方案促進(jìn)在預(yù)期基因座的重組事件的產(chǎn)生和鑒定(Luciw,etal.LocationandfunctionofretroviralandSV40sequencesthatenhancebiochemicaltransformationaftermicroinjectionofDNA.Cell33,705-716(1983)；Kucherlapati,R.S.etal.Homologousrecombinationinmonkeycellsandhumancell-freeextracts.ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology49,191-197(1984))。但是，用于敲除基因、引入點(diǎn)突變或敲入基因的基于同源重組(HR)的基因靶向的主要限制之一是獲得正確重組事件的效率低，通常在106–107個(gè)細(xì)胞中1個(gè)的范圍中。此外，這些修飾在自然中通常是單等位基因的，需要第二輪靶向用于雙等位基因(純和)修飾。在缺少真正的胚胎干細(xì)胞(ESC)的豬和其他家畜物種中，體細(xì)胞，通常胎兒成纖維細(xì)胞用于基因靶向，并且將修飾的細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移中的供體細(xì)胞或克隆以產(chǎn)生遺傳修飾(GM)的動(dòng)物。當(dāng)使用體細(xì)胞作為前體時(shí)基因靶向效率相對(duì)較低，這進(jìn)一步加上成纖維細(xì)胞的相對(duì)早期衰老，排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中期望的敲入(KI)或其他遺傳改變的表征。隨著豬和其他大型動(dòng)物的長(zhǎng)妊娠長(zhǎng)度和成熟至生殖年齡，通過(guò)核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生純和敲入(或“KI”，其中將核酸序列插入在特定基因座)動(dòng)物或克隆以產(chǎn)生重組豬是技術(shù)上挑戰(zhàn)和成本高昂的。這里示出一種改良的在受精卵中靶向基因組編輯的方法，其允許在動(dòng)物中基因組靶向，包括具有光密度從而因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)中干擾觀察的脂質(zhì)顆粒而原核模糊的受精卵的動(dòng)物。這使得難以用人的裸眼視覺(jué)上鑒定受精卵的原核并將核酸分子注射入核。原核是性細(xì)胞的單倍體核，在卵母細(xì)胞(卵)通過(guò)精子細(xì)胞(精子)受精之后這里存在雄性和雌性原核。原核的膜溶解并且染色體對(duì)齊，然后成為單個(gè)二倍體核的部分并且細(xì)胞分裂發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以在原核形成核之前確定時(shí)間框架。利用同源重組技術(shù)，利用直接注射入這類(lèi)動(dòng)物受精卵細(xì)胞，核酸分子精確靶向至基因組的位置現(xiàn)在是可能的，其中注射發(fā)生在受精之后和原核形成核之前。利用這種方法已發(fā)現(xiàn)核酸分子會(huì)有效重組入核。一實(shí)施方案提供在受精之后至多18-24小時(shí)注射。在一實(shí)施方案中，時(shí)間框架在一實(shí)施方案中至多5小時(shí)，而在另一實(shí)施方案中至多12小時(shí)。一實(shí)施方案提供注射發(fā)生在受精后3、4或5小時(shí)。對(duì)于受精后約3-5小時(shí)，細(xì)胞通常保持在受精培養(yǎng)基中，并且會(huì)在去除培養(yǎng)基之后注射。在另一實(shí)施方案中，注射發(fā)生在受精后約至多16小時(shí)，在一實(shí)施方案中為受精后3-4-5-6-7-8-9-10-12-13-14-15小時(shí)至多16小時(shí)，并且在另一實(shí)施方案中為受精后8-12小時(shí)。這避免需要使用胎兒成纖維細(xì)胞或核轉(zhuǎn)移系統(tǒng)或克隆。將所關(guān)注的核酸序列與將所述序列靶向至基因組中期望的靶基因座且提供在該位點(diǎn)同源重組的組分一起注射。在一實(shí)施方案中這類(lèi)組分包括用于切割靶基因座的核酸酶，連同將核酸酶引導(dǎo)至靶向基因座的指導(dǎo)RNA。在所述方法中可以利用提供將所關(guān)注的核酸分子(NOI)靶向至靶基因的靶位點(diǎn)的任何方法。以實(shí)例而不是限制的方式提供以下方法。指導(dǎo)核酸分子是將核酸酶引導(dǎo)至基因組中的特定切割位點(diǎn)的核酸分子，無(wú)論通過(guò)使用結(jié)合結(jié)構(gòu)域、識(shí)別結(jié)構(gòu)域、指導(dǎo)RNA或其他機(jī)制。在適合在引導(dǎo)切割靶基因座中操作指導(dǎo)核酸分子的條件下將指導(dǎo)核酸分子引入細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得許多可以使用的方法，切割基因靶區(qū)域的最常用的核酸酶，連同會(huì)識(shí)別靶基因座的序列并引導(dǎo)切割該基因座的序列。在本文描述的方法中可以使用可以切割多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵的任何核酸酶。通過(guò)實(shí)例而不是限制的方式，可用的系統(tǒng)包括利用位點(diǎn)特異性核酸酶(SSN)的那些系統(tǒng)，如ZFN(鋅指核酸酶)，(Whyte,J.J.etal.GenetargetingwithzincfingernucleasestoproduceclonedeGFPknockoutpigs.MolReprodDev78,2(2011)；Whyte,etal.CellBiologySymposium:Zincfingernucleasestocreatecustom-designedmodificationsintheswine(Susscrofa)genome.JAnimSci90,1111-1117(2012))；TALEN(轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶)(參見(jiàn)，Carlson,D.F.etal.EfficientTALEN-mediatedgeneknockoutinlivestock.ProcNatlAcadSciUSA109,17382-17387(2012)；Tan,W.etal.Efficientnonmeioticalleleintrogressioninlivestockusingcustomendonucleases.ProcNatlAcadSciUSA110,16526-16531(2013)；Lillico,S.G.etal.Livepigsproducedfromgenomeeditedzygotes.Scientificreports3,2847(2013))，以及相對(duì)容易允許編輯動(dòng)物基因組如豬基因組的CRISPR(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù))–相關(guān)的(Cas)核酸酶系統(tǒng)(Hai,T.,Teng,F.,Guo,R.,Li,W.&Zhou,Q.One-stepgenerationofknockoutpigsbyzygoteinjectionofCRISPR/Cassystem.CellRes24,372-375(2014))。使用重組酶如美國(guó)專(zhuān)利第6,720,475號(hào)中描述的FLP/FRT或美國(guó)專(zhuān)利第5,658,772號(hào)中描述的CRE/LOX可以用來(lái)將多核苷酸序列整合入特定的染色體位點(diǎn)。如Puchtaetal.,PNASUSA93(1996)pp.5055-5060所述，大范圍核酸酶已用于將供體多核苷酸靶向入特定的染色體位置。ZFN與結(jié)合至因?yàn)槭褂娩\離子而具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域一起工作。TALEN利用可以特異性地識(shí)別DNA序列中的堿基對(duì)的具有氨基酸重復(fù)的結(jié)構(gòu)域。對(duì)于兩個(gè)系統(tǒng)的討論，參見(jiàn)Voytas等人美國(guó)專(zhuān)利第8,697,853號(hào)，其整體援引加入本文。這些系統(tǒng)利用為每個(gè)靶序列準(zhǔn)備的酶。CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)在古細(xì)菌和細(xì)菌中已演變?yōu)樽鳛榛赗NA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)以檢測(cè)并切割入侵的病毒和質(zhì)粒。(Horvath,P.&Barrangou,R.CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea.Science327,167-170(2010)；Wiedenheft,etal.RNA-guidedgeneticsilencingsystemsinbacteriaandarchaea.Nature482,331-338(2012))。不像需要組裝DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)以將核酸酶引導(dǎo)至靶位點(diǎn)的ZFN和TALEN，CRISPR/Cas系統(tǒng)利用RNA作為指導(dǎo)。CRISPR基因座是細(xì)菌基因中識(shí)別的一類(lèi)不同的分散短序列重復(fù)(SSR)。該重復(fù)是成簇存在的短元件，其由具有基本恒定長(zhǎng)度的獨(dú)特的間插序列規(guī)律間隔。觀察到它們?yōu)槊庖呦到y(tǒng)，其中將與病毒或質(zhì)粒序列同源的核酸分子整合入CRISPR基因座。靶向并切割外源DNA或RNA。該系統(tǒng)適合在明確的基因座靶向插入核酸分子。一般來(lái)說(shuō)，CRISPR系統(tǒng)的特征在于促進(jìn)在設(shè)計(jì)指導(dǎo)序列具有互補(bǔ)性的靶序列位點(diǎn)處形成CRISPR復(fù)合物的元件，這里靶序列和指導(dǎo)序列之間的雜交促進(jìn)CRISPR復(fù)合物的形成。不一定要求完全互補(bǔ)性，只要有足夠的互補(bǔ)性以引起雜交并促進(jìn)CRISPR復(fù)合物的形成。在CRISPR系統(tǒng)中，一種酶CRISPR酶用于利用短RNA分子靶向。兩種基本組分用于該系統(tǒng)，指導(dǎo)RNA和內(nèi)切核酸酶。指導(dǎo)RNA是指定靶位點(diǎn)和tracrRNA的內(nèi)源序列，需要結(jié)合至酶。指導(dǎo)序列提供靶標(biāo)特異性，而tracrRNA提供支架特性。這些指導(dǎo)序列通常為約15多達(dá)20-25個(gè)堿基對(duì)(bp)，其與靶位點(diǎn)雜交并引導(dǎo)CRISPR復(fù)合物結(jié)合至靶序列。可以在相同或不同載體上提供編碼CRISPR相關(guān)酶的序列。Cas蛋白的非限制性實(shí)例包括Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也稱(chēng)作Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，它們的同源物，或者它們的修改版本。在一實(shí)施方案中，酶為II型CRISPR系統(tǒng)酶，并且為Cas9或者其變體或修改。這些酶是已知的；例如，化膿性鏈球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中于登錄號(hào)Q99ZW2下找到。酶或Cas9蛋白可以用作切口酶或核酸酶并切割DNA的一條或兩條鏈。Cas9具有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域RuvC和HNH，并且在使用兩者時(shí)切割兩條鏈。Cas9核酸酶與靶CRISPRRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)形成核糖核酸酶復(fù)合物，并且使用嵌合RNA以靶向基因組序列并誘導(dǎo)DSB。CRISPR/Cas核酸酶和其他SSN可以將基因組DNA中的靶向雙鏈斷裂引入靶基因座，這在單鏈(SS)DNA寡核苷酸或雙鏈(DS)靶向載體的存在下，分別導(dǎo)致所選核苷酸的基于同源重組(HR)的改變或轉(zhuǎn)基因的KI。在另一實(shí)施方案中，具有所關(guān)注的核酸分子的SS寡核苷酸可以與Cas9mRNA和sgRNA一起使用以靶向特定靶基因區(qū)域的修飾。在另一實(shí)施方案中，靶基因與gRNA序列互補(bǔ)，并且具有前間區(qū)序列鄰近基序或PAM序列。這輔助Cas9結(jié)合。對(duì)于CRISPR/Cas系統(tǒng)細(xì)節(jié)的討論，參見(jiàn)Congetal.,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,932,814；8,871,445和8,906,616，它們整體援引加入本文。基因組中的斷裂可以通過(guò)非同源末端連接DNA修復(fù)途徑(NHEJ)或通過(guò)同源介導(dǎo)的修復(fù)途徑(HDR)修復(fù)。NHEJ可以通過(guò)引起移碼或提前終止密碼子發(fā)生來(lái)擾亂基因。HDR是提供避免這類(lèi)問(wèn)題的核酸分子插入的實(shí)施方案。向雙鏈斷裂提供DNA修復(fù)模板，其中提供與切割位點(diǎn)兩側(cè)的基因組序列具有同源性并雜交的序列(同源臂)。在一實(shí)施方案中，將DNA模板或側(cè)翼序列轉(zhuǎn)染入具有CRISPR/Cas載體的細(xì)胞。雖然基于HDR的基因靶向事件非常罕見(jiàn)，但是效率可以通過(guò)在靶基因座引入DSB來(lái)提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)(>1000-倍)(Moehle,E.A.etal.Targetedgeneadditionintoaspecifiedlocationinthehumangenomeusingdesignedzincfingernucleases.ProcNatlAcadSciUSA104,3055-3060(2007))。DSB之后，與DSB兩側(cè)的末端具有同源性的SSoligo或DS載體可以產(chǎn)生具有靶向基因組改變或轉(zhuǎn)基因整合的動(dòng)物(Cui,Letal.Thepermissiveeffectofzincdeficiencyonuroguanylinandinduciblenitricoxidesynthasegeneupregulationinratintestineinducedbyinterleukin1alphaisrapidlyreversedbyzincrepletion.TheJournalofNutrition133,51-56(2003)；Meyer,Metal.Genetargetingbyhomologousrecombinationinmousezygotesmediatedbyzinc-fingernucleases.ProcNatlAcadSciUSA107,15022-15026(2010))。在發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中，CRISPR/Cas通過(guò)直接注射入豬受精卵介導(dǎo)HDR和核苷酸編輯和基因KI，避免需要核轉(zhuǎn)移/克隆以產(chǎn)生遺傳修飾(GM)的動(dòng)物。每個(gè)同源臂的長(zhǎng)度會(huì)根據(jù)對(duì)基因組修飾的大小而變化。這里，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)可以利用比以前不使用本發(fā)明時(shí)采用的小得多的同源臂。以前需要與靶基因側(cè)翼序列同源的序列具有6000bp區(qū)域中的大小。但是，這里使用雙鏈斷裂和位點(diǎn)特異性核酸酶系統(tǒng)時(shí)，證實(shí)所述方法需要少于6000bp同源區(qū)，并且僅操作至少約40bp，至少約50bp和之間的量，或者更多上游和約40bp，至少約50bp和之間的量，或者更多下游序列用于單鏈oligo和約至少300bp，至少500bp多達(dá)1000bp和之間的量，或者更多用于雙鏈靶向載體。在制備這類(lèi)序列中這提供較不費(fèi)力的過(guò)程，將制備靶載體的時(shí)間減少至1-2周或更少而不是6個(gè)月。與SS寡核苷酸或DS載體一起提供這些同源臂。本方法提供基因編輯中的擴(kuò)展應(yīng)用以提供更高的效率，增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、多達(dá)100％，以及獲得的重組事件數(shù)量的之間的量?；謴?fù)的事件的增加倍數(shù)多達(dá)1000倍或更多。這導(dǎo)致高效率、在大型動(dòng)物基因編輯中的實(shí)用性以及在許多設(shè)置中使用。關(guān)于靶基因，是指期望如所描述地進(jìn)行修飾的動(dòng)物基因組內(nèi)的任何核酸分子或者其中期望插入核酸分子的任何核酸分子。靶多核苷酸可以是編碼基因產(chǎn)物(例如，蛋白)的序列或非編碼序列(例如，調(diào)節(jié)多核苷酸或無(wú)用DNA)。所述方法可用于敲入和敲除。例如，可以通過(guò)插入轉(zhuǎn)錄激活物上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄，或者利用轉(zhuǎn)錄阻遏物抑制表達(dá)。不希望受到限制，在基因編輯的各種應(yīng)用中包括修飾(例如，缺失、插入、易位、失活、激活、突變)多種細(xì)胞類(lèi)型中的靶多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，可以修飾表達(dá)的多肽。在例如基因療法、藥物篩選、疾病診斷、預(yù)后、增加或減少生長(zhǎng)和身體組成以及提高動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量或組成中有廣譜應(yīng)用。所述方法可用于期望修飾疾病基因的任何位置。其他實(shí)例包括改進(jìn)的飼料使用和肉組合物、增強(qiáng)的繁殖性能、改變動(dòng)物產(chǎn)品如奶的組分含量(如乳糖含量)以及減少或消除表型如公豬膻味表型。所述方法可用于所謂的敲入，其中將序列插入基因組，或者用于所謂的敲除，其中基因表達(dá)減少或消除或中斷。這允許理解和控制基因及其下游影響。靶核苷酸可以包括許多疾病相關(guān)基因和多核苷酸以及信號(hào)生化途徑相關(guān)基因和多核苷酸。靶多核苷酸的實(shí)例包括與信號(hào)生化途徑相關(guān)的序列，例如，信號(hào)生化途徑相關(guān)基因或多核苷酸。靶多核苷酸的實(shí)例包括疾病基因或多核苷酸?！凹膊　被蚧蚨嗪塑账岚ㄅc影響動(dòng)物中的疾病相關(guān)的任何基因或多核苷酸，并且可以包括在源自疾病影響的組織的細(xì)胞中產(chǎn)生與非疾病對(duì)照的組織或細(xì)胞相比異常水平或異常形式的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的基因或多核苷酸。疾病基因是與患有或發(fā)展疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加或減少或者從疾病恢復(fù)相關(guān)的任何基因。其可以是變得以異常高水平表達(dá)的基因；其可以是變得以異常低水平表達(dá)的基因，其中改變的表達(dá)與疾病的發(fā)生和/或發(fā)展相關(guān)。疾病基因還指具有直接負(fù)責(zé)疾病病因或者與負(fù)責(zé)疾病病因的基因連鎖不平衡的突變或遺傳變化的基因。轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物可以是已知或未知的，并且可以是正常或異常水平。通過(guò)使用本文的方法用與疾病相關(guān)的基因或編碼的蛋白可以治療、預(yù)防或研究大量動(dòng)物疾病。一些實(shí)例包括提供對(duì)傳染性海綿狀腦病的抗性的PRNP基因；在防護(hù)PRRSV中免疫應(yīng)答基因的SOCS1、SOD2、RBP4、HLA-B、HLA-G、PPP2R1A和TAP1基因的上調(diào)或者IL18、TF、C4BPA、C1QA、C1QB和TYROBP基因的下調(diào)；KI誘餌對(duì)抗人畜共患的流感疾病，消除負(fù)面表型如公豬膻味，以及基因滲入農(nóng)業(yè)有益的性狀。潛在用途的另一實(shí)例提供引入干擾核酸分子的動(dòng)物細(xì)胞。例如，可以采用雙鏈RNA分子(dsRNA)。在這種方法中，總的來(lái)說(shuō)，基于靶核酸分子的序列部分或完全產(chǎn)生雙鏈的RNA。產(chǎn)生dsRNA的方式的細(xì)節(jié)可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的變化，并且通過(guò)實(shí)例而不是限制的方式，包括Graham等人，美國(guó)專(zhuān)利第6,573,099號(hào)的方法，其中使用對(duì)應(yīng)于靶序列的兩個(gè)拷貝的序列，或者Fire等人，美國(guó)專(zhuān)利6,326,193的方法(兩者援引加入本文)，其中第一鏈?zhǔn)菍?duì)應(yīng)于靶核酸的RNA序列，而第二鏈?zhǔn)桥c靶序列互補(bǔ)的RNA序列，每個(gè)專(zhuān)利整體援引加入本文。這些鏈互相雜交以形成抑制dsRNA。對(duì)應(yīng)于靶核酸分子的鏈可以對(duì)應(yīng)于其全部或部分，只要形成dsRNA。當(dāng)使用靶核酸的互補(bǔ)(反義)鏈時(shí)，其可以與靶核酸分子的全部或部分互補(bǔ)，只要形成的dsRNA干擾靶核酸分子。dsRNA觸發(fā)應(yīng)答，其中RNAseIIIDicer酶將dsRNA加工為約21–23個(gè)核苷酸的小干擾RNAs(siRNA)，其形成破壞同源mRNA的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISC。(參見(jiàn)，Hammond,S.M.,etal.,Nature(2000)404:293-296).一般來(lái)說(shuō)，可以使用多達(dá)10個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、300、500、550、500、550或更多以及之間的任何量。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解有許多可用的用途以及哪個(gè)可用于本文所述的方法。所述方法可以用于任何動(dòng)物。它們大多數(shù)可用于在受精之后具有原核的動(dòng)物，所述原核至少部分視覺(jué)上模糊，使得難以注射入原核。這樣的原核不可以通過(guò)人類(lèi)肉眼視覺(jué)上觀察，即，用人眼和用顯微鏡觀察，不借助對(duì)比，或者其他方法以允許觀察。這類(lèi)動(dòng)物包括“大型馴養(yǎng)動(dòng)物”，即豬、牛、馬、狗、貓，以及其他反芻動(dòng)物如綿羊、山羊、公牛、麝牛、美洲駝、羊駝、原駝、鹿、野牛、羚羊、駱駝和長(zhǎng)頸鹿、公牛、麝牛、美洲駝、羊駝、原駝、鹿、野牛、羚羊、駱駝和長(zhǎng)頸鹿。家畜包括在可以使用所述方法的動(dòng)物中。此外，在其中細(xì)胞質(zhì)透明的其他動(dòng)物模型如靈長(zhǎng)類(lèi)、兔、水貂和其他模型中，所述方法仍是有吸引力的選擇，因?yàn)槠湓试S不必猜測(cè)何時(shí)形成原核，并且取而代之可以將材料注射入細(xì)胞質(zhì)。所述方法特別可用于豬。豬是經(jīng)濟(jì)上重要的農(nóng)業(yè)動(dòng)物。此外，人們渴望豬的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。與人和小鼠相似，豬是單胃的，因此在營(yíng)養(yǎng)吸收、運(yùn)輸和代謝的研究中發(fā)揮主要作用。(Patterson,etal.Thepigasanexperimentalmodelforelucidatingthemechanismsgoverningdietaryinfluenceonmineralabsorption.Experimentalbiologyandmedicine233,651-664(2008))。動(dòng)物基因組編輯領(lǐng)域中的進(jìn)展包括豬基因組的測(cè)序。(Groenen,M.A.etal.Analysesofpiggenomesprovideinsightintoporcinedemographyandevolution.Nature491,393-398(2012)).總的來(lái)說(shuō)，根據(jù)需要解決的生物學(xué)問(wèn)題，合適的豬模型可用于研究。但是，到目前為止缺少用豬作為“優(yōu)選模型”的動(dòng)機(jī)，這是由于落后與小鼠模型的GM模型。本方法針對(duì)這些缺點(diǎn)。最近幾年中，有越來(lái)越多的共識(shí)，小鼠雖然仍是強(qiáng)大的遺傳模型物種，但是具有局限性，并且不可以滿(mǎn)足全方位的生物醫(yī)學(xué)需要以應(yīng)對(duì)預(yù)防醫(yī)學(xué)(肥胖、不育、心血管病癥)、鑒定新的或改進(jìn)的診斷以及農(nóng)場(chǎng)衍生的人畜共患疾病的模型。作為替代，大型馴養(yǎng)動(dòng)物如豬獲得青睞，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮馄蕦W(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)上與人更相似，同時(shí)保持作為產(chǎn)多胎物種以及允許長(zhǎng)期研究的相對(duì)長(zhǎng)壽命的優(yōu)勢(shì)。小鼠模型由于解剖學(xué)或生理學(xué)差異而不符合預(yù)期的實(shí)例包括囊性纖維化、眼部和心臟疾病。(Rogers,C.S.etal.DisruptionoftheCFTRgeneproducesamodelofcysticfibrosisinnewbornpigs.Science321,1837-1841(2008)；Welsh,Metal.Developmentofaporcinemodelofcysticfibrosis.TransactionsoftheAmericanClinicalandClimatologicalAssociation120,149-162(2009)；Zhou,L.etal.Differentiationofinducedpluripotentstemcellsofswineintorodphotoreceptorsandtheirintegrationintotheretina.StemCells29,972-980(2011)；Whyte,J.J.etal.Vascularendothelium-specificoverexpressionofhumancatalaseinclonedpigs.TransgenicRes20,989-1001(2011))。因?yàn)閹缀跛械募邑i都是雜種，來(lái)自這些動(dòng)物模型的所得表型比近交小鼠品系更可靠，并且可應(yīng)用于人類(lèi)疾病。同樣地，家豬更適合人畜共患或傳染性疾病研究，其中它們用作疾病的儲(chǔ)備或載體，或者是病原體的天然宿主。除了用作人類(lèi)疾病的模型，家豬是這樣的研究夢(mèng)寐以求的，其中相對(duì)長(zhǎng)的壽命、與人的身體大小和生理學(xué)的密切相似性提供優(yōu)勢(shì)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，豬是營(yíng)養(yǎng)研究的優(yōu)選模型。關(guān)于注射是表示將裝置插入細(xì)胞并且核酸分子進(jìn)入細(xì)胞的任何方便的方法。通過(guò)實(shí)例而不是限制的方式，這可以用注射移液管完成，所述注射針可以包括裝有核酸分子的注射器。移液管穿過(guò)透明帶。與現(xiàn)有技術(shù)相反，不需要能夠視覺(jué)上觀察原核以使注射裝置與原核接觸。取而代之，僅需要將核酸分子引入受精的卵母細(xì)胞，不需要關(guān)心是否接觸原核，并且引入細(xì)胞質(zhì)是足夠的。注射在受精之后和原核形成核之前進(jìn)行。在受精之前，雌性DNA處于中期II階段并且尚未完成減數(shù)分裂。精子刺激減數(shù)分裂和核的最終形成。這里注射發(fā)生在核形成之前。一實(shí)施方案提供注射發(fā)生長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)，并且在一實(shí)施方案中，受精后12-16小時(shí)，在另一實(shí)施方案中，受精后3、4、5或6-12小時(shí)，并且在另一實(shí)施方案中，受精后16小時(shí)。如本文中指出的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定在特定動(dòng)物中何時(shí)會(huì)形成核，并且在此之前注射。例如，在豬和牛中，時(shí)間框架為受精后12-16小時(shí)。不希望受到任何理論的束縛，據(jù)信這提供足夠時(shí)間以驅(qū)散細(xì)胞質(zhì)中的分子，并且提供核酸酶重組組分以將核酸分子整合入最終的核。這不僅允許將核酸分子引入其中難以注射原核的大型動(dòng)物，而且還提供高事件恢復(fù)，這里，多達(dá)100％，并且避免如果在DNA復(fù)制之后發(fā)生重組可能發(fā)生的產(chǎn)生嵌合體的問(wèn)題。如本文所用，除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)核酸或多核苷酸指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它們的聚合物。因此，該術(shù)語(yǔ)包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分，cDNA，合成的多脫氧核糖核酸序列等，并且可以是單鏈或雙鏈的，以及DNA/RNA雜合體。除非另有說(shuō)明，特定核酸序列還暗中涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指明的序列。具體地，簡(jiǎn)并密碼子取代可以通過(guò)產(chǎn)生這樣的序列獲得，其中用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代一個(gè)或多個(gè)所選(或全部)密碼子的第三部分(Batzeretal.(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsukaetal.(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Rossolinietal.(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。術(shù)語(yǔ)核酸與基因、cDNA和基因編碼的mRNA可交換使用?！岸嚯摹币话阒鸽暮偷鞍住Ｔ谀承?shí)施方案中，多肽可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個(gè)氨基酸或者更多或之間的任何量。一般認(rèn)為肽是超過(guò)50個(gè)氨基酸。當(dāng)提到本發(fā)明的多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“同源物”表示基本上保留與所述多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。可以基于保留多肽的一種或更多種生物學(xué)活性的能力選擇這類(lèi)片段、衍生物或同源物。多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。因此，當(dāng)提到所關(guān)注的核酸分子(NOI)時(shí)，表示期望引入動(dòng)物細(xì)胞核的核酸分子。因此，通過(guò)實(shí)例而不是限制的方式，NOI可以是靶基因，并且可以是修飾的；RNA；干擾RNA；可以對(duì)靶基因或另一基因具有各種影響的核酸分子，如本文討論的；新插入基因組并且可以在基因組內(nèi)產(chǎn)生額外的多肽的核酸分子，或者任何這些的組合。期望引入動(dòng)物細(xì)胞基因組的任何核酸分子都可以是NOI?！懊艽a子優(yōu)化”可以用來(lái)優(yōu)化序列用于在動(dòng)物中表達(dá)，并且定義為通過(guò)用更經(jīng)?；蜃畛Ｓ糜谠搫?dòng)物基因的密碼子代替天然序列的至少一個(gè)、一個(gè)以上或大量密碼子來(lái)修改核酸序列用于在所關(guān)注的動(dòng)物如豬的細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)。各種物種表現(xiàn)出對(duì)特定氨基酸的某些密碼子的特定偏好。Cas9可以是密碼子優(yōu)化用于提高表達(dá)的序列之一。在一方面，可以產(chǎn)生RNA的包含密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)的核酸片段的多核苷酸用適合在給定動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)的密碼子使用編碼多肽或者其片段、變體或衍生物。通過(guò)將優(yōu)選用于所關(guān)注的宿主基因的密碼子并入DNA序列來(lái)制備這些多核苷酸?！爱愒础焙怂岱肿邮窃谙噜徍怂岱肿优赃呂刺烊话l(fā)現(xiàn)的任何核酸分子。異源多核苷酸或異源核酸或外源DNA片段指源自與特定宿主細(xì)胞無(wú)關(guān)的來(lái)源的多核苷酸、核酸或DNA片段，或者，如果來(lái)自相同來(lái)源，通過(guò)人為干預(yù)在組成和/或基因組基因座中修改其原始形式。宿主細(xì)胞中的異源基因包括特定宿主細(xì)胞的內(nèi)源基因，但是已修改或引入宿主。因此，該術(shù)語(yǔ)指細(xì)胞外源或異源的核酸分子，或者與細(xì)胞同源但是在其中通常未發(fā)現(xiàn)該元素的宿主核酸內(nèi)的位置中的核酸分子。然后可以通過(guò)使用載體、質(zhì)?；驑?gòu)建體等將核酸引入動(dòng)物宿主細(xì)胞?！拜d體”是用于將核酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞的任何方式。載體可以是單鏈、雙鏈或部分雙鏈的，可以具有游離末端或沒(méi)有游離末端，可以是DNA、RNA或兩者。已知各種多核苷酸可用作載體。質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。關(guān)于一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體是指包含必需的調(diào)節(jié)元件用于適當(dāng)表達(dá)可操作地連接的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)載體。載體可以是另一DNA片段可以連接的復(fù)制子，以便帶來(lái)所連接片段的復(fù)制。復(fù)制子是任何遺傳元件(例如，質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)，其功能為體內(nèi)DNA或RNA復(fù)制的自主單元，即能夠在其自身的控制下復(fù)制。術(shù)語(yǔ)“載體”包括用于在體外、離體或體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒方式。病毒載體包括但不限于腺伴隨病毒、慢病毒、甲病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、梅毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、埃巴病毒、狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。非病毒載體包括但不限于質(zhì)粒、染色體、帶電荷的脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-或RNA蛋白復(fù)合物以及生物聚合物。除了核酸，載體還可以包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)，和/或可用于選擇、測(cè)量和監(jiān)測(cè)核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移至哪個(gè)組織、表達(dá)的持續(xù)時(shí)間等)的選擇標(biāo)記。可以例如通過(guò)質(zhì)粒上包含的基因如amp、kan、gpt、neo和hyg基因所賦予的對(duì)抗生素的抗性來(lái)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用來(lái)將這樣的序列插入病毒載體并在病毒DNA中產(chǎn)生醚改變?nèi)绮迦虢宇^序列等的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。(參見(jiàn)例如，Sambrooketal.,2001.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition.ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)?！昂小敝缚梢栽谔囟ㄏ拗菩晕稽c(diǎn)插入載體的DNA片段。DNA片段編碼所關(guān)注的多肽或產(chǎn)生RNA，并且設(shè)計(jì)盒和限制性位點(diǎn)以確保盒插入正確的閱讀框用于轉(zhuǎn)錄和翻譯?？梢詫⒑怂岱肿釉?'端可操作地連接至合適的啟動(dòng)子，并且在3'端可操作地連接至終止信號(hào)和poly(A)信號(hào)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”表示包含表達(dá)控制序列如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止序列的核酸分子位于載體或細(xì)胞中，從而核酸分子產(chǎn)生的多肽或RNA的受到表達(dá)控制序列的調(diào)節(jié)?？寺『涂刹僮鞯剡B接這類(lèi)序列的方法是本領(lǐng)域公知的。啟動(dòng)子可以指導(dǎo)組成型表達(dá)或組織優(yōu)選的表達(dá)。組織優(yōu)選(有時(shí)稱(chēng)作組織特異性)的啟動(dòng)子可以用來(lái)靶向特定細(xì)胞或組織內(nèi)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。這類(lèi)啟動(dòng)子在特定細(xì)胞區(qū)域或組織中以比細(xì)胞或組織的其他部分高的水平表達(dá)，并且可以主要在細(xì)胞區(qū)域或組織中表達(dá)。實(shí)例包括分泌至細(xì)胞壁、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保持表達(dá)或者靶向液泡或其他細(xì)胞器的啟動(dòng)子。其他可以指導(dǎo)主要表達(dá)至肌肉、神經(jīng)元、骨、皮膚、血液或者特定器官或細(xì)胞類(lèi)型。這類(lèi)啟動(dòng)子還可以指導(dǎo)以時(shí)間方式表達(dá)，在發(fā)育或細(xì)胞周期的特定階段表達(dá)。用于一實(shí)例的啟動(dòng)子可以是聚合酶(pol)I、polII或polIII啟動(dòng)子。polI啟動(dòng)子的實(shí)例包括雞RNApolI啟動(dòng)子。polII啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(RSV-LTR)啟動(dòng)子和猿猴病毒40(SV40)立即早期啟動(dòng)子。polIII啟動(dòng)子的實(shí)例包括U6和H1啟動(dòng)子。可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如金屬硫蛋白啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的其他實(shí)例包括T7噬菌體啟動(dòng)子、T3噬菌體啟動(dòng)子、β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子和Sp6噬菌體啟動(dòng)子。具有終止和poly(A)信號(hào)的DNA的實(shí)例是SV40晚期poly(A)區(qū)。這些可商購(gòu)的表達(dá)載體和系統(tǒng)的使用是本領(lǐng)域公知的。載體可以包含多拷貝的所關(guān)注的核酸分子或者核酸分子的組合；而且可以將多個(gè)載體同時(shí)或順序引入細(xì)胞。其他組分可以包括于載體或也引入細(xì)胞的多個(gè)載體中，如多腺苷酸化序列、增強(qiáng)子、信號(hào)肽、誘導(dǎo)元件、內(nèi)含子、翻譯控制序列等。如上文提到的，可以使用允許具有載體的細(xì)胞存活或者具有載體的細(xì)胞的其他鑒定的選擇標(biāo)記。當(dāng)其插入細(xì)胞時(shí)將核酸分子引入細(xì)胞。當(dāng)這樣的DNA或RNA已引入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞已被外源或異源DNA或RNA“轉(zhuǎn)染”。當(dāng)提到核酸分子整合入細(xì)胞時(shí)表示分子已重組并成為基因組的部分。所關(guān)注的核酸分子的存在可以通過(guò)任何方便的技術(shù)確定，如鑒定標(biāo)記基因的存在；通過(guò)PCR等檢測(cè)插入序列的存在；檢測(cè)來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞、組織或流體的表達(dá)產(chǎn)物；RNA印跡或蛋白印跡分析；或者任何其他容易獲得的方法。本文引用的所有參考文獻(xiàn)均援引加入本文。提出的實(shí)例通過(guò)說(shuō)明的方式提供，并不表示限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例CRISPR介導(dǎo)的基因敲入：在發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中，主要朊蛋白(PRNP)已用作所謂的“安全港”基因座用于轉(zhuǎn)基因的靶向KI。在小鼠中，通常將轉(zhuǎn)基因敲入Rosa26基因座，其在所有靶組織中廣泛表達(dá)，并且已顯示如果缺失，對(duì)后代的存活不是至關(guān)重要的。(SEQIDNO:1為PRNP蛋白基因ID:494014)。因此，Rosa26是插入轉(zhuǎn)基因的優(yōu)選位點(diǎn)以防止：a)轉(zhuǎn)基因的無(wú)意沉默；以及b)將轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入基因組中的脫靶位點(diǎn)所引起的插入誘變。在小鼠中，除了Rosa26，PRNP是另一廣泛表達(dá)的基因，并且不是生存力需要的，因此鑒定為安全港基因座。這樣的安全港基因是滿(mǎn)足通過(guò)在該位點(diǎn)引入載體或核酸分子對(duì)細(xì)胞沒(méi)有已知的不利影響的標(biāo)準(zhǔn)并且具有跨細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄能力的基因。除了小鼠，PRNP-/-牛也是健康的。(Richt,J.A.etal.Productionofcattlelackingprionprotein.NatBiotechnol25,132-138(2007))。任何安全港基因可以在需要時(shí)用于核酸分子的敲入。在豬和其他大型動(dòng)物中，Rosa26基因座尚未充分表征。因此，選擇PRNP作為安全港基因座用于轉(zhuǎn)基因的靶向KO和KI以及建立重組豬。結(jié)果在下文中討論。A)靶向載體的組裝：產(chǎn)生基因靶向載體，其由與鄰近PRNP基因外顯子-3的Cas9切割位點(diǎn)同源的500bp上臂和1000bp下臂(分別為SEQIDNO:2和3)組成。利用包含獨(dú)特的限制性序列AscI和XhoI的引物，將上臂的1000bp序列克隆入表達(dá)GFP(綠色熒光蛋白；參見(jiàn)SEQIDNO:4和GenBankU73901)的piggyBac載體中的相應(yīng)序列。(SEQIDNO:5、6)。同樣地，利用由BsiWI和MluI組成的引物，將切割位點(diǎn)下游的1000bp序列擴(kuò)增并克隆入相同的GFPpiggyBac載體。(SEQIDNO:7、8)。通過(guò)用AscI和HpaI消化載體產(chǎn)生最終的靶向載體，并且將沒(méi)有原核序列的線(xiàn)性化的載體注射入胚胎。B)豬胚胎中CRISPR介導(dǎo)的靶向基因敲入：我們研究了是否可以通過(guò)直接注射入胚胎來(lái)完成基因靶向，從而避免需要在中間細(xì)胞類(lèi)型中靶向并且通過(guò)克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生GM動(dòng)物。如圖2a和2B中指出的，通過(guò)共注射靶向載體和CRISPR(用于產(chǎn)生DSB)，我們已證實(shí)GFP轉(zhuǎn)基因成功KI入胚胎中的PRNP基因座。在圖2中，UBC指(人泛素C啟動(dòng)子)，GFP指綠色熒光蛋白；bPA(牛多腺苷酸化轉(zhuǎn)錄終止序列)；PGK/EM7–驅(qū)動(dòng)新霉素(或者真核的G418)和卡那霉素抗性(原核)選擇標(biāo)記Neo/kan的表達(dá)的混合真核(磷酸甘油激酶)和原核(EM7，使得能夠在大腸桿菌中組成型表達(dá)抗生素抗性的源自T7啟動(dòng)子的合成細(xì)菌啟動(dòng)子，專(zhuān)利/US7244609)RNA聚合酶II啟動(dòng)子序列。在圖中“上”中指Cas9切割位點(diǎn)側(cè)翼的上游500bp同源序列，而“下”指切割位點(diǎn)側(cè)翼的1000bp下游序列。簡(jiǎn)單地說(shuō)，來(lái)自母豬的成熟卵母細(xì)胞購(gòu)自ARTInc.(Madison,WI)，并且在它們的商業(yè)成熟培養(yǎng)基#1中過(guò)夜運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。置于成熟培養(yǎng)基#1(由ART提供)中24小時(shí)之后，將50-75個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)置于500μl包含0.14％PVA、10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、0.57mM半胱氨酸、0.5IU/ml豬FSH和0.5IU/ml羊LH的組織培養(yǎng)基199(TCM199)中，并且在38.5℃和空氣中5％CO2、100％濕度下培養(yǎng)額外的20小時(shí)。(Abeydeera,Letal.Maturationinvitroofpigoocytesinprotein-freeculturemedia:fertilizationandsubsequentembryodevelopmentinvitro.BiolReprod58,1316-1320(1998))。將COC在包含0.01％PVA的HEPES緩沖培養(yǎng)基中的0.1％透明質(zhì)酸酶中渦旋4分鐘以去除成熟后的卵丘細(xì)胞。將30-35個(gè)成熟、裸露的卵母細(xì)胞的組置于100μl改進(jìn)的Tris緩沖培養(yǎng)基(mTBM)中，并且利用新鮮公豬精液根據(jù)建立的方案(Abeydeera,L.R.&Day,B.N.Fertilizationandsubsequentdevelopmentinvitroofpigooytesinseminatedinamodifiedtris-bufferedmediumwithfrozen-thawedejaculatedspermatozoa.BiolReprod57,729-734(1997))受精。將1-2ml精液與包含1mg/mlBSA的達(dá)爾伯克磷酸緩沖鹽水(DPBS)混合至10ml的最終體積，并且在1000xg、25℃下離心4分鐘；將精子在DPBS中洗滌總計(jì)3次。最后洗滌之后，將精子重懸于mTBM培養(yǎng)基中，以5x105個(gè)精子/ml的最終濃度添加至卵母細(xì)胞，并且在38.5℃和5％CO2下共溫育5小時(shí)。受精之后5小時(shí)，利用EppendorfTransjector用100ng/ul的Cas9mRNA連同50ng/ulsgRNA靶向PRNP和2ng/ul線(xiàn)性化的靶向載體注射推斷的受精卵。大約，將50nl的混合物注射入豬受精卵，并且在豬體外培養(yǎng)PZM3培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Yoshioka,Ketal.Birthofpigletsderivedfromporcinezygotesculturedinachemicallydefinedmedium.BiolReprod66,112-119(2002))額外的6天。篩選現(xiàn)在已生長(zhǎng)至胚泡階段的注射的胚胎中插入的GFP盒的表達(dá)。在圖3A和3B中，在體外培養(yǎng)的第6天，GFP的表達(dá)在擴(kuò)大的胚泡中顯而易見(jiàn)。還通過(guò)利用靶向載體之內(nèi)和之外的引物PCR擴(kuò)增胚泡DNA證實(shí)GFP的靶向整合(圖4)。(SEQIDNO:9、10)。通過(guò)PCR擴(kuò)增子的測(cè)序獲得最終證實(shí)。我們已進(jìn)行這些GFPKI胚胎轉(zhuǎn)移至受體母豬，動(dòng)物在懷孕的第60天妊娠，并且可能誕生活動(dòng)物。胚胎中單鏈oligo介導(dǎo)的基因組編輯：通過(guò)動(dòng)物基因組測(cè)序，現(xiàn)在鑒定可以影響討論中的表型的數(shù)量性狀基因座(QTL)以及在某些情況下數(shù)量性狀核苷酸(QTN)是可能的。測(cè)試這些QTL和QTN勢(shì)在必行。特異性地改變核苷酸以準(zhǔn)確反映優(yōu)勢(shì)或疾病基因型的能力分別是改進(jìn)畜牧業(yè)和產(chǎn)生疾病模型的有力方法。我們已研究是否可能改變核苷酸以獲得期望的表型。這種方法對(duì)畜牧業(yè)具有最直接的適用性，其中以高精確度改變負(fù)面性狀如公豬膻味、角表型、疾病易感性和其他參數(shù)以使動(dòng)物受益。我們已測(cè)試是否可以靶向特定基因座用于通過(guò)利用包含期望的核苷酸修飾的單鏈oligo引入核苷酸。在這種情況下，我們已研究我們是否可以靶向PRNP基因座以修改現(xiàn)有核苷酸之一以產(chǎn)生新的EcoR1限制性酶(圖5A)。使用的啟動(dòng)子為CMV和T7，HA指_HA標(biāo)簽，NLS是用來(lái)促進(jìn)核定位的核定位信號(hào)。此外，為了易于分析，34個(gè)核苷酸LoxP位點(diǎn)(SEQIDNO:11已工程化在oligo上(圖5A)。如圖5B所示，我們能夠通過(guò)注射包含LoxP和EcoR1限制性酶的oligo連同Cas9mRNA和靶向ZBED6的sgRNA來(lái)改變候選ZBED6基因座。(SEQIDNO:12)。ZBED6是調(diào)節(jié)豬中胰島素樣生長(zhǎng)因子2表達(dá)的鋅指蛋白。參見(jiàn)Markljungetal.,“ZBED6,anoveltranscriptionfactorderivedfromadomesticatedDNAtransposonregulatesIGF2expressionandmusclegrowth.PLoSBiol.7(12)e1000256。如上文提到的，工程化的ZBED6基因座可以通過(guò)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度增加34個(gè)核苷酸而看到，然后通過(guò)EcoR1消化證實(shí)。最終證實(shí)來(lái)自靶向基因座的測(cè)序，其中限制性位點(diǎn)如下劃線(xiàn)所示(圖6)。我們能夠用PRNP重復(fù)該結(jié)果(見(jiàn)圖7。以100ng/ul引入Cas9；sgRNA為50ng/ul，并且LoxPoligo為2ng/ul)。通過(guò)消除中間步驟和在胚胎中直接進(jìn)行基因靶向，我們已建立非常有效的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因和/或編輯動(dòng)物的方法。我們方法的優(yōu)勢(shì)是雙重的，一是在產(chǎn)生靶向載體中，第二是在構(gòu)建體遞送中。關(guān)于靶向載體，主要優(yōu)勢(shì)是對(duì)靶向構(gòu)建體中的冗長(zhǎng)同源臂的要求較不嚴(yán)格。在我們的實(shí)驗(yàn)中，基因靶向可以用每個(gè)靶向臂上小至300、多達(dá)500、多達(dá)1000bp的同源性完成，通過(guò)基因座DNA的PCR容易獲得或者可以合成為G-塊并獲得自IDTInc.的DNA片段(圖2A)。這與豬胎兒成纖維細(xì)胞(PFF)中基因靶向需要的至少6kb的同源性形成鮮明對(duì)比。關(guān)于DNA構(gòu)建體的遞送，我們已鑒定受精后的時(shí)間窗口，其中可以將DNA和CRISPR/Cas注射入原始豬受精卵的細(xì)胞質(zhì)，允許DNA在核膜形成時(shí)包裝在原核中，從而允許胚胎中同源重組介導(dǎo)的基因靶向。這種策略消除在豬中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的另一主要瓶頸，其中定位受精卵中的原核用于注射轉(zhuǎn)基因已成為限制性因素。此外，對(duì)于所有篩選的胚泡，基因靶向的效率為80-100％，表現(xiàn)出胚胎中KI構(gòu)建體的準(zhǔn)確靶向。最后的優(yōu)勢(shì)是在胚胎中精確編輯僅幾個(gè)核苷酸的能力，其具有改變表型用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用和用于產(chǎn)生生物醫(yī)學(xué)模型的能力?？偟膩?lái)說(shuō)，我們已開(kāi)發(fā)了技術(shù)以將大型動(dòng)物生物技術(shù)引入基因組時(shí)代。序列表SEQIDNO:1PRNP蛋白NCBI參考序列：NC_010459.4ACGTACGCGGCCAAAAGAGTCTCAACTCCCTCCCAGAGACTCAGATTTCCGACCAGCTTGGCAGATCCCGGGCGCCGGAGCGCCAGAGCGCGCGCGCGCGCCGCCGCCGCCTCCCTTCCCCGCCCGCGCGCCTCGCCACCCCTCGGCGCCAGACACTGACAGCCCCGGAGCTGCGAGCGTCTTCTGTTCCAGCGGTGGCAGGTAAACAGCCGGGTCGCCCCGAGAACTGGGGGTGCCAAGGTCGGGAGTCAGAACCCCCCGCCTTGGAGCTTAGGCGCAAGGGTGAGCGGCCCACTTGGGGCGCTAGGGAAACCTTGACAGAGAGGGGGGCGGGGGACTTCCGGCGGGCGGGGGGCGCGACAGGCCTGCCCCCGCTTGTTCGTCGGCTTAACATTGGCCCCGCTCACATTTGCTTTCCAGGTGGGGTGAGGGCCCTTTACTCGGAATGGGGCTTGGTGGGGGAAGGGGGTGCCTGGGGCTGGCCGCGACCCCTGGGCAGGGAGGCGGATGGTGGCGGGGAGTCTAGCCCTCTCCCACGCGCGTCCGCGGCTGGCGGAGGATGGGAGAGGCGCGCCGGCACCGGGGCCGCAGGGCCGGGAACTCAAGGAGGGTCGCCCACGGCCTCCGCTGAGGCGCTCGGAGGAGAACCAGGGAGAGGGGCCGGCGTGCGGCTCTCCCGAGGCCCCAGGGGCACGTGGGGTGGGGATGATGGCCCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGCCCCAAGGGGCCCGTTGGGGGGGGGTGATGGCCCAGGCCCCGGCGGGAGGGGCCCTTGCCGCCGCCACCATGGAGCTCCTCCGGAGAGACGGCCCACCTGCCATCCACGCGGCCCGGGGGTGCTGGGGAGGCCGCAGCGGGGTGGGCCTCCTGCATCCCTGGGGATGGAGACCGGGCACGTGGTCCGACCTTCGGGCCTCGGCGGGCGGAGTCTCGGGCGGCCCCACCCTCACTGTCGGCCGAGACGTCCAGGTCCCTGGGGGCCGAGTGTCCGGAGAGCCCAGGTGCTTTGCTTTTCACTGTCTCCACTGCCCCTCCCCGAAGGGAACTGGGCGGTCAGAGGCTCCTCTCAAGGGGATCAGGGCCGGACAGCTCTCCTCCTGATCCACTTGTGTGGGCTGCCCTTTCAGGCTTGATTGTAAACAACGAGGAGAAGTCCATTTTTACTGTCCCTTTTCATTTTTTTCCCTTTTCTAAATTTGTAGCAACCATGGCAAATCAGTTTTTAAAATCATAACCCACAGCCATCAATCCACCCTTACCATCTCAAAGCCACTGCTTTCTGTTTTTCAGTTTTCTGTCTCCAGATTCGTACATAACGCAAAGAAATTTCAACTGCCCTGATTATGATTATCCTCCTCTAATGGCCGAGTTATTTTCTTCTGCTTAAAGCGTCGCAGTTTAATAAGCAGTTCCCCGAATGCTGAACATTTGAAATGTTTCGTTTTTTCTTGCAAAAAAACCTTCCAGGTATAACAGTATTAAAGAAAGAATAGGAATAGGAGTTCCCTGGTGGCCTGGTGGTTAAGGATCCCATATTGTCGCTGCTGTGGCTAGAGTTCCATCCCTGGCCCGGAAACTTCTGTATACCTCAGGCAAGCCAACAAAAAGAAAAAAAGAAGGGAAGAAAAGAAAAAAATAGTAACAGAAAATTGAATTAAAATGTCAAACCCCTGGAAAAATTAACAACTATCTCAGATTTGAGGAAGAAAAAAAAAATCAACAGTTTTACCTGCAGTAAACACTGAGGCGCTCTTACAATGAAAAAGAACTAACCGGAAAGGGAAAGAAAGCAGAGCTAGGATGTGATTTGTATATGATTTGTATCTGACACAAAATTTTCATAGTTATGAAAGGAAAATATGAAAATTATAATAAATGATGAATCAATTATAGAATAAAATGTAAATTAAAGCACTCTGGATTATCATTTTACAATTACTAACAAATACAACAACAGTAATAGTAACAGCAACCACTGTTGGAAGATTGCCTAGAAATTTTCACATTCAGTTATTTTGAGAGGTGGCAGGACTTTGGGGTTAGAAGAATGGCTCTGCACCTAATTTCATAGCATGGAATGGGTTACCTAATTTCCTCATCCTCCTTTTGTGCATTCATAAAATAGAGGAAATTATACCTACTTCAGGAAATTGCTAAGATTAACCATCTATGTAAAACTGACCTTTGGTATGTAATCCTTTTTCTATTCTTGGGCACACTGCACTGGGGACATTGTGAATTTACTGTAAAGCAATTTGGTAATGCATTAGGCCATGACCCAGAATTTACCTGCAATGGAAGAAACAACAAGAAAAAAAAGGGGGGGAAAAAAAAGCCATATGCAGTCACAGAATTCAGAATGATCTAAAATTAGACCCAACGGAAAAACAACCTAAATGTATAACAGCAGGGCAGCAGCTGAGGAAATCATGGCTCTTTAACTGAAAGAAACATTATGTAACTATCAAAAGTCGGTGGTACATGAGAAAAAACTGATAAATCAGTGTAGATTACATTACCAAACTGTATCTACTTACTCAGTGAATGCATATGTGGAAAATCTGAAAGGAAAAGCATACAAAGGAATTGAATAGAATTAAAATGAAGTTAGAAATTATGGGTCAGTTTAATTTTCTTTTTTATTTATATACTGCTTTTCTAAGTAACGAAATTTTTAAGATAATTATTCATCGTTCTCAATTTTTGTAATGAAATGGAGCCATAGTTTTCTGTATGTGGGAGAGGGAGAGCTCAGTGTCATGTTAGCTGACTTCATTTCTTCAGATATTGTCTCTTTTTTTTTCTCGTGTAGATGGATTAGGGGGTTAGTAATGTATATATTAGGATCCTTCTTTAAGGAATAGNNTCTAAAAATTATTATCAATTCTAGNTTTTTCTTTTTTTGGTGTTTCTAAGGACCCTGAATATATTTGAAAACTGAACAGTTTCAGCTAAGCCGAAGCATTCTGTCTTCCCCAGAACACAAATCCAGCCTCGCTGAGCCATTACAGATGTACATACTGCAGAGTCCCTTTGATCTCGTGATGGCTCAGAGTCCCTATCTGTCACAGAAAAGAAGGGCCTAGAAAGGCTATGATGAC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GCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAASEQIDNO:5、6、7、8用來(lái)獲得上臂和下臂的引物PRNP上臂MluIfor:CTAGACGCGTCTTGGCACAGGGGCCCTAGPRNP上臂BsiW1rev:GACTACGTACGCCTACCACTGCCCCAGCTGPRNP下臂XhoIfor:GACTCTCGAGCGGTTACATGCTGGGGAGTPRNP下臂AscIrev:GTCAGGCGCGCCTTGATGCAATAGCTGCTGT通過(guò)用AscI(通過(guò)引物引入)和內(nèi)源序列上的HpaI酶消化產(chǎn)生靶向載體。SEQIDNO:9和10載體之內(nèi)和之外的引物以證實(shí)GFPGFP表達(dá)載體之內(nèi)：CCAGCTGGGGCTCGACTAGA同源臂之外：CCATTTTGAGCAGCCTCATTTGSEQIDNO:11LoxP核苷酸序列ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTASEQIDNO:12用來(lái)靶向ZBED的單鏈oligoGGTGGCAGAAGGAGTGGATAAAGAGGCAAAATTGCCTGCCAAAAAGAAAAGAAAGAAGGGTTTGC(隨后斜體為EcoR1位點(diǎn))GAATTC(隨后小寫(xiě)字母為L(zhǎng)oxP位點(diǎn))taccgttcgtatagcatacattatacgaagttatAGGGGAAAAGGCGACGAAAGAAACTGATCCTTGCAAAAAAGTTTAGTAAGGATTTGGGATCTGGGAGGCCTGTTGCAAGSEQIDNO:13是圖6中示出的EcoRI和LoxP插入胚泡1和5的ZBED6序列AGAAGGGTTTGCGAATTCTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGGGGAAAAGGCGACSEQIDNO:14和15ssoligo的側(cè)翼序列上:GGTGGCAGAAGGAGTGGATAAAGAGGCAAAATTGCCTGCCAAAAAGAAAAGAAAGAAGGGTTTGCGAATTC下:AGGGGAAAAGGCGACGAAAGAAACTGATCCTTGCAAAAAAGTTTAGTAAGGATTTGGGATCTGGGAGGCCTGTTGCAAGSEQIDNO:16來(lái)自圖6的胚泡3和4的ZBED插入AGAAGGGTTTGCGAATCCTACCGTTCGTATGCATACATTATACGAAGTTAAGGGGAAAAGGCGACSEQIDNO:17來(lái)自圖6的ZBED插入胚泡2AGAAGGGTTTGCGAATTCTACCGTTCGTATGCATACATTATACGAAGTTAAGGGGAAAAGGCGGCSEQUENCELISTING<110>UniversityofMaryland,CollegePark<120>TARGETEDGENOMEEDITINGINZYGOTESOFDOMESTICLARGEANIMALS<130>P250-204<150>61/970,794<151>2014-03-26<160>17<170>PatentInversion3.5<210>1<211>10988<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>misc_feature<222>(718)..(817)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(2967)..(2968)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(2993)..(2993)<223>nisa,c,g,ort<400>1acgtacgcggccaaaagagtctcaactccctcccagagactcagatttccgaccagcttg60gcagatcccgggcgccggagcgccagagcgcgcgcgcgcgccgccgccgcctcccttccc120cgcccgcgcgcctcgccacccctcggcgccagacactgacagccccggagctgcgagcgt180cttctgttccagcggtggcaggtaaacagccgggtcgccccgagaactgggggtgccaag240gtcgggagtcagaaccccccgccttggagcttaggcgcaagggtgagcggcccacttggg300gcgctagggaaaccttgacagagaggggggcgggggacttccggcgggcggggggcgcga360caggcctgcccccgcttgttcgtcggcttaacattggccccgctcacatttgctttccag420gtggggtgagggccctttactcggaatggggcttggtgggggaagggggtgcctggggct480ggccgcgacccctgggcagggaggcggatggtggcggggagtctagccctctcccacgcg540cgtccgcggctggcggaggatgggagaggcgcgccggcaccggggccgcagggccgggaa600ctcaaggagggtcgcccacggcctccgctgaggcgctcggaggagaaccagggagagggg660ccggcgtgcggctctcccgaggccccaggggcacgtggggtggggatgatggccccgnnn720nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn780nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnagccccaaggggcccgttggggg840ggggtgatggcccaggccccggcgggaggggcccttgccgccgccaccatggagctcctc900cggagagacggcccacctgccatccacgcggcccgggggtgctggggaggccgcagcggg960gtgggcctcctgcatccctggggatggagaccgggcacgtggtccgaccttcgggcctcg1020gcgggcggagtctcgggcggccccaccctcactgtcggccgagacgtccaggtccctggg1080ggccgagtgtccggagagcccaggtgctttgcttttcactgtctccactgcccctccccg1140aagggaactgggcggtcagaggctcctctcaaggggatcagggccggacagctctcctcc1200tgatccacttgtgtgggctgccctttcaggcttgattgtaaacaacgaggagaagtccat1260ttttactgtcccttttcatttttttcccttttctaaatttgtagcaaccatggcaaatca1320gtttttaaaatcataacccacagccatcaatccacccttaccatctcaaagccactgctt1380tctgtttttcagttttctgtctccagattcgtacataacgcaaagaaatttcaactgccc1440tgattatgattatcctcctctaatggccgagttattttcttctgcttaaagcgtcgcagt1500ttaataagcagttccccgaatgctgaacatttgaaatgtttcgttttttcttgcaaaaaa1560accttccaggtataacagtattaaagaaagaataggaataggagttccctggtggcctgg1620tggttaaggatcccatattgtcgctgctgtggctagagttccatccctggcccggaaact1680tctgtatacctcaggcaagccaacaaaaagaaaaaaagaagggaagaaaagaaaaaaata1740gtaacagaaaattgaattaaaatgtcaaacccctggaaaaattaacaactatctcagatt1800tgaggaagaaaaaaaaaatcaacagttttacctgcagtaaacactgaggcgctcttacaa1860tgaaaaagaactaaccggaaagggaaagaaagcagagctaggatgtgatttgtatatgat1920ttgtatctgacacaaaattttcatagttatgaaaggaaaatatgaaaattataataaatg1980atgaatcaattatagaataaaatgtaaattaaagcactctggattatcattttacaatta2040ctaacaaatacaacaacagtaatagtaacagcaaccactgttggaagattgcctagaaat2100tttcacattcagttattttgagaggtggcaggactttggggttagaagaatggctctgca2160cctaatttcatagcatggaatgggttacctaatttcctcatcctccttttgtgcattcat2220aaaatagaggaaattatacctacttcaggaaattgctaagattaaccatctatgtaaaac2280tgacctttggtatgtaatcctttttctattcttgggcacactgcactggggacattgtga2340atttactgtaaagcaatttggtaatgcattaggccatgacccagaatttacctgcaatgg2400aagaaacaacaagaaaaaaaagggggggaaaaaaaagccatatgcagtcacagaattcag2460aatgatctaaaattagacccaacggaaaaacaacctaaatgtataacagcagggcagcag2520ctgaggaaatcatggctctttaactgaaagaaacattatgtaactatcaaaagtcggtgg2580tacatgagaaaaaactgataaatcagtgtagattacattaccaaactgtatctacttact2640cagtgaatgcatatgtggaaaatctgaaaggaaaagcatacaaaggaattgaatagaatt2700aaaatgaagttagaaattatgggtcagtttaattttcttttttatttatatactgctttt2760ctaagtaacgaaatttttaagataattattcatcgttctcaatttttgtaatgaaatgga2820gccatagttttctgtatgtgggagagggagagctcagtgtcatgttagctgacttcattt2880cttcagatattgtctctttttttttctcgtgtagatggattagggggttagtaatgtata2940tattaggatccttctttaaggaatagnntctaaaaattattatcaattctagntttttct3000ttttttggtgtttctaaggaccctgaatatatttgaaaactgaacagtttcagctaagcc3060gaagcattctgtcttccccagaacacaaatccagcctcgctgagccattacagatgtaca3120tactgcagagtccctttgatct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