本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)物細(xì)胞融合基礎(chǔ)培養(yǎng)基的使用方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始于20世紀(jì)初，是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)療技術(shù)、藥品等領(lǐng)域，形成了龐大的產(chǎn)業(yè)。同時(shí)，為了滿足市場(chǎng)的不同需求，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得的產(chǎn)品種類也更加多元化。

細(xì)胞融合是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一種應(yīng)用，其在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，將兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個(gè)雜種細(xì)胞。目前，細(xì)胞融合技術(shù)多用于獲取雜交瘤，并用于單克隆抗體的科研和生產(chǎn)。

培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。其中，合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法合成的。目前，關(guān)于細(xì)胞融合培養(yǎng)基進(jìn)行了很多改造和研究，但通常都忽略了細(xì)胞培養(yǎng)基組分的改造所帶來的影響，使得細(xì)胞融合效率通常偏低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種動(dòng)物細(xì)胞融合基礎(chǔ)培養(yǎng)基的使用方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞融合培養(yǎng)基的細(xì)胞融合效率低的問題，從而通過提高細(xì)胞融合效率，達(dá)到高效獲取雜交瘤的目的，使得獲取單克隆抗體的機(jī)率顯著增加。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種動(dòng)物細(xì)胞融合基礎(chǔ)培養(yǎng)基的使用方法，包括以下步驟：

(a)準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤細(xì)胞、免疫小白鼠脾細(xì)胞、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、滅菌后4℃保存的聚乙二醇4000、飼養(yǎng)細(xì)胞四板，每個(gè)板上有96個(gè)孔，每孔的體積為100μl；

(b)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹洗小鼠骨髓瘤細(xì)胞后，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞加入至50ml離心管中，并同時(shí)加入復(fù)蘇的免疫小白鼠脾細(xì)胞，混勻后離心；

(c)離心完成后除去離心管中的上清液，將細(xì)胞沉淀輕輕混勻后，沿著管壁在60秒內(nèi)加入緩慢加入800μl的peg4000，加完后靜置90秒；

(d)加入50ml培養(yǎng)基后離心；

(e)離心完成后除去上清液，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻后，用加樣槍將其轉(zhuǎn)入板中；

(f)放入5％co2的孵箱培養(yǎng)七天后，全換液；上述步驟中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸二鈉、纈氨酸、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、生物素、氯化膽堿、肌醇、尼克酰胺、d-泛酸、吡哆醛、硫胺素、核黃素、抗壞血酸、維生素b-12、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、d-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉、胸苷、還原型谷胱甘肽、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸?，F(xiàn)有技術(shù)中，如hyclone1640培養(yǎng)基，忽略了細(xì)胞培養(yǎng)基組分的改造所帶來的影響，導(dǎo)致其細(xì)胞融合效率較低，為了解決上述問題，本發(fā)明通過系統(tǒng)組織工程技術(shù)(ztso)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，從系統(tǒng)的角度而非理化層面去分析各組分和細(xì)胞生長(zhǎng)之間的協(xié)同性，相較于傳統(tǒng)的doe設(shè)計(jì)和分析，僅通過少量的實(shí)驗(yàn)即可確定和細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的所有配方組成，并能準(zhǔn)確確定每個(gè)組分準(zhǔn)確的量。經(jīng)過ztso實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，開發(fā)出了上述用于動(dòng)物細(xì)胞融合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

為了對(duì)比本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基與現(xiàn)有的hyclone1640培養(yǎng)基的融合效果，進(jìn)行免疫小白鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)的不同階段，即融合前、進(jìn)樣補(bǔ)充、融合中使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和hyclone1640培養(yǎng)基，通過最后孔板上每12個(gè)孔中細(xì)胞融合的孔的個(gè)數(shù)，判斷細(xì)胞融合。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于hyclone1640培養(yǎng)基，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠大幅提升細(xì)胞融合效率，若在實(shí)驗(yàn)的三個(gè)階段全部采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，細(xì)胞融合效率的提升最高，獲得陽性雜交瘤的可能性大大增加，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

進(jìn)一步地，所述各組分的含量為：丙氨酸10-50mg/l，精氨酸100-300mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，天冬酰氨10-50mg/l，胱氨酸10-50mg/l，谷氨酰胺100-500mg/l，谷氨酸10-50mg/l，甘氨酸10-50mg/l，組氨酸10-50mg/l，羥脯氨酸10-50mg/l，異亮氨酸10-50mg/l，亮氨酸10-50mg/l，賴氨酸10-50mg/l，蛋氨酸10-50mg/l，苯丙氨酸10-50mg/l，脯氨酸10-50mg/l，絲氨酸10-50mg/l，蘇氨酸10-50mg/l，色氨酸1-10mg/l，酪氨酸二鈉10-50mg/l，纈氨酸10-50mg/l，氯化鈣10-50mg/l，硫酸鎂10-50mg/l，氯化鉀200-400mg/l，磷酸二氫鉀10-50mg/l，磷酸氫二鈉500-1000mg/l，生物素0.1-5mg/l，氯化膽堿0.1-5mg/l，肌醇10-50mg/l，尼克酰胺0.1-5mg/l，d-泛酸0.1-5mg/l，吡哆醛0.1-5mg/l，硫胺素0.1-5mg/l，核黃素0.1-5mg/l，抗壞血酸10-50mg/l，維生素b120.001-0.01mg/l，對(duì)氨基苯甲酸0.1-5mg/l，葉酸0.1-5mg/l，d-葡萄糖1000-3000mg/l，酚紅1-5mg/l，丙酮酸鈉10-50mg/l，胸苷10-50mg/l，還原型谷胱甘肽0.1-5mg/l，碳酸氫鈉0.1-3g/l，氫氧化鈉0.1-3g/l，氯化鈉5-8g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。

進(jìn)一步地，所述步驟(a)中的飼養(yǎng)細(xì)胞來自于無菌收集的bablc小鼠腹腔，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合后，均勻加入板的孔中，每孔100μl。

進(jìn)一步地，小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫小白鼠脾細(xì)胞數(shù)量比為1：20。

進(jìn)一步地，所述步驟(b)中的離心時(shí)間為4～10分鐘。

進(jìn)一步地，所述碳酸氫鈉0.8-3g/l，氫氧化鈉1.2-3g/l，氯化鈉6.5-8g/l，氯化鈣30-50mg/l，硫酸鎂30-50mg/l，氯化鉀300-400mg/l，d-泛酸3-5mg/l，吡哆醛2.5-5mg/l，硫胺素1.8-5mg/l。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1、本發(fā)明能夠大幅提升細(xì)胞融合效率，若在細(xì)胞融合的各個(gè)階段均采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，細(xì)胞融合效率的提升最高，獲得陽性雜交瘤的可能性大大增加；

2、本發(fā)明組分搭配良好，相比于市面上銷售的培養(yǎng)基，成本更低、融合效率更高。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的限定。在附圖中：

圖1為細(xì)胞融合全過程采用不同本發(fā)明培養(yǎng)基和hyclonerpmi1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞融合獲得陽性雜交瘤檢測(cè)孔。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1：

配制的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各組分含量為：丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨50mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸40mg/l，甘氨酸50mg/l，組氨酸50mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸50mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸50mg/l，脯氨酸50mg/l，絲氨酸50mg/l，蘇氨酸50mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸10-50mg/l，氯化鈣30mg/l，硫酸鎂30mg/l，氯化鉀300mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉1000mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.5mg/l，d-泛酸3mg/l，吡哆醛2.5mg/l，硫胺素1.8mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸25mg/l，維生素b120.01mg/l，對(duì)氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷50mg/l，還原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉0.8g/l，氫氧化鈉1.2g/l，氯化鈉6.5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。

免疫小白鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)：

(a)準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤細(xì)胞、免疫小白鼠脾細(xì)胞、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、滅菌后4℃保存的聚乙二醇4000、飼養(yǎng)細(xì)胞四板，每個(gè)板上有96個(gè)孔，每孔的體積為100μl；

(b)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹洗小鼠骨髓瘤細(xì)胞后，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞加入至50ml離心管中，并同時(shí)加入復(fù)蘇的免疫小白鼠脾細(xì)胞，混勻后離心；

(c)離心完成后除去離心管中的上清液，將細(xì)胞沉淀輕輕混勻后，沿著管壁在60秒內(nèi)加入緩慢加入800μl的peg4000，加完后靜置90秒；

(d)加入50ml培養(yǎng)基后離心；

(e)離心完成后除去上清液，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻后，用加樣槍將其轉(zhuǎn)入板中；

(f)放入5％co2的孵箱培養(yǎng)七天后，全換液。

通過在不同階段添加按上述配方制成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，得到的細(xì)胞融合率如表1所示：

表1

如表1所示，在各個(gè)階段添加本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均能提高細(xì)胞融合率，其中，在三個(gè)階段均使用本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基能達(dá)到83.3％的融合率。相比于現(xiàn)有技術(shù)，大幅地提高了細(xì)胞融合效率，達(dá)到高效獲取雜交瘤的目的，使得獲取單克隆抗體的機(jī)率顯著增加，具有廣泛地應(yīng)用價(jià)值。

如圖1所示，圖中第一、二行為hyclonerpmi1640獲得的雜交瘤檢測(cè)孔；第三、四行為本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的雜交瘤檢測(cè)孔情況。由于無法提供彩色圖片，僅能從顏色黑白作出判斷，圖1中黑色的孔為陽性雜交瘤檢測(cè)孔，因此，可以看出，采用本發(fā)明基礎(chǔ)培養(yǎng)基所獲得的細(xì)胞融合率較現(xiàn)有的hyclonerpmi1640培養(yǎng)基大幅提高。

實(shí)施例2

實(shí)施例2的操作步驟與實(shí)施例1相同，其不同點(diǎn)在于，所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各組分含量為：丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺500mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸50mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸50mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸10mg/l，蘇氨酸10mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二鈉50mg/l，纈氨酸50mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀400mg/l，磷酸二氫鉀50mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸10mg/l，維生素b120.01mg/l，對(duì)氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖3000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷10mg/l，還原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉3g/l，氫氧化鈉3g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

實(shí)施例3

實(shí)施例3的操作步驟與實(shí)施例1相同，其不同點(diǎn)在于，所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各組分含量為：丙氨酸10mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸10mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸10mg/l，蘇氨酸10mg/l，色氨酸1mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸10mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀200mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸10mg/l，維生素b120.001mg/l，對(duì)氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅1mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷10mg/l，還原型谷胱甘肽0.1mg/l，碳酸氫鈉0.1g/l，氫氧化鈉0.1g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

以上所述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。