專利名稱：基于t細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)核病的疫苗及其 制備方法和應(yīng)用，特別是基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其制備方 法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病的死灰復(fù)燃是全球重大的健康問(wèn)題，由于常規(guī)BCG疫苗的 無(wú)效性、結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)、以及AIDS病導(dǎo)致的結(jié)核感染，結(jié)核 發(fā)病及死亡目前非常嚴(yán)重，全球每年有800萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核患者并導(dǎo)致 300萬(wàn)死亡；我國(guó)約有5.5億人口曾經(jīng)感染結(jié)核，每年13萬(wàn)人死于結(jié)核， 每月約有12萬(wàn)新發(fā)病人。2006年結(jié)核已一躍成為我國(guó)感染性疾病發(fā)病 的首位，研制新型結(jié)核預(yù)防疫苗非常迫切。
結(jié)核研究表明，誘導(dǎo)Thl型的細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)于清除巨噬細(xì)胞感 染結(jié)核桿菌至關(guān)重要，誘導(dǎo)CD4+Thl、 CD8 + CTL的產(chǎn)生及其分泌 的高水平的IFNY可有效保護(hù)動(dòng)物抵抗結(jié)核桿菌攻擊?；蛞呙缂?DNA疫苗，是將外源目的基因構(gòu)建于真核表達(dá)質(zhì)粒、直接注射動(dòng)物 的第三代疫苗，由于可在體內(nèi)表達(dá)目的抗原，通過(guò)外源性、內(nèi)源性以 及交叉抗原提呈途徑被DC細(xì)胞提呈，有效激活CD4+Thl和CD8+T 細(xì)胞，因此特別有利于誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及 其制備方法和應(yīng)用，所述的這種基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗要解決由于常規(guī)BCG疫苗的無(wú)效性、以及結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)和AIDS 病導(dǎo)致的結(jié)核感染使得現(xiàn)有技術(shù)中的疫苗預(yù)防和治療結(jié)核病的效果 不佳的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明提供了一種基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，由一個(gè)載體
構(gòu)成，在所述的載體中插入有結(jié)核桿菌熱休克蛋白的全長(zhǎng)基因，所述 的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長(zhǎng)基因中嵌合有來(lái)自結(jié)核桿菌抗 原的4個(gè)T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個(gè)T細(xì)胞表位分別是結(jié)核 桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因，結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因，結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因，結(jié)核桿菌 Ag85B蛋白的420 459位基因。
進(jìn)一步的，所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選 自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列 SEQID如NO: 1所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序 列如SEQIDNO: 2所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的氨 基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的 DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨 基酸序列如SEQ IDN0:5所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的 DNA序列如SEQ ID N0:6所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨 基酸序列如SEQ ID N0:7所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨 基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的 DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
進(jìn)一步的，在結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65全長(zhǎng)基因中的第438 位堿基后插入結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位堿 基后插入結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位堿基 后插入結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和結(jié)核桿菌Ag85B 蛋白的420 459位基因。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和所 述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因之間以gccgcctac基因 序列相連接。
進(jìn)一步的，嵌合了結(jié)核桿菌4個(gè)T細(xì)胞表位基因的結(jié)核桿菌熱休 克蛋白HSP65的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 11所示。
進(jìn)一步的，嵌合了結(jié)核桿菌4個(gè)T細(xì)胞表位基因的結(jié)核桿菌熱休 克蛋白HSP65的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO: 12所示。
本發(fā)明還提供了上述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備 方法，包括以下步驟
1) 提取結(jié)核分枝桿菌DNA作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增結(jié)核 桿菌熱休克蛋白HSP65編碼基因；
2) 以結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65基因作為模板，分別通過(guò)PCR 擴(kuò)增帶彼此有17個(gè)堿基重疊的雙鏈DNA片段1、片段2、 片段3，所述片段1的雙鏈DNA的序列為
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac taccggttct gtt33cgc3t gctgcttctc cgggcsgcgc cgg3gctcgc cccgsscttg
gccctcgccg stgcggtssei ggtgaicsttg ggccccsagg gccgcsscgt cgtcctggas cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt<formula>formula see original document page 10</formula>
所述的片段2的雙鏈DNA的序列為
<formula>formula see original document page 10</formula>
所述的片段3的雙鏈DNA的序列為
<formula>formula see original document page 10</formula>csccggggcg scttcgtcts gcgg33gttg 3ggcccg3cc tcggcccgcs ccsccggcgc
aaggtgcgc3 3cctgccggc tggccscggs ctgsscgctc sgsccggtgt ctscgsggst ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctccta
ctgctcgctg ccggcgttgc tgscccggtc ssggtgsccc gttcggcgct gcsgsatgcg gacgsgcgsc ggccgcsscg sctgggccag ttccsctggg C33gccgcgs cgtcttscgc
gcgtccatcg cggggctgtt cctgsccscc gsggccgtcg ttgccg3C33 gccggasaag cgcaggtsgc gccccg3C33 ggsctggtgg ctccggcsgc ascggctgtt cggccttttc
gagasggctt ccgttcccgg tggcggcgsc 3tgggtggcs tggstttc ctcttccgss ccg33gggcc sccgccgctg tscccsccgt accta33g;
3)將上述的3個(gè)片段混合，變性成為單鏈，通過(guò)彼此重疊的 17個(gè)堿基互補(bǔ)連接，作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得嵌 合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源目 的基因，將目的基因經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體連 接，獲得權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗。 具體的，是將上述的片段1和片段2混合，熱變性使各自成為 單鏈DNA，由于片段l、 2有17個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互 補(bǔ)成為雙鏈，再通過(guò)PCR法可擴(kuò)增獲得片段(1+2)的片段，再與 片段3混合，熱變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有17個(gè)堿基 的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，經(jīng)PCR可擴(kuò)增獲得片段(l +2+3)，即嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外 源目的基因。
進(jìn)一步的，以SEQIDNO: 13所示的HSP65上游引物和SEQID NO: 15所示的引物HSP65T1序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段1。
進(jìn)一步的，以SEQIDNO: 16所示的引物HSP65T2序列和SEQ ID NO: 17所示的引物HSP65 El序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段2。
進(jìn)一步的，以SEQ ID NO: 18所示的引物HSP65E2序列和SEQ ID NO: 14所示的HSP65下游引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段3。
進(jìn)一步的，用SEQ ID NO: 13所示的HSP65上游引物和SEQID NO: 14所示的下游引物以片段1、 2、 3混合、變性、彼此互補(bǔ)連接 后的基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65編碼基因和嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源 目的基因；
進(jìn)一步的，嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65外源目的基因和插 入載體的酶切位點(diǎn)分別為EcoRI和Hind III位點(diǎn)。
進(jìn)一步的，所有抗原來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv株。 進(jìn)一步的，所述的載體選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有有效量的上述的基于T 細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗。進(jìn)一步的，還含有藥學(xué)上可接受的載體或 者賦形劑。
本發(fā)明還提供了上述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗在制備 治療和預(yù)防結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)DNA預(yù)測(cè)軟件，從結(jié)核分枝桿菌的已知的4種關(guān)鍵抗 原Ag85A、 Ag85B、 ESAT-6和CFP-10中各自篩選了一個(gè)T細(xì)胞表位， 共4個(gè)T細(xì)胞表位，擬構(gòu)建含有4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗。由于 表位的氨基酸序列僅有8—20個(gè)，結(jié)構(gòu)太小和簡(jiǎn)單，免疫原性很弱， 通常不能誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。因此擬挑選一種載體基因，將4個(gè)T 細(xì)胞表位插入載體基因中，共同構(gòu)成結(jié)核外源目的基因。
本發(fā)明選擇結(jié)核桿菌來(lái)源的熱休克蛋白65 (HSP65)作為嵌入T 細(xì)胞表位的基因載體。HSP65是熱休克蛋白60家族成員，在細(xì)菌到人 體細(xì)胞有很高的同源性。全長(zhǎng)1623bp，編碼540個(gè)氨基酸，分子量 65kD。選擇結(jié)核桿菌來(lái)源HSP65作為嵌入T細(xì)胞表位的基因載體的原 因有兩點(diǎn)1、 HSP內(nèi)含有多個(gè)結(jié)核T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，本身就是重 要的免疫保護(hù)性抗原，已證實(shí)HSP65作為目的抗原免疫小鼠可產(chǎn)生抗 結(jié)核強(qiáng)保護(hù)性免疫應(yīng)答，且與產(chǎn)生IFN-Y的CD8VCD44hi細(xì)胞有關(guān)。2、 HSP作為細(xì)胞內(nèi)伴侶蛋白，參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位、折疊和裝配，可幫助嵌 入的表位更好地折疊形成空間結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明選擇的4個(gè)T細(xì)胞表位來(lái)自以下4種結(jié)核抗原1) Ag85A， 295氨基酸。結(jié)核菌的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個(gè)主要成 分是Ag85復(fù)合體(antigen 85 complex),由Ag85A、 Ag85B、 Ag85C組 成的相對(duì)分子質(zhì)量為38000蛋白家族。Ag85A可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免 疫，也可激發(fā)Thl型細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖和IL-2及IFN-Y等上升。
2) Ag85B，蛋白質(zhì)全長(zhǎng)285氨基酸，分子量34.6KD。又稱MPT59、 Rvl886，是一種分枝桿菌轉(zhuǎn)移酶，與細(xì)菌細(xì)胞壁合成有關(guān)，具有多 個(gè)T細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)Thl反應(yīng)、IFN-y的產(chǎn)生。
3) ESAT-6，又稱Rv3875，全長(zhǎng)288bp， 95個(gè)氨基酸，分子量9.9KD， 僅在強(qiáng)毒株中有這種抗原。含有多個(gè)T細(xì)胞表位，能激活CD4+、 CD8+ T細(xì)胞，在抗結(jié)核保護(hù)性免疫應(yīng)答中起重要作用。ESAT-6還可刺激Mtb 病人的外周血T細(xì)胞增殖，促進(jìn)IFN-Y釋放。用ESAT-6和佐劑制成的亞 單位疫苗免疫小鼠具有較好的保護(hù)性。
4) CFP-IO，低分子量結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白，全長(zhǎng)303bp， IOO個(gè)氨 基酸，分子量10000，與結(jié)核分枝桿菌毒力有關(guān)，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈 的T細(xì)胞免疫應(yīng)答并釋放高水平的IFN-Y。
BCG傳代過(guò)程中ESAT-6和CFP-10基因丟失，而在絕大多數(shù)毒株 中這兩個(gè)基因都存在。
本發(fā)明通過(guò)BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、DNAstar生物軟件分析以 及親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)的分析，選擇各 類參數(shù)均較好的結(jié)構(gòu)區(qū)域作為候選疫苗表位區(qū)段；然后通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù) 庫(kù)(http:〃www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析予頁(yè) 測(cè)這些區(qū)段中存在的T細(xì)胞抗原表位、同時(shí)與HLAI、 II類分子可高 親和力結(jié)合的表位。經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分子預(yù)測(cè)最后獲得的4個(gè)T細(xì)胞表位 分別是結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因(EAST-6189.228); 結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369-405);結(jié)核桿菌 CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_207);結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B420_459)。分別插入到HSP65基因的第 438位堿基、第486位堿基、第1185位堿基后，構(gòu)建ECANS結(jié)核基
因疫苗。
本發(fā)明在pcDNA3.1或pVAXl質(zhì)粒中，插入一段結(jié)核外源目的 基因，作為新型結(jié)核基因疫苗，該結(jié)核外源目的基因由4個(gè)結(jié)核T 細(xì)胞表位嵌合到結(jié)核HSP65蛋白的3個(gè)非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)位置所共同構(gòu)成， 經(jīng)分析，4個(gè)表位的嵌入不會(huì)影響HSP65本身的正常三級(jí)、四級(jí)空間 結(jié)構(gòu)，因此將這一嵌合有4個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65基因的結(jié)核基因 疫苗稱為ECANS (Epitope Cast in A Natural Structure, ECANS)"在蛋 白天然結(jié)構(gòu)中嵌合表位的"結(jié)核基因疫苗。
本發(fā)明中，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒的載體，包括任何可以轉(zhuǎn)染哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的高效真核表達(dá)質(zhì)粒載體，包括但不限于pcDNA3.1、pVAX 以及常見(jiàn)和市售的真核質(zhì)粒載體。
本發(fā)明中，HSP65蛋白編碼基因和4個(gè)T細(xì)胞表位的獲得，可 以通過(guò)多種方式獲得，包括但不限于1)化學(xué)合成DNA; 2)通過(guò) 適當(dāng)引物以PCR技術(shù)擴(kuò)增得到DNA 。
本發(fā)明中，將ECANS基因疫苗注射小鼠的方法采用肌肉注射方 式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行以注射器吸取<10(^1 質(zhì)粒液體直接注射小鼠脛骨前肌肉，可僅注射小鼠一條腿，也可分別 取50pl質(zhì)粒注射于小鼠兩條腿。除注射器外，也可選用其他有效的 借助于市售儀器的基因免疫的方式，包括但不限于基因槍技術(shù)、電 穿孔輔助技術(shù)等。
本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和動(dòng)物而無(wú)過(guò)度 不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。
本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的載體"成分是用于將具有活性的有 效成分傳送給人或動(dòng)物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所 述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于水、PBS緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。
本發(fā)明的藥物組合物，還含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載 體。通常將其配制于無(wú)毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介
質(zhì)中，pH值通常約6-8。
本發(fā)明和與已有技術(shù)相對(duì)照，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明 的基于T細(xì)胞表位的HSP65基因的結(jié)核基因疫苗是一種質(zhì)粒DNA疫 苗，其中外源目的基因是嵌合有4個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65基因，它 們各自均可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，而嵌合表位不會(huì)影響HSP65蛋白的空 間結(jié)構(gòu)。因此理論上這一基因疫苗同時(shí)具有至少5種可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng) 答的結(jié)核抗原，具有強(qiáng)有效的激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。通過(guò)將本 發(fā)明的基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，證實(shí)可誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)結(jié)核抗原的 特異性抗體應(yīng)答，還能誘導(dǎo)較強(qiáng)的結(jié)核特異性殺傷應(yīng)答，同時(shí)可誘導(dǎo) Thl型免疫應(yīng)答，分泌高水平IFN》因此可以作為預(yù)防和治療性結(jié)核 病的優(yōu)良疫苗。


圖1顯示了本發(fā)明的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的外源目的 基因和pcDNA3.1載體質(zhì)粒的構(gòu)建模式圖。
圖2顯示了通過(guò)HSP65上游引物/T1、 T2/E1、 E2/HSP65下游引 物三對(duì)引物分別擴(kuò)增得到的雙鏈DNA片段1 (l-508bp)、片段 2(491-1315bp)、片段3(1298-1788bp)，而后通過(guò)彼此重疊的17個(gè)堿 基互補(bǔ)相連得到的嵌合4個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65全長(zhǎng)基因，其中， 粗體帶下劃線的序列是插入的4個(gè)T細(xì)胞表位序列。
圖3顯示了本發(fā)明的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的質(zhì)粒PCR (圖3A)、酶切(圖3B)及部分測(cè)序鑒定結(jié)果(圖3C)。
圖4顯示了本發(fā)明的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘 導(dǎo)的特異性抗體IgG，圖4A顯示HSP65抗原特異性IgG的水平；圖4B顯示Ag85A抗原特異性IgG效價(jià)；圖4C顯示EAST6特異性IgG效價(jià)。
圖5顯示了本發(fā)明的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘 導(dǎo)的抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖能力。
圖6顯示了本發(fā)明的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘 導(dǎo)的特異性淋巴細(xì)胞殺傷活性。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明 的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物及試劑如下.-質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)H37Rv株(上海 市疾病預(yù)防控制中心結(jié)防科提供)。質(zhì)粒pcDNA3.1(-)、 pET32a、宿 主細(xì)菌DH5a 、 BL21(Invitrogen公司購(gòu)買)?；蚝铣晌猩虾Ｙ惏?盛公司。4-6周齡雌性BALB/c(H-2K,小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物中心。
分子生物學(xué)試劑..限制性核酸內(nèi)切酶&o及/、歷"d///(TaKaRa 公司)、T4 DNA連接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)； RNaseA(Ameresco公司)；dNTP(Promega和華美生物公司)；LB培養(yǎng) 基(英國(guó)OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、SDS、 EB(上?；瘜W(xué)試劑采 購(gòu)供應(yīng)站)，Tris(USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜生物制 品公司)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司)。
免疫學(xué)試劑和材料HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG多克隆抗體(Sant Clous公司)；2ml和lml無(wú)菌注射器(米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司)。實(shí)施例1: pcDNA3-ECANS基因疫苗的目的抗原基因的預(yù)測(cè)
通過(guò)BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)、DNAstar生物軟件、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù) (http:〃www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析，綜 合親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性、與HLAI、 II類分子 結(jié)合、等參數(shù)，預(yù)測(cè)獲得的4個(gè)T細(xì)胞表位結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白 的189 228位基因(EAST-6189_228);結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369-405);結(jié)核桿菌CFP-IO蛋白的162 207位基 因(CFP10162_207);結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因 (Ag85B420-459)。
如圖1所示，擬以pcDNA3.1或pVAX為質(zhì)粒載體，以結(jié)核分枝 桿菌HSP65基因作為嵌合表位的基因載體，在計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié) 構(gòu)的基礎(chǔ)上，在其中不影響關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的位置第438位堿基后插入 ESAT-6189 228表位基因、第486位堿基后插入Ag85A369 405、 第1185位堿基后插入CFP-10162 207和Ag85B420 459， CFP-10 和Ag85B之間以gccgcctac相連接。
實(shí)施例2 pcDNA3-ECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建
為了不在HSP65基因和T細(xì)胞表位基因之間引入酶切位點(diǎn)，本 發(fā)明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，從5 '和3'端依次擴(kuò) 增三段彼此有17個(gè)堿基重疊的包含部分HSP65基因和T細(xì)胞表位的 基因片段，變性后通過(guò)彼此重疊的互補(bǔ)序列連接，最后用5 '和3' 兩端HSP65上、下引物PCR擴(kuò)增出嵌合有4個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65 全長(zhǎng)基因。同時(shí)在基因兩端分別帶上&07 /和歷^////酶切位點(diǎn)，經(jīng) 雙酶切后可連接入載體pcDNA3.1(-)或原核表達(dá)載體pET32a。
首先提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株(上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié) 防科)DNA，作為模板，用HSP65上游引物(SEQIDNO: 13)和下游引物(SEQIDNO: 14)通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得HSP65片段，
回收并純化PCR產(chǎn)物(華舜公司小量膠回收試劑盒)。
以HSP65基因作為模板，分別以引物HSP65上游引物(SEQID
NO: 13)和T1引物(SEQIDNO: 15)通過(guò)PCR擴(kuò)增片段1 (如圖
2所示HSP65上游引物和Tl相對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的1 一508bp雙
鏈DNA片段)，所述的片段1的雙鏈DNA的序列為-
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac taccggttct gtt33cgc3t gctgcttctc cgggcsgcgc cggsgctcgc cccgsscttg
gccctcgccg stgcggt333 ggtgscattg ggcccc33gg gccgcsscgt cgtcctggss cgggsgcggc tscgccsttt ccsctgtssc ccggggttcc cggcgttgcs gc3gg3cctt
aL3gssgtggg gtgcccccsc gstcsccwc gatggtgtgt ccatcgccss ggsgstcgsg ttcttcsccc caicgggggtg ctagtggttg ctaccac3cai ggt3gcggtt cctctagctc
ctggsggstc cgtscg3gs3 gstcggcgcc g3gctggtc3 wgaiggtaigc c3aLg33gacc gacctcct3g gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctcc3tcg gttcttctgg
gatgscgtcg ccggtgscgg caccacgacg gccsccgtgc tggcccaggc gttggttcgc ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg
gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa ctcccggscg cgttgcsgcg ccggccgcgg ttgggcgsgc csgsgtttgc gccgtagctt
aaggccgtgg 3g3aggtc3c cg3g3ccctg ctcsa^gggcg cc6L3gg3ggt cgsgsccsag ttccggc3cc tcttccagtg gctctgggsc g3gttcccgc ggttectecs gctctggttc
g3gcag3ttg cggccsccgs gctg3ac33c gcgctgcsgs 3cctggcgcg gaegstcges ctcgtctsac gccggtggct cgscttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgct3gcgt
gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcg cgct3ssgcc gcccaictggt csiggteigc
，以T2引物(SEQIDNO: 16)和El引物(SEQ ID NO: 17)通過(guò) PCR擴(kuò)增片段2 (如圖2所示T2引物和E1相對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到
的491 一 1315bp雙鏈DNA片段)，所述片段2的雙鏈DNA的序列為:
gcttcttcgg
gsggaLgtccs ctcctcsggt
ggctscatct ccg3tgtsg3
CCCt3C3tCC
gggstgtsgg
gsgai3ggtc3 ctcttccsgt
gcgctgtcca cgcgscsggt
gctcccggct cgsgggccgs
ggtcsggtg3 ccagtccsct
gggtgsccs gtccatcggt cccactggt csggtsgeca
cgctgscgct ggcgstggsc gcgsctgcg3 ccgctscctg
5tc3cctttgg gctgcsgctc tgtgg333cc cgscgtcgag
cggggtactt cgtgaccgac gcccc3tgss gcsctggctg
tgctggtcsg ctccssggtg 3cg3cc3gtc gsggttcc3c
tcggagccgg taagccgctg 3gcctcggcc 3ttcggcg己c
ccctggtcgt csscssgstc gggsccsgca gttgttctsg
tcggcgsccg ccgcssggcg agccgctggc ggcgttccgc
tc3gcg33g3 ggtcggcctg sgtcgcttct ccsgccgg己c
gacctgatcg ctggsctsgc
3sggtgggcs ggcc3cccgt
gsgctcsccg ctcgsgtggc
ccggaigcgtc ggcctcgcsg
tccactgtca 3ggtgsc3gt
ctgatcatcg
cgcggcaicct gcgccgtgga
stgctgc3gg tacgscgtcc
3cgctgg3g3 tgcgaicctct
ccgsgggtct ggctccc3g3
3cgsgggcgt tgctcccgcs
sgggtstgcg tccc3tscgc
sggsggcggt tcctccgccai
aggatctgct tcctagacga
ccgsggscgt ggctcctgcs
tceL3gtcggt agttc5Lgccs
at3tggccst t3tsccggt3
scgccgscct tgcggctggs
ttcgatggct 3aLgct3ccgs
cstc3ccgtc gtsgtggcag
gttcgsc3sg C33gctgttc
cctggaggac ggacctcctg
gccgctgctc cggcgscgsg
cgsgggcgag gctcccgctc
ggcggtcsag ccgccsgttc
tctcaccggt agagtggcca
gtcgctgcta C3gcgscgatggcssggccc gcssggtcgt ggtcsccssg gacg3g3cc3 cc3tegtegs gggcgccggt ccgttccggg cgyycc3gc3 ccsgtggttc ctgctctggt ggt3gc3gct cccgcggccs
gaLcaccgscg ccstcgccgg scgsgtggcc c3g3tccgcc 3gg3g3tcg3 gsacsgcgsc ctgtggctgc ggtageggee tgctcaccgg gtctaggegg tcctctagct cttgtcgctg
tccg3cta1cg 3ccgtg3gss getgesggag cggctggccs sgctggccgg tggtgtcgcg aggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgc
gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcsiagg 3gcgcsagca ccgcatcgag cactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggegtagetc
gtggtgcgct tcc33g33gc 3gcca3t3ag caga3gc3gg ssctcgccgc ctscc cscc3cgcgs sggttcttcg teggttstte gtcttcgtcc ttgsgcggcg gstgg
以E2引物(SEQIDNO: 18)和HSP65下游引物(SEQ ID NO: 14)
通過(guò)PCR擴(kuò)增片段3 (如圖2所示E2引物和HSP65下游引物相對(duì)，
經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的1298 — 1788bp雙鏈DNA片段)，所述的片段3
的雙鏈DNA的序列為
gg sactcgccgc ctaccsgcag cc ttgsgcggcg gstggtcgtc
ttc3tct3cg ccggctcgct gtcggccctg ctgg3tgcgg ttcgcsatgc cssggccgcc
aatgtagatgc ggccg3gcg3 cagccgggac gacctacgcc aagcgttacg gttceggegg
gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgeaagegge cccgaccctg
csgctcctcc cgtsgcsgcg gcc3cccccs C3ctgcg3cs scgttcgccg gggctgggeic
gaegsgctgs 3gctcg33gg cgscgsggcg 3ccggcgcc3 scstcgtgsat ggtggcgctg
ctgctcgsct tcg3gcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgt3gc3ctt ccsccgcgsc
gaggccccgc tga3gc3gat cgccttcssc teegggctgg ageegggegt ggtggccgag
caccggggcg scttcgtct3 gcgg33gttg aggcccgdcc tcggcccgc3 ccsccggcgc
3sggtgcgc3 scctgccggc tggecseggs ctg33cgctc sgsccggtgt ct3cgagg3t
ttccacgcgt tggscggccg sccggtgcct gscttgcgsg tctggccscs gstgetccta
ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc asggtgaccc gtteggeget gc3g33tgcg
gscgagcgsc ggccgcsacg 3ctgggcc3g ttcc3ctggg casgccgcgs cgtctt3cgc
gcgtcc3tcg cggggctgtt cctgaiccscc gsggccgtcg ttgccg3c33 geeggsasag
cgcaiggtsgc gccccgeicss ggaictggtgg ctccggcagc sscggctgtt cggccttttc
g3g33ggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggstttc ctcttccgsa cc§33gggcc 3ccgccgctg tsccc^LCcgt aicctssw,
將上述的片段1和片段2混合，變性使各自成為單鏈DNA，由
于片段l、 2有17個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，
再以HSP65上游引物和E1引物通過(guò)PCR法可擴(kuò)增獲得片段(l+2)
的片段，再與片段3混合，變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有
17個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，以HSP65上游
引物(SEQIDNO: 13)和HSP65下游引物(SEQIDNO: 14)作
為引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得獲得片段(1+2+3)，即嵌合了 4
個(gè)T細(xì)胞表位的HSP目的基因即ECANS編碼基因(如圖2所示)。PCR鑒定結(jié)果顯示產(chǎn)物為1807bp，如圖3A所示。再將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) /和///雙酶切，回收酶切片段，與經(jīng)相應(yīng)酶切的載體 pcDNA3.1(-)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，氨芐青霉素篩選 轉(zhuǎn)化菌落。經(jīng)酶切(圖3B)及測(cè)序鑒定(圖3C)，成功構(gòu)建了 pcDNA3-ECANS真核表達(dá)質(zhì)粒。4段表位基因就以沒(méi)有酶切位點(diǎn)的 方式插入HSP65基因了。
將重組質(zhì)粒ECANS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)LB (Ampl00pg/ml)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)15h，收集菌體，按照QIAGEN PlasmidMegaKit去除雜蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素，得到純化質(zhì)粒。
實(shí)施例3 pET32a-ECANS原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化 為獲得大量的HSP65或ECANS蛋白抗原，將擴(kuò)增得到的ECANS HSP65編碼基因用五coi /和歷""http:///雙酶切，與經(jīng)相應(yīng)酶切的原核表 達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建了 pET32a-ECANS和pET32a-HSP65原核
表達(dá)質(zhì)粒。
以pET32a-ECANS轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37°C 培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)LB (Ampl00|ig/ml)液體培養(yǎng)基振蕩 培養(yǎng)至A600達(dá)到0.75左右，加入異丙基硫代半糖苷(IPTG)至終 濃度為0.5mM。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，4000r/min離心20min收集菌 體，lxPBS重懸后超聲破碎，12000r/min于4'C離心20min，分別收 獲上清和沉淀。上清過(guò)親和層析柱，以不同濃度洗脫液洗脫，收集每 lml洗脫液，保存A280大于l.O的洗脫液，最后經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳鑒定表達(dá)的蛋白。最后得到純化融合蛋白ECANS或HSP65。實(shí)施例4 ECANS基因疫苗免疫小鼠
將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-ECANS溶解于無(wú)菌、無(wú)熱源的PBS 中，濃度調(diào)為lpg/pl。 6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)健康小鼠18只，分 為3組(1) pcDNA3.1空質(zhì)粒對(duì)照；(2) pcDNA3.1-HSP65質(zhì)粒組； (3) pcDNA3.1-ECANS質(zhì)粒。采用肌肉注射法免疫BALB/c小鼠 采輕度麻醉后，在脛骨前肌肉正中注射100昭質(zhì)粒，每只小鼠兩腿各 50(ig/|dl。于0周、3周、6周肌注免疫小鼠三次。每?jī)芍芙?jīng)眼眶采血， 血樣4。C過(guò)夜，6000轉(zhuǎn)/min離心15min獲得血清，-20。C凍存。
實(shí)施例5 pcDNA3.1-ECANS基因疫苗誘導(dǎo)的特異性抗體應(yīng)答
間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中特異的抗結(jié)核抗原IgG。以實(shí) 施例3獲得的純化的HSP65蛋白5pg/ml包被聚苯乙烯微孔板4。C過(guò) 夜，100^1/孔。以封閉液(10%山羊血清、0.5%牛血清白蛋白、 0.05°/。Tween-20)封閉板，200^1/孔，37。Clh?？寡褰?jīng)1: 80稀釋后， 100^1/孔，37。Clh，洗滌后加入1:4000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG， 37°Clh，洗板后以鄰苯二胺顯色30min，終止反應(yīng)后測(cè)A柳值。
如圖4A顯示pcDNA3.1-ECANS基因疫苗免疫三次以后在小鼠 體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了 HSP65特異性的IgG應(yīng)答，血清IgG滴度在第14周 時(shí)達(dá)到最髙，達(dá)1: 640，而空質(zhì)粒注射組則無(wú)特異性抗體生成。若 檢測(cè)各表位特異性抗體的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-ECANS基因免疫還 誘導(dǎo)了另外兩種結(jié)核抗原Ag85A和ESAT-6特異性抗體應(yīng)答。其中， pcDNA3.1-ECANS疫苗誘導(dǎo)的Ag85A特異性IgG效價(jià)達(dá)10000，顯著高于pcDNA3.1-HSP65疫苗的6000 (圖4B);其誘導(dǎo)的ESAT-6特 異性IgG效價(jià)達(dá)3200，與pcDNA3.1-HSP65疫苗效果相仿(圖4C)。 總之，pcDNA3.1-ECANS疫苗肌肉注射免疫小鼠誘導(dǎo)了較強(qiáng)的結(jié)核 多個(gè)抗原特異性抗體應(yīng)答。
實(shí)施例6 pcDNA3.1-ECANS基因疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答
小鼠免疫第8周處死，取脾細(xì)胞，去除紅細(xì)胞后洗滌2次，以5 乂105細(xì)胞/孔加入96孔板，分別加入非特異性抗原conA (5pg/ml) 或純化的HSP65蛋白(50(ig/ml)， 37°C、 5%0)2培養(yǎng)72小時(shí)，在收 獲細(xì)胞前18小時(shí)每孔加入0.5uCi SH-TdR，最后以多頭細(xì)胞收集儀收 集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量cpm值。以各數(shù)值 除以空白對(duì)照，得到增殖的刺激指數(shù)，如圖5， pcDNA3.1-ECANS免 疫組淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組，證實(shí)被特異性激活。
在淋巴細(xì)胞殺傷試中，以4xl(f細(xì)胞/孔加入6孔板中，以ECANS 蛋白剌激，第二天加入50Wml的IL-2，培養(yǎng)5天后作為效應(yīng)細(xì)胞， 以轉(zhuǎn)染了 pcDNA3.1-ECANS基因的SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用CFSE 標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞后，以10: 1、 20: l和40: l的效靶比混合加入96孔 板，37"C作用6小時(shí)后收集細(xì)胞，加入PI 4'C染色30分鐘，流式細(xì) 胞儀檢測(cè)靶細(xì)胞調(diào)亡，計(jì)算殺傷百分比。不同質(zhì)粒免疫小鼠淋巴細(xì)胞 的特異性殺傷情況如圖6所示，pcDNA3.1-ECANS基因免疫組殺傷 在40: 1時(shí)達(dá)到45%，顯著高于對(duì)照組，證明該基因疫苗能夠誘導(dǎo) 較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，有抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的潛能。序列表
<110> 復(fù)旦大學(xué)
<120>基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用
<160> 18
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 540
<212> PRT
<213>結(jié)核桿菌熱休克蛋白65
<400> 1
Met Ala Lys Thr He Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr lie
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser lie Ala Lys Glu He Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys He Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gin
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly lie Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
115 120 125
Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gin lie Ala
130 135 140
Ala Thr Ala Ala He Ser Ala Gly Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie 145 150 155 160
Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val He Thr Val Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gin Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg 180 185 190Phe Asp Lys Gly Tyr lie Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg
195 200 205
Gin Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr lie Leu Leu Val Ser Ser Lys
210 215 220
Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val lie Gly 225 230 235 240
Ala Gly Lys Pro Leu Leu He He Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
245 250 255
■Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys lie Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gin
275 280 285
Asp Met Ala lie Leu Thr Gly Gly Gin Val lie Ser Glu Glu Val Gly
290 295 300
Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys 305 310 315 320
Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr lie Val Glu Gly Ala Gly Asp
325 330 335
Thr Asp Ala lie Ala Gly Arg Val Ala Gin lie Arg Gin Glu lie Glu
340 345 350
Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val lie Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu
370 375 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg lie Glu Asp Ala Val Arg Asn 385 390 395 400
Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly lie Val Ala Gly Gly Gly Val Thr
405 410 415
Leu Leu Gin Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp
420 425 430
Glu Ala Thr Gly Ala Asn lie Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu
435 440 445
Lys Gin He Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
450 455 460
Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gin Thr Gly 465 470 475 480
Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val 485 490 495Thr Arg Ser Ala Leu Gin Asn Ala Ala Scr lie Ala Gly Leu Phe Leu
500 505 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser
515 520 525
Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 530 535 540
<210> 2 <211> 1620 <212> DNA
<213>結(jié)核桿菌熱休克蛋白65 <400> 2
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60
gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240
gatgacgteg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300
gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360
aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg cteaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc 480
gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc $40
tttgggctgc agctcgagct caccg鄉(xiāng)gt atgeggttog acaagggeta catctcgggg 600
tacttcgtga ccgaeccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg 660
gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga 720
gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg 780gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc 840
gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900
gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag 960
gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc 1020
gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt 1080
gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt 1140
gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat 1200
gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg 1260
gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg 1320
aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc 13 80
gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt 1440
gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg 1500
ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac 1560
aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc 1620
<210> 3 <211> 13 <212> PRT
<213>結(jié)核桿菌EAST-6 ,228抗原 <400> 3
Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr lie<210> 4 <211> 39 <212> DNA
<213>結(jié)核桿菌EAST-6189-228抗原 <400> 4
gagctgaaca acgcgctgca gaacctggcg cggacgatc 39
<210> 5
<211〉 12
<212> PRT
<213> 結(jié)核桿菌Ag85A369.4G5抗原
<400> 5
Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu 1 5 10
<210> 6 <211> 36 <212> DNA
<213>結(jié)核桿菌Ag85A369.4()5抗原 <400> 6
ggtctttcga tggctgcttc ttcggcgctg acgctg 36
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213>結(jié)核桿菌CFP-10162-2Q7抗原
<400> 7
Val Val Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys Gin Lys Gin Glu Leu 1 5 10 15
<210> 8<211> 45 <212> DNA
<213〉結(jié)核桿菌CFP-10162.2Q7抗原 <400> 8
gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactc
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213>結(jié)核桿菌Ag85B42(M59抗原
<400> 9
Gin Gin Phe lie Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10
<210> 10 <211> 39 <212> PRT
<213>結(jié)核桿菌Ag85B42(M59抗原 <400> 10
cagcagttcatctacgccgg ctcgctgtcg gccctgctg 39
<210> 11 <211> 596 <212> PRT
<213>嵌合了4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白65外源目的基因蛋白 <400> 11
Met Ala Lys Thr lie Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr He 35 40 45Thr Asn Asp Gly Val Ser lie Ala Lys Glu lie Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys lie Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gin
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly He Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
115 120 125
Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gin lie Ala
130 135 140
Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr lie Ala 145 150 155 160
Ala lie Ser Ala Gly Asp Gin Ser He Gly Asp Leu lie Ala Glu Gly
165 170 175
Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Met Asp Lys Val
180 185 190
Gly Asn Glu Gly Val lie Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu
195 200 205
Gin Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr lie Ser
210 215 220
Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gin Glu Ala Val Leu Glu Asp 225 230 235 240
Pro Tyr lie Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu
245 250 255
Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val lie Gly Ala Gly Lys Pro Leu Leu He
260 265 270
He Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn
275 280 285
Lys lie Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe
290 295 300
Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gin Asp Met Ala He Leu Thr Gly 305 310 315 320
Gly Gin Val He Ser Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp
325 330 335
Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu 340 345 350
29<formula>formula see original document page 30</formula><400> 12
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60
gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggatc cgtacgagaa gatoggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240
gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300
gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360
aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca 480
gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct 540
gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc 600
gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag 660
ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac 720
ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc 780
gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag 840
gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag 900
gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt 960
ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta 1020
ggcaaggccc gcaaggtogt ggtcaccaag gacgagacca ccatcgtega gggcgccggt 1080
gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac 1140tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg 1200
gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag 1260
gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctaccagcag 1320
ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc 1380
gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg 1440
gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg 1500
gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag 1560
aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat 1620
ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg 1680
gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag 1740
gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc 1788
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> HSP65上游引物
<400> 13
gaagaattca tggccaagac aattgcg 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> HSP65下游引物
<400> 14
cataagcttt cagaaatcca tgccacc 27<210> 15 <211> 88 <212> DNA <213> Tl引物 <400> 15
cgatggactg gtcacccgcc gaaatcgctg cgatcgtccg cgccaggttc tgcagcgcgt 60 tgttcagctc ggtggccgca atctgctc 88
<210> 16 <211> 88 <212〉 DNA <213> T2引物 <400> 16
gggtgaccag tccatcggtg acctgatcgc cgagggtctt tcgatggctg cttcttcggc 60 gctgacgctg gcgatggaca aggtgggc 88
<210> 17 <211> 73 <212> DNA <213> El引物 <400> 17
ggtaggcggc gagttcctgc ttctgcttat tggctgcttc ttggaagcgc accacctcga 60 tgcggtgctt gcg 73
<210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> E2弓l物 <400> 18
ggaactcgcc gcctaccagc agttcatcta cgccggctcg ctgtcggccc tgctggatgc 60 ggttcgcaat gcc 7權(quán)利要求
1. 一種基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，由一個(gè)載體構(gòu)成，其特征在于在所述的載體中插入有結(jié)核桿菌熱休克蛋白的全長(zhǎng)基因，所述的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長(zhǎng)基因中嵌合有來(lái)自結(jié)核桿菌抗原的4個(gè)T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個(gè)T細(xì)胞表位分別是結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369～405位基因，結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162～207位基因，結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420～459位基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自 pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列SEQID 如NO: l所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序列如 SEQIDNO: 2所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的氨基酸 序列如SEQ ID N0:3所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的DNA序 列如SEQIDNO:4所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序 列如SEQ IDNO:5所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序 列如SEQ IDNO:6所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸 序列如SEQ ID NO:7所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序 列如SEQ ID NO:8所示。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序 列如SEQ IDNO:9所示。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序 列如SEQ IDNO:10所示。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于在結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65全長(zhǎng)基因中的第438位堿 基后插入結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位堿 基后插入結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位堿 基后插入結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和結(jié)核桿菌 Ag85B蛋白的420 459位基因。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的 結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因之間以gccgcctac基因序 列相連接。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于嵌合了結(jié)核桿菌4個(gè)T細(xì)胞表位基因的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如 SEQIDNO:ll所示。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征 在于嵌合了結(jié)核桿菌4個(gè)T細(xì)胞表位基因的結(jié)核桿菌熱休克蛋 白HSP65的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO: 12所示。
17. 權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，其特征在于包括以下步驟1) 提取結(jié)核分枝桿菌DNA作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增 結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65編碼基因；2) 以結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65基因作為模板，分別通過(guò) PCR擴(kuò)增彼此有17個(gè)堿基重疊的雙鏈DNA片段1、片段2、 片段3，所述的片段1的雙鏈DNA的序列為stggccaag3 C33ttgcgts cgscgaagsg gcccgtcgcg gcctcgsgcg gggcttgsac taccggttct gttsacgcst gctgcttctc cgggcsgcgc cggsgctcgc cccg33cttggccctcgccg stgcggtssa ggtgscsttg ggccccasgg gccgc33cgt cgtcctggaa cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt33gaagtggg gtgcccccsc gstcaccaac gatggtgtgt ccstcgccas ggagstcgsg ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctcctggsggstc cgt3cg3g33 gstcggcgcc gagctggtcs 3ag3ggtagc cssgssgacc g3cctcct3g gcaitgctctt ctsgccgcgg ctcgaccsgt ttctcc3tcg gttcttctggg3tg3cgtcg ccggtgscgg caccscgacg gccsccgtgc tggcccsggc gttggttcgc ctactgcsgc ggccsctgcc gtggtgctgc cggtggcacg sccgggtccg cssccasgcggagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcasacg cggcatcgsa ctcccggscg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc csgsgtttgc gccgtsgcttaaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag ttccggcscc tcttccsgtg gctctgggsc gagttcccgc ggttcctccs gctctggttcg3gcag3ttg cggccsccgs gctgsscssc gcgctgc3g3 acctggcgcg gscgstcgcs ctcgtcta3c gccggtggct cgscttgttg cgcgacgtct tggsccgcgc ctgctsgcgtgcgstttcgg cgggtgsccs gtccstcg cgctssaigcc gcccsctggt csggtsgc所述的片段2的雙鏈DNA的序列為gggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct cccsctggt csggtsgccs ctggsctsgc ggctcccsgs ataigctsccgsgcttcttcgg cgctgscgct ggcgstggsc ssggtgggcs 3cg3gggcgt cstcaccgtc cgasgssgcc gcgsctgcga ccgctacctg ggccscccgt tgctcccgcs gtsgtggcsggaggsgtccs sc3cctttgg gctgcsgctc gsgctcsccg sgggtstgcg gttcg3c33g ctcctcsggt tgtgg333cc cgscgtcgsg ctcgsgtggc tccca1t3cgc csaigctgttcggctscstct cggggt3ctt cgtgsccgsc ccggagcgtc aggsggcggt cctggaggsc ccgstgtags gccccstgss gcsctggctg ggcctcgcag tcctccgccs ggscctcctgccctacatcc tgctggtcsg ctccsaggtg tccactgtca aggstctgct gccgctgctcgggstgtagg acgaccagtc gaggttccac aggtgacagt tcctagacga cggcgacgaggagsaggtcs tcggsgccgg tssgccgctg ctgstc3tcg ccgsggscgt cg3gggcg3g ctcttccsgt sgcctcggcc 3ttcggcgsc g3ctagtagc ggctcctgcs gctcccgctcgcgctgtcca ccctggtcgt c33ca3gatc cgcggcacct tcssgtcggt ggcggtcasg cgcgscsggt gggscc3gc3 gttgttctsg gcgccgtggs agttcagcc3 ccgccsgttcgctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt cgsgggccgs sgccgctggc ggcgttccgc t3cg3cgtcc tstsccggts 3g3gtggccaggtcaggtg3 tcsgcgssg3 ggtcggcctg 3cgctggag3 3cgccg3cct gtcgctgcts cc3gtcc3ct agtcgcttct ccagccggac tgcgscctct tgcggctgg3 csgcgacgstggcssggccc gcssggtcgt ggtcsccasg gscgsgaccs ccatcgtcgs gggcgccggt ccgttccggg cgyyccagca ccagtggttc ctgctctggt ggtagcagct cccgcggccag3csccgscg ccstcgccgg scgagtggcc csgstccgcc 3ggagatcgs gascsgcgac ctgtggctgc ggtsgcggcc tgctcaccgg gtctsggcgg tcctctsgct cttgtcgctgtccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg sggctgatgc tggcsctctt cgscgtcctc gccgaiccggt tcgsccggcc 3cc3c3gcgcgtgatcaagg ccggtgccgc csccgsggtc g33ctc33gg sgcgcssgcs ccgcstcgsg c3ct3gttcc ggccscggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctcgtggtgcgct tcc33g33gc 3gcc33t33g csgsagcsgg ssctcgccgc ctscc caccacgcga sggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gstgg所述的片段3的雙鏈DNA的序列為gg 3sctcgccgc ctsccsgcsg cc ttgsgcggcg gstggtcgtcttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcastgc cssggccgccS3gtagatgc ggccgsgcgs csgccgggsc gacctacgcc 33gcgttscg gttccggcgggtcgaggagg gcstcgtcgc cggtgggggt gtgscgctgt tgcaisgcggc cccgaccctgcsgctcctcc cgtsgcsgcg gccscccccs csctgcgacs 3cgttcgccg gggctgggscgacgsgctgs 3gctcg33gg cg3cgsggcg 3ccggcgccs 3C3tcgtgss ggtggcgctgctgctcgsct tcgsgcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtsgcsctt ccsccgcgscgaggccccgc tg33gc3g3t cgccttcsac tccgggctgg 3gccgggcgt ggtggccgsgcaccggggcg 3cttcgtct3 gcggaiagttg 3ggcccgscc tcggcccgcs ccaccggcgcsaggtgcgc3 scctgccggc tggccscggs ctgaaicgctc sgaccggtgt ctscgaggatttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgsg tctggccacs gatgctcctactgctcgctg ccggcgttgc tg3cccggtc saggtgaccc gttcggcgct gcag33tgcggscgagcgsc ggccgcs3cg actgggccag ttccsctggg c33gccgcg3 cgtcttscgcgcgtcc3tcg cggggctgtt cctgsccscc gsggccgtcg ttgccgscss gccgg3333gcgcaggtsgc gccccgscas ggsctggtgg ctccggcsgc 33cggctgtt cggccttttcgagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgsc stgggtggcs tggstttcctcttccg33 cc§33gggcc sccgccgctg tscccsccgt acct333g;3) 將上述的3段片段混合，變性成為單鏈，通過(guò)彼此重疊的17個(gè)堿基互補(bǔ)連接，以此作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源目的基因，將目的基因經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體連接，獲得權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗。
18.如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于以SEQ ID NO: 13所示的HSP65上游引物和SEQID NO: 15所示的HSP65T1引物通過(guò)PCR擴(kuò)增片段1 。
19. 如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方 法，其特征在于以SEQIDNO: 16所示的引物HSP65T2序列和 SEQ ID NO: 17所示的引物HSP65 El序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段2。
20. 如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方 法，其特征在于以SEQ ID NO: 18所示的引物HSP65E2序列和 SEQ ID NO: 14所示的HSP65下游引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段3 。
21. 如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方 法，其特征在于用SEQ ID NO: 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO: 14所示的HSP65下游引物以片段1、 2、 3混合并變性為 單鏈、互補(bǔ)連接后的基因?yàn)槟０澹ㄟ^(guò)PCR方法擴(kuò)增嵌合了 4個(gè) T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源目的基因；
22. 如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方 法，其特征在于嵌合了4個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65外源目的基因 和插入載體的酶切位點(diǎn)分別為EcoRI和Hind III位點(diǎn)。
23. 如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方 法，其特征在于所有抗原來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv株。
24. 如權(quán)利要求17所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗的制備方 法，其特征在于所述的載體選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì) 粒。
25. —種藥物組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求1所述的基 于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗。
26. 如權(quán)利要求1所述的一種藥物組合物，其特征在于還含有藥學(xué)上 可接受的載體或者賦形劑。
27. 權(quán)利要求1所述的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗在制備治療和 預(yù)防結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗，在載體中插入嵌合有來(lái)自結(jié)核桿菌抗原的4個(gè)T細(xì)胞表位多肽基因的結(jié)核桿菌熱休克蛋白的全長(zhǎng)基因。本發(fā)明還公開(kāi)了疫苗的制備方法，是在HSP65全長(zhǎng)基因中插入4個(gè)來(lái)自結(jié)核桿菌抗原中的T細(xì)胞表位基因EAST-6_189-228、Ag85A_369-405、CFP10_162-207和Ag85B_420-459。本發(fā)明還公開(kāi)了ECANS結(jié)核基因疫苗的應(yīng)用。通過(guò)將本發(fā)明的基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，證實(shí)可誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)結(jié)核抗原的特異性抗體應(yīng)答，能誘導(dǎo)較強(qiáng)的結(jié)核特異性殺傷應(yīng)答，同時(shí)可誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，分泌高水平IFNγ，是一種優(yōu)良的預(yù)防和治療結(jié)核病的疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101451145SQ20071017141
公開(kāi)日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者薇 徐, 熊思東, 高海峰 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)