本發(fā)明涉及植物抗病毒基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)弱毒株系的篩選及其在交叉保護中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，主要侵染西瓜、黃瓜、甜瓜、葫蘆等多種葫蘆科作物，給這些作物上的安全生產(chǎn)造成巨大損失。由于生產(chǎn)上缺乏免疫或高抗CGMMV的品種，市場上又沒有對病毒病特效的藥劑，因而CGMMV的防治非常困難。

交叉保護是指植株受弱毒株系侵染后，免受后繼的病毒強毒株系侵染的現(xiàn)象，已經(jīng)在許多作物病毒病的防治中取得了成功。限制交叉保護廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素是可用的弱毒株系太少。目前，關(guān)于CGMMV株系劃分的研究較多，但是關(guān)于CGMMV弱毒株系中的研究很少。本發(fā)明通過定點突變技術(shù)，獲得了兩個新的致病力顯著降低的CGMMV弱毒株系，攻毒實驗證明，弱毒株系CP89A和Rd1069A可以有效控制CGMMV強毒株系的侵染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種CGMMV弱毒株系的篩選及應(yīng)用，以CGMMV的侵染性克隆為基礎(chǔ)，通過定點突變技術(shù)在CGMMV的基因中定點引入突變，明確了調(diào)控CGMMV致病力的氨基酸位點，獲得了致病力顯著下降的CGMMV弱毒突變體。通過測定弱毒株系對強毒株系的交叉保護效果，獲得了能有效保護植株免受CGMMV強毒株系侵染的弱毒株系。

本發(fā)明實施的具體技術(shù)方案是：

a.突變體的獲得：以自主構(gòu)建的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆為基礎(chǔ)，針對其衣殼蛋白(CP)的第89位、114位氨基酸和依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的第68位、869位和1069位氨基酸設(shè)計突變引物，利用QuickChange^TM定點突變試劑盒在這些位點引入突變。

b.弱毒株系的篩選：通過農(nóng)桿菌浸潤法將a中獲得的突變體接種到寄主植物本氏煙，觀察這些突變體所致癥狀的變化，篩選致病力明顯降低的突變體。

c.交叉保護效果測定：在接種弱毒株系后10天接種CGMMV強毒株系，觀察弱毒株系對強毒株系的交叉保護效果。

采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案，可以獲得如下的技術(shù)效果：

1)獲得了兩個致病力明顯降低的CGMMV弱毒株系。

2)弱毒株系CP89A和Rd1069A可有效保護植株免受CGMMV強毒株系的侵染。

附圖說明

圖1為CGMMV強毒株系和突變體接種后第10天的癥狀；

圖2接種10天時CGMMV強毒株系和突變體RNA在煙草中的積累水平；

圖3接種10天時CGMMV強毒株系和突變體衣殼蛋白(CP)在煙草中的積累水平；

圖4間隔期為10天，弱毒株系在挑戰(zhàn)接種后10天對煙草植株的保護效果；

圖5為交叉保護實驗中煙草植株內(nèi)CGMMV基因組RNA的積累水平；

圖6為交叉保護實驗中煙草植株內(nèi)CGMMV蛋白的積累水平。

具體實施方式

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明所提供的實施例，均按照常規(guī)實驗條件，其中所采用的引物序列如下表：

F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分別CGMMV CP第89位的D和第114位的R突變?yōu)锳；將RdRp第68位的E、第869位的K和第1069位的E突變?yōu)锳，加粗的字母代表突變的核苷酸。CP與ef1α兩對引物用于熒光定量PCR檢測病毒基因積累水平，其中EF1α為植物內(nèi)參基因。

實施例1：定點突變

以黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆pCaCGMMV為模板，利用PCR對五個位點分別進行突變，所用聚合酶為Phusion高保真聚合酶(Finnzymes)。

PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)結(jié)束，在PCR產(chǎn)物中加入0.5μL Dpn I(20U/μL)，37℃處理2h，加入125μL無水乙醇和5μL 3mol/L的醋酸鈉(pH＝5.2)混勻，-20℃沉淀過夜。13000r/min離心10min，棄上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗滌后置于室溫自然干燥，加入10μL ddH₂O水回溶，轉(zhuǎn)化大腸桿菌stbl3，突變質(zhì)粒經(jīng)測序驗證。

實施例2：病毒接種

將pCaCGMMV或突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。經(jīng)菌落PCR驗證后，挑單斑接種于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四環(huán)素(50μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三種抗生素的LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。離心收集菌體并重新懸浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，調(diào)整濃度使其OD₆₀₀為0.5左右，室溫靜置3小時。取5mL一次性注射器，去掉針頭吸取農(nóng)桿菌菌液，從本氏煙(5－6周齡或4－6片真葉)葉片背面浸潤。每株浸潤2片葉。浸潤的植株置于23℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16小時光照/8小時黑暗交替)。

實施例3：癥狀觀察及病毒濃度檢測

觀察接種植物的癥狀，用熒光定量PCR及ELISA檢測病毒基因及蛋白積累水平。在接種后第10天，野生型病毒及突變體CP114A、Rd68A、Rd869A在本氏煙(Nicotiana benthamiana)系統(tǒng)葉上引起明顯的花葉和斑駁等癥狀，而衣殼蛋白第89位與復(fù)制酶RdRp第1069位突變體在本氏煙上幾乎不表現(xiàn)癥狀(圖1)。發(fā)明人將這些弱毒突變體分別命名為CP89A和Rd1069A(其中，CP89A的CP基因核苷酸序列見Seq ID No.15，其CP氨基酸序列見Seq ID No.17；Rd1069A的RdRp基因核苷酸序列見Seq ID No.16，其RdRp氨基酸序列見Seq ID No.18)。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，以上兩個突變體(株系)在煙草葉片中的RNA表達水平明顯低于野生型病毒與其他突變體,病毒積累水平約為野生型病毒的10％(圖2)。ELISA檢測結(jié)果表明，以上兩個株系在煙草葉片中的病毒積累量明顯低于野生型病毒與其他突變體(圖3)。

實施例4：交叉保護效果測定

選取5周左右的本氏煙，接種弱毒株系CP89A和Rd1069A(保護接種)。保護接種后10天接種強毒株系。每個處理接種3棵本氏煙，重復(fù)3次。

在接種強毒株系后的第10天調(diào)查發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)只接種強毒株系的本氏煙植株表現(xiàn)嚴(yán)重的花葉癥狀，發(fā)病率為100％；而預(yù)先接種CP89A和Rd1069A植株發(fā)病率為8.3％和0(圖4)，說明在間隔期為10天時，兩個弱毒突變體的保護效果分別為91.7％和100％。

熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，間隔期為10天的處理中，弱毒突變體保護的煙草中病毒RNA的積累水平明顯低于未進行交叉保護的煙草(圖5)。同時發(fā)現(xiàn)突變體保護的本氏煙攻毒后病毒粒子的濃度極低，以至于Western blot無法檢測(圖6)。

以上結(jié)果表明，弱毒株系CP89A和Rd1069A對強毒株系具有較好的交叉保護效果，可有效保護植物免受CGMMV強毒株系的侵染。

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>黃瓜綠斑駁花葉弱毒株系的篩選及在交叉保護中的應(yīng)用

<160>24

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

acggctacgc gtaatagggt cattgaggtt gtaga 35

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

attacgcgta gccgtggagc tgagaagcga aa 32

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctgtgaaggc tactgatgac gcgtctacag cc 32

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcagtagcct tcacagcgtt aagcgactca gcag 34

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tccggcgttt tcgattagct ttaccgccac c 31

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgaaaacgcc ggatacgcat cagttacaag cct 33

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggagcgaccg ccgagattat agcgagggtc aat 33

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ggcggtcgct ccacaacccg gcactcc 27

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gtgcatgcaa ttcaaggaga aacctttgag gagacg 36

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cttgaattgc atgcacagta ttcacatcat tgtacccac 39

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cagactcaag cgggaaga 18

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aagccctatc gtaaacatca 20

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tggtgtcctc aagcctggta t 21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

acgcttgaga tccttaaccg c 21

<210>15

<211>486

<212>DNA

<213>黃瓜綠斑駁病毒衣殼蛋白（Coat Ptotein）基因

<400>15

1 atggcttaca atccgatcac acctagcaaa cttattgcgt ttagtgcttc ttatgttccc

61 gtcaggactt tacttaattt tctagttgct tcacaaggta ccgctttcca gactcaagcg

121 ggaagagatt ctttccgcga gtccctgtct gcgttaccct cgtctgtcgt agatattaat

181 tctagattcc cagatgcggg tttttacgct ttcctcaacg gtcctgtgtt gaggcctatc

241 ttcgtttcgc ttctcagctc cacggatacg cgtaataggg tcattgaggt tgtagatcct

301 agcaatccta cgactgctga gtcgcttaac gctgtaaagc gtactgatga cgcgtctacg

361 gccgctaggg ctgagataga taatttaata gagtctattt ctaagggttt tgatgtttac

421 aatagggctt catttgaagc cgcgttttcg gtagtctggt cagaggctac cacctcgaaa

481 gcttag

<210>16

<211>4947

<212>DNA

<213>黃瓜綠斑駁病毒聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）基因

<400>16

1 atggcaaaca ttaatgaaca aatcaacaac caacgtgacg ccgcggctag cgggagaaac

61 aatctcgtta gccaattggc gtcaaaaagg gtgtatgacg aggctgttcg ctcgttggat

121 catcaagaca gacgcccgaa aatgaacttt tctcgtgtgg tcagcacaga gcacaccagg

181 cttgtaactg atgcgtatcc ggagttttcg attagcttta ccgccaccaa gaactctgta

241 cactcccttg cgggtggtct gaggcttctt gaattggaat atatgatgat gcaagtgccc

301 tacggctcac cttgttatga catcggcggt aactatacgc agcacttgtt caaaggtaga

361 tcatatgtgc attgctgcaa tccgtgccta gatcttaaag atgttgcgag gaatgtgatg

421 tacaacgata tgatcacgca acatgtacag aggcacaagg gatctggcgg gtgcagacct

481 cttccaactt tccagataga tgcattcagg aggtacgata gttctccctg tgcggtcacc

541 tgttcagacg ttttccaaga gtgttcctat gattttggga gtggtaggga taatcatgcg

601 gtctcgttgc attcaatcta cgatatccct tattcttcga tcggacctgc tcttcatagg

661 aaaaatgtgc gagtttgtta tgcagccttt catttctcgg aggcactgct tttaggttcg

721 cctgtaggta atttaaatag tattggggct cagtttaggg tcgatggtga tgatgtgcat

781 tttcttttta gtgaagagtc tactttgcat tatactcata gtttagaaaa tatcaagtta

841 atcgtgatgc gtacttattt tcctgctgat gataggtttg tatatattaa ggagttcatg

901 gttaagcgtg tggatacttt tttctttagg ttggttaggg cagacacaca catgcttcat

961 aaatctgtgg ggcactattc gaaatcgaag tctgagtact tcgcgctgaa tacccctccg

1021 atcttccaag ataaagccac gttttctgtg tggtttcctg aagcgaagcg caaggtgttg

1081 atacccaagt ttgaactttc gagattcctt tctgggaatg tgaaaatctc taggatgctt

1141 gtcgatgctg atttcgtcca taccattatt aatcacatta gcacgtatga taacaaggcc

1201 ttagtgtgga aaaatgttca gtcctttgtg gaatccatac gttcaagagt aattgtaaac

1261 ggagtttccg tgaaatctga gtggaatgta ccggttgatc agctcactga tatctcgttc

1321 tcgatattcc ttctcgtgaa ggttaggaag gtacagatcg agttaatgtc tgataaagtt

1381 gtaatcgagg cgaggggttt gcttcggagg ttcgcagaca gtcttaaatc tgccgtagaa

1441 ggactaggtg attgcgtcta tgatgctcta gttcaaaccg gctggtttga cacctctagc

1501 gacgaactga aagtattgct acctgaaccg tttatgacct tttcggatta tcttgaaggg

1561 atgtacgagg cagatgcaaa gatcgagaga gagagtgtct ctgagttgct cgcttccggt

1621 gatgatttgt tcaagaaaat cgatgagata agaaacaatt acagtggagt cgaatttgat

1681 gtagagaaat tccaagaatt ttgcaaggaa ctgaatgtta atcctatgct aattggccac

1741 gttatcgaag ctattttttc gcagaaggct ggggtaacag taacaggttt gggcacgctc

1801 tctcctgaga tgggcgcttc tgttgcgtta tccagtacct ctgtagatac atgtgaagat

1861 atggatgtaa ctgaagatat ggaggatata gtgttgatgg cggacaaggg tcattcttac

1921 atgtcccctg aaatggcgag atgggctgat gttaaatatg gcaacaacaa aggagctcta

1981 gtcgagtaca aagtcggaac ctcgatgact ttacctgcca cctgggcaga gaaaggtaag

2041 gctgttttac cgttgtcggg gatctgtgtg aggaaacccc aattttcgaa gccgattgat

2101 gaggaagatg acttgaggtt atcaaacatg aatttcttta aggtgagcga tctaaagttg

2161 aagaagacta tcactccagt cgtttacact gggaccattc gagagaggca aatgaagaat

2221 tatattgatt acttatcggc ctctcttggt tccacgctgg gtaatctgga gaggatcgtg

2281 cggagtgatt ggaatggtac tgaggagagt atgcaaacgt tcgggttgta tgactgcgaa

2341 aagtgcaagt ggttattgtt gccagccgag aagaagcacg catgggccgt ggttctggca

2401 agtgatgata ccactcgcat aatcttcctt tcatatgacg aatctggttc tcctataatt

2461 gataagaaaa attggaagcg atttgctgtc tgttccgaga ccaaagtcta tagtgtaatt

2521 cgtagtttag aggttctaaa taaggaagca atagtcgacc ccggggttca cataacatta

2581 gttgacggag tgccgggttg tggaaagacc gccgagatta tagcgagggt caattggaaa

2641 actgatctag tattgactcc cgggagggag gcggctgcta tgattaggcg gagagcctgc

2701 gccctgcaca agtcacctgt ggcaaccagt gacaacgtca gaactttcga ctcttttgtg

2761 atgaataaga aaatcttcaa gtttgacgct gtctatgttg acgagggtct gatggtccat

2821 acgggattac ttaattttgc gttaaagatc tcaggttgta aaaaggcctt cgtctttggt

2881 gatgctaagc aaatcccgtt tataaacaga gtcatgaatt ttgattatcc taaagagtta

2941 agaactttaa tagtcgataa tgtagagcgt aggtatgtca cccataggtg tcctagagat

3001 gtcactagtt ttcttagtac tatctataaa gccgctgtcg ctactactag tccggttgta

3061 cattctgtga gggcaattaa agtgtcaggg gccggtattc tgaggcctga gttgacaaag

3121 atcagaggaa agataataac gtttactcaa tctgataagc agtctttgat caagagtggg

3181 cacaatgatg tgaatactgt gcatgaaatt cagggagaaa cctttgagga gacggcagtt

3241 gtgcgtgcca ccccgactcc aataggtttg attgcccgtg attcaccaca cgtactagtg

3301 gccttaacta ggcacactaa ggcaatggtg tattatactg ttgtattcga tgcagttaca

3361 agtataatag cggatgtgga aaaggtcgat cagtcgatct tgaccatgtt tgctaccact

3421 gtgcctacca aatagcaatt aatgcagaac tcgctgtatg tccatcgtaa tattttcctc

3481 cctgtaagta aaacggggtt ttatacagac atgcaggagt tctacgatag atgccttcct

3541 gggaattcct tcgtactgaa tgatttcgat gccgtaacca tgcggttgag ggacaacgaa

3601 tttaacttac aaccttgtag gctaaccttg agtaatttag atccggtacc cgctttaatt

3661 aagaatgaag cgcagaattt tctgatcccc gttttgcgta cggcctgtga aaagccgcgc

3721 attccgggtc ttcttgagaa tcttgtagct atgataaaga ggaatatgaa tactcctgat

3781 ttagctggga ccgtagatat aactaacatg tcgatttcta tagtagataa cttcttttct

3841 tcttttgtta gggacgaggt tttacttgat cacttagatt gtgttagggc tagttccatt

3901 caaagttttt ctgattggtt ttcgtgtcag ccaacctcag cggttggcca gttagctaat

3961 ttcaatttca tagatttgcc tgcctttgat acttatatgc atatgattaa gaggcaaccc

4021 aagagtcggt tagatacttc gattcagtct gaatatccgg ccttgcaaac tattgtttat

4081 caccctaaag tggtaaatgc ggtttttggt ccggttttca agtatttgac caccaagttt

4141 cttagtatgg tagatagttc taagtttttc ttttacacta ggaaaaaacc agaagatctg

4201 caggaatttt tctcagatct ctcttcccat tctgattatg agattcttga gcttgatgtt

4261 tctaaatatg acaagtcgca atccgatttc catttctctg ttgagatggc aatttgggaa

4321 aaattggggc tggacgatat tttggcttgg atgtggtcta tgggtcacaa aagaactata

4381 ctgcaagatt tccaagccgg gataaagacg ctcatttact atcaacggaa gtctggtgat

4441 gtaactactt ttataggtaa tacctttatt atcgcagcgt gtgtagctag tatgttgccg

4501 ttagataagt gttttaaagc tagtttttgt ggtgatgatt cgctgatcta ccttcctaag

4561 ggcttagagt atcctgatat acaggctact gccaaccttg tttggaattt tgaggcgaaa

4621 cttttccgaa agaagtatgg ttacttctgc gggaagtata taattcatca tgccaatggc

4681 tgtattgttt accctgaccc tttaaagtta attagtaaat taggtaataa gagtcttgta

4741 gggtatgagc atgttgagga gtttcgtata tctctcctcg acgttgctca tagtttgttt

4801 aatggtgctt atttccattt actcgacgat gcaatccacg aattatttcc taatgctggg

4861 ggttgcagtt ttgtaattaa ttgtttgtgt aagtatttga gtgataagcg ccttttccgt

4921 agtctttaca tagatgtctc taagtaa

<210>17

<211>161

<212>PRT

<213>黃瓜綠斑駁病毒衣殼蛋白（Coat Ptotein）

<400>17

1 METAlaTyrAsnProIleThrProSerLysLeuIleAlaPheSerAlaSerTyrValPro

21 ValArgThrLeuLeuAsnPheLeuValAlaSerGlnGlyThrAlaPheGlnThrGlnAla

41 GlyArgAspSerPheArgGluSerLeuSerAlaLeuProSerSerValValAspIleAsn

61 SerArgPheProAspAlaGlyPheTyrAlaPheLeuAsnGlyProValLeuArgProIle

81 PheValSerLeuLeuSerSerThrAspThrArgAsnArgValIleGluValValAspPro

101 SerAsnProThrThrAlaGluSerLeuAsnAlaValLysArgThrAspAspAlaSerThr

121 AlaAlaArgAlaGluIleAspAsnLeuIleGluSerIleSerLysGlyPheAspValTyr

141 AsnArgAlaSerPheGluAlaAlaPheSerValValTrpSerGluAlaThrThrSerLys

161 Ala

<210>18

<211>1647

<212>PRT

<213>黃瓜綠斑駁病毒聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）

<400>18

1 METAlaAsnIleAsnGluGlnIleAsnAsnGlnArgAspAlaAlaAlaSerGlyArgAsn

21 AsnLeuValSerGlnLeuAlaSerLysArgValTyrAspGluAlaValArgSerLeuAsp

41 HisGlnAspArgArgProLysMETAsnPheSerArgValValSerThrGluHisThrArg

61 LeuValThrAspAlaTyrProGluPheSerIleSerPheThrAlaThrLysAsnSerVal

81 HisSerLeuAlaGlyGlyLeuArgLeuLeuGluLeuGluTyrMETMETMETGlnValPro

101 TyrGlySerProCysTyrAspIleGlyGlyAsnTyrThrGlnHisLeuPheLysGlyArg

121 SerTyrValHisCysCysAsnProCysLeuAspLeuLysAspValAlaArgAsnValMET

141 TyrAsnAspMETIleThrGlnHisValGlnArgHisLysGlySerGlyGlyCysArgPro

161 LeuProThrPheGlnIleAspAlaPheArgArgTyrAspSerSerProCysAlaValThr

181 CysSerAspValPheGlnGluCysSerTyrAspPheGlySerGlyArgAspAsnHisAla

201 ValSerLeuHisSerIleTyrAspIleProTyrSerSerIleGlyProAlaLeuHisArg

221 LysAsnValArgValCysTyrAlaAlaPheHisPheSerGluAlaLeuLeuLeuGlySer

241 ProValGlyAsnLeuAsnSerIleGlyAlaGlnPheArgValAspGlyAspAspValHis

261 PheLeuPheSerGluGluSerThrLeuHisTyrThrHisSerLeuGluAsnIleLysLeu

281 IleValMETArgThrTyrPheProAlaAspAspArgPheValTyrIleLysGluPheMET

301 ValLysArgValAspThrPhePhePheArgLeuValArgAlaAspThrHisMETLeuHis

321 LysSerValGlyHisTyrSerLysSerLysSerGluTyrPheAlaLeuAsnThrProPro

341 IlePheGlnAspLysAlaThrPheSerValTrpPheProGluAlaLysArgLysValLeu

361 IleProLysPheGluLeuSerArgPheLeuSerGlyAsnValLysIleSerArgMETLeu

381 ValAspAlaAspPheValHisThrIleIleAsnHisIleSerThrTyrAspAsnLysAla

401 LeuValTrpLysAsnValGlnSerPheValGluSerIleArgSerArgValIleValAsn

421 GlyValSerValLysSerGluTrpAsnValProValAspGlnLeuThrAspIleSerPhe

441 SerIlePheLeuLeuValLysValArgLysValGlnIleGluLeuMETSerAspLysVal

461 ValIleGluAlaArgGlyLeuLeuArgArgPheAlaAspSerLeuLysSerAlaValGlu

481 GlyLeuGlyAspCysValTyrAspAlaLeuValGlnThrGlyTrpPheAspThrSerSer

501 AspGluLeuLysValLeuLeuProGluProPheMETThrPheSerAspTyrLeuGluGly

521 METTyrGluAlaAspAlaLysIleGluArgGluSerValSerGluLeuLeuAlaSerGly

541 AspAspLeuPheLysLysIleAspGluIleArgAsnAsnTyrSerGlyValGluPheAsp

561 ValGluLysPheGlnGluPheCysLysGluLeuAsnValAsnProMETLeuIleGlyHis

581 ValIleGluAlaIlePheSerGlnLysAlaGlyValThrValThrGlyLeuGlyThrLeu

601 SerProGluMETGlyAlaSerValAlaLeuSerSerThrSerValAspThrCysGluAsp

621 METAspValThrGluAspMETGluAspIleValLeuMETAlaAspLysGlyHisSerTyr

641 METSerProGluMETAlaArgTrpAlaAspValLysTyrGlyAsnAsnLysGlyAlaLeu

661 ValGluTyrLysValGlyThrSerMETThrLeuProAlaThrTrpAlaGluLysGlyLys

681 AlaValLeuProLeuSerGlyIleCysValArgLysProGlnPheSerLysProIleAsp

701 GluGluAspAspLeuArgLeuSerAsnMETAsnPhePheLysValSerAspLeuLysLeu

721 LysLysThrIleThrProValValTyrThrGlyThrIleArgGluArgGlnMETLysAsn

741 TyrIleAspTyrLeuSerAlaSerLeuGlySerThrLeuGlyAsnLeuGluArgIleVal

761 ArgSerAspTrpAsnGlyThrGluGluSerMETGlnThrPheGlyLeuTyrAspCysGlu

781 LysCysLysTrpLeuLeuLeuProAlaGluLysLysHisAlaTrpAlaValValLeuAla

801 SerAspAspThrThrArgIleIlePheLeuSerTyrAspGluSerGlySerProIleIle

821 AspLysLysAsnTrpLysArgPheAlaValCysSerGluThrLysValTyrSerValIle

841 ArgSerLeuGluValLeuAsnLysGluAlaIleValAspProGlyValHisIleThrLeu

861 ValAspGlyValProGlyCysGlyLysThrAlaGluIleIleAlaArgValAsnTrpLys

881 ThrAspLeuValLeuThrProGlyArgGluAlaAlaAlaMETIleArgArgArgAlaCys

901 AlaLeuHisLysSerProValAlaThrSerAspAsnValArgThrPheAspSerPheVal

921 METAsnLysLysIlePheLysPheAspAlaValTyrValAspGluGlyLeuMETValHis

941 ThrGlyLeuLeuAsnPheAlaLeuLysIleSerGlyCysLysLysAlaPheValPheGly

961 AspAlaLysGlnIleProPheIleAsnArgValMETAsnPheAspTyrProLysGluLeu

981 ArgThrLeuIleValAspAsnValGluArgArgTyrValThrHisArgCysProArgAsp

1001 ValThrSerPheLeuSerThrIleTyrLysAlaAlaValAlaThrThrSerProValVal

1021 HisSerValArgAlaIleLysValSerGlyAlaGlyIleLeuArgProGluLeuThrLys

1041 IleArgGlyLysIleIleThrPheThrGlnSerAspLysGlnSerLeuIleLysSerGly

1061 HisAsnAspValAsnThrValHisGluIleGlnGlyGluThrPheGluGluThrAlaVal

1081 ValArgAlaThrProThrProIleGlyLeuIleAlaArgAspSerProHisValLeuVal

1101 AlaLeuThrArgHisThrLysAlaMETValTyrTyrThrValValPheAspAlaValThr

1121 SerIleIleAlaAspValGluLysValAspGlnSerIleLeuThrMETPheAlaThrThr

1141 ValProThrLys***GlnLeuMETGlnAsnSerLeuTyrValHisArgAsnIlePheLeu

1161 ProValSerLysThrGlyPheTyrThrAspMETGlnGluPheTyrAspArgCysLeuPro

1181 GlyAsnSerPheValLeuAsnAspPheAspAlaValThrMETArgLeuArgAspAsnGlu

1201 PheAsnLeuGlnProCysArgLeuThrLeuSerAsnLeuAspProValProAlaLeuIle

1221 LysAsnGluAlaGlnAsnPheLeuIleProValLeuArgThrAlaCysGluLysProArg

1241 IleProGlyLeuLeuGluAsnLeuValAlaMETIleLysArgAsnMETAsnThrProAsp

1261 LeuAlaGlyThrValAspIleThrAsnMETSerIleSerIleValAspAsnPhePheSer

1281 SerPheValArgAspGluValLeuLeuAspHisLeuAspCysValArgAlaSerSerIle

1301 GlnSerPheSerAspTrpPheSerCysGlnProThrSerAlaValGlyGlnLeuAlaAsn

1321 PheAsnPheIleAspLeuProAlaPheAspThrTyrMETHisMETIleLysArgGlnPro

1341 LysSerArgLeuAspThrSerIleGlnSerGluTyrProAlaLeuGlnThrIleValTyr

1361 HisProLysValValAsnAlaValPheGlyProValPheLysTyrLeuThrThrLysPhe

1381 LeuSerMETValAspSerSerLysPhePhePheTyrThrArgLysLysProGluAspLeu

1401 GlnGluPhePheSerAspLeuSerSerHisSerAspTyrGluIleLeuGluLeuAspVal

1421 SerLysTyrAspLysSerGlnSerAspPheHisPheSerValGluMETAlaIleTrpGlu

1441 LysLeuGlyLeuAspAspIleLeuAlaTrpMETTrpSerMETGlyHisLysArgThrIle

1461 LeuGlnAspPheGlnAlaGlyIleLysThrLeuIleTyrTyrGlnArgLysSerGlyAsp

1481 ValThrThrPheIleGlyAsnThrPheIleIleAlaAlaCysValAlaSerMETLeuPro

1501 LeuAspLysCysPheLysAlaSerPheCysGlyAspAspSerLeuIleTyrLeuProLys

1521 GlyLeuGluTyrProAspIleGlnAlaThrAlaAsnLeuValTrpAsnPheGluAlaLys

1541 LeuPheArgLysLysTyrGlyTyrPheCysGlyLysTyrIleIleHisHisAlaAsnGly

1561 CysIleValTyrProAspProLeuLysLeuIleSerLysLeuGlyAsnLysSerLeuVal

1581 GlyTyrGluHisValGluGluPheArgIleSerLeuLeuAspValAlaHisSerLeuPhe

1601 AsnGlyAlaTyrPheHisLeuLeuAspAspAlaIleHisGluLeuPheProAsnAlaGly

1621 GlyCysSerPheValIleAsnCysLeuCysLysTyrLeuSerAspLysArgLeuPheArg

1641 SerLeuTyrIleAspValSerLys