一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株及其分離培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及病毒微生物領(lǐng)域，屬于獸用生物制品領(lǐng)域，具體涉及一株豬流行性腹 瀉病毒變異毒株、其分離培養(yǎng)方法和在制備豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。 二、
【背景技術(shù)】：
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, PED)最早于1971年在英國(guó)的初生 仔豬和育肥豬群中被發(fā)現(xiàn)，19世紀(jì)80年代，亞洲也報(bào)道了 PED的發(fā)生，并在之后持續(xù)流行。 隨著PED弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，在多年內(nèi)，全世界PED的流行得到了一定的控 制。但是2010年底，中國(guó)再次暴發(fā)了 PED，此次流行的PED主要侵害1周齡內(nèi)仔豬，造成感 染仔豬嘔吐、腹瀉、繼而脫水和急性死亡，隨后日本、韓國(guó)、泰國(guó)等亞洲國(guó)家以及德國(guó)、法國(guó)、 瑞士、匈牙利、意大利等歐洲國(guó)家也相繼報(bào)道了 PED的暴發(fā)。2013年4月，美國(guó)愛(ài)荷華州首 例PH)被公布，之后一年時(shí)間內(nèi)，快速席卷了美國(guó)31個(gè)州，造成了養(yǎng)豬業(yè)重大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 引起PED的兀兇PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬α冠狀病毒，該病毒屬于單股 正義RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約28Kb，至少編碼7個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼順序?yàn)?' UTR-ORFla-O RFlb-S-0RF3-E-M-N-3'UTR，病毒粒子直徑為130nm(95nm~190nm)，囊膜上有花瓣?duì)罾w突， 長(zhǎng)18nm~23nm，由核心向四周呈放射狀。
[0004] PEDV的體外分離一直相對(duì)困難，Vero細(xì)胞的來(lái)源、毒株間的差異及培養(yǎng)條件上的 一些細(xì)節(jié)把握均會(huì)對(duì)PEDV的分離造成影響。本發(fā)明在多次成功分離PEDV的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上， 總結(jié)了一套實(shí)用的病毒分離和培養(yǎng)方法，同時(shí)，大量的基因組序列測(cè)定及進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)， 新出現(xiàn)的流行毒株同傳統(tǒng)的如CV777之類(lèi)的疫苗毒株相比已經(jīng)發(fā)生了較大的變化，使得傳 統(tǒng)疫苗不能夠?qū)π碌牟《靖腥咎峁┳銐虻谋Ｗo(hù)力，因此，分離新的流行毒株并且在此基礎(chǔ) 上制備新的疫苗已經(jīng)迫在眉睫，本發(fā)明便是在此背景下應(yīng)運(yùn)而生。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株及其分離培養(yǎng) 方法和應(yīng)用。本發(fā)明所分離的一株毒株經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，對(duì)S基因和0RF3基因（基因序列詳 見(jiàn)附件seql和seq2)的序列比較表明，該變異毒株同國(guó)內(nèi)外早期毒株和經(jīng)典疫苗株均存在 差異，利用該變異毒株制備的滅活疫苗免疫母豬后對(duì)所產(chǎn)仔豬能夠起到很好的保護(hù)作用。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0007] 本發(fā)明提供的一株豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus)變異 毒株，其菌種微生物保藏號(hào)為：CGMCC NO. 10893。
[0008] 所述豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus)變異毒株的保藏信 息如下：
[0009] 分類(lèi)命名：豬流行性腹瀉病毒；
[0010] 保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC);
[0011] 保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；
[0012] 保藏日期：2015年6月18日；
[0013] 保藏編號(hào)：CGMCC NO. 10893。
[0014] 本發(fā)明的積極有益效果：
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案將為豬流行性腹瀉病毒的分離培養(yǎng)提供一種穩(wěn)定可靠的方法，為 目前豬流行性腹瀉病毒變異毒株所造成的豬流行性腹瀉疾病提供有效的防制手段。 四、
【附圖說(shuō)明】：
[0016] 圖1 :采集腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖；
[0017] 圖1中，M :DL2000 DNA Marker ;1 :CV777細(xì)胞毒；2 :空白對(duì)照；3-7 :采集的腹瀉仔 豬小腸內(nèi)容物。
[0018] 圖2 :間接免疫熒光對(duì)病毒的檢測(cè)圖；
[0019] 圖2中，無(wú)水乙醇固定，3% BSA封閉，一抗為抗PEDV S蛋白的兔多克隆抗體（1:50 稀釋?zhuān)篂镕ITC (異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的羊抗兔IgG (1:500稀釋?zhuān)?；顯示比例200 X。
[0020] 圖3 :透射電鏡對(duì)病毒的檢測(cè)圖。 五、
【具體實(shí)施方式】：
[0021] 實(shí)施例1 :本發(fā)明一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株：
[0022] 本發(fā)明一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株，毒株命名為CH/ZMDZY/11，于2015年6月 18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO. 10893。保藏 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0023] 本發(fā)明一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株的分離培養(yǎng)方法，詳細(xì)步驟為：
[0024] a、病料的采集與處理：
[0025] 采集出現(xiàn)水樣腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物，用IXPBS緩沖液以1 :1的體積比進(jìn)行稀 釋?zhuān)鹗幓旃春笥?000 OXg條件下離心l〇min，取上清，采用0. 22 μπι濾器過(guò)濾除菌，所得處 理液分裝凍存于-70°C，備用。
[0026] b、病料的RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)）檢測(cè)：
[0027] 取步驟a所得處理液200 μ L，采用TRizol法提取RNA ;然后建立 如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5XM-MLV Buffer 4 μ L、dNTP(10mM)l μ L、下游引物 5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3 (25 μ Μ) 1 μ L、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（200U · μ L 3 0· 5 μ L、 RRI (Recombinant RNase Inhibitor) (40U· yL、RNA200ng，DEPC (焦碳酸二乙酯） 水補(bǔ)足20 μ L，混勻后置于PCR儀上，反應(yīng)采用如下程序：42°C處理lh，70°C滅活15min ;
[0028] 反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA用下述引物進(jìn)行PCR，上游引物：5-CTTCCGAGTGT AGTTGAGAT-3，下游引物：5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3，引物定位于PEDV的N基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大 小 629bp，擴(kuò)增采用 50 μ L 反應(yīng)體系：10 XBuffer (含 Mg2+) 5 μ L、dNTP (IOmM) 1 μ L、上下游引 物（25 μ Μ)各 1 μ L、Taq 聚合酶（5U · μ L 3 0· 5 μ L、cDNA 100ng，CldH2O 補(bǔ)足 50 μ L ;PCR 反 應(yīng)條件為：95°(：預(yù)變性51^11;95°(：變性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,30個(gè)循環(huán) ；最后 72°C延伸5min ;同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照（以去離子水為空白對(duì)照）和CV777毒株陽(yáng)性對(duì)照；
[0029] 反應(yīng)結(jié)束后，取IOyL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（結(jié)果詳見(jiàn)附圖 1);檢測(cè)為PCR陽(yáng)性的病料，分別進(jìn)行豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)、豬偽狂犬病毒（PRV)、豬 圓環(huán)病毒2型（PCV2)和豬瘟病毒（CSFV)四種外源病毒的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性的病料進(jìn) 行下一步的病毒分離；
[0030] c、豬流行性腹瀉病毒的分離傳代：
[0031] 6孔板每孔接種I X IO6個(gè)Vero細(xì)胞（ATCC CCL-81)，24h內(nèi)接種步驟a中除菌分 裝凍存的處理液，產(chǎn)物依次進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)? 2-5 4三個(gè)稀釋度各500 μ L接種，接種前棄 去培養(yǎng)液，用PBS液清洗兩遍，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔（采用DMEM培養(yǎng)基為陰性對(duì)照），于 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱吸附Ih后，每孔補(bǔ)加 I. 5mL維持液（維持液中含0. 3%胰蛋白胨磷酸 鹽肉湯、0. 02%酵母提取物和5 μ g/ml胰酶的I XDiffiM培養(yǎng)基），37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 24h后，其中一個(gè)樣品接種稀釋度為5 2的孔出現(xiàn)典型的病變，即細(xì)胞融合、合胞體形成，繼 續(xù)傳代至第10代，仍然出現(xiàn)典型的病變，分離得到一株可穩(wěn)定傳代的PEDV毒株，命名為CH/ ZMDZY/ll〇
[0032] 本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒變異毒株的間接免疫熒光檢測(cè)：
[0033] 6孔板每孔接種I X IO6個(gè)Vero細(xì)胞，24h內(nèi)按感染復(fù)數(shù)0. 1接種上述分離出來(lái)的 病毒，接種前棄去培養(yǎng)基，采用PBS緩沖液清洗兩遍，同時(shí)設(shè)立不接毒的細(xì)胞對(duì)照孔（加入 DMEM培養(yǎng)基）；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱吸附lh，棄上清，每孔加入與上述步驟c中同樣的 維持液，24h后在顯微鏡下觀察，接毒細(xì)胞發(fā)生病變，棄去上清，采用PBS緩沖液洗滌3遍， 用-20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定30min，PBS洗滌3次，然后采用3% BSA封閉lh，棄上清，每 孔加入500 yL的抗PEDV S蛋白的兔多克隆抗體（1:50稀釋?zhuān)?%BSA稀釋?zhuān)?7°C孵育Ih 后，PBS洗滌3次，每次5min ;接著每孔加入500 μ L FITC (異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的羊抗兔 IgG (1:500稀釋?zhuān)?% BSA稀釋?zhuān)?7°C孵育30min后，PBS洗滌3次，每次3min ;倒置熒光顯 微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果顯示：陰性對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有熒光，接毒孔在細(xì)胞病變處均有很亮的熒光， 進(jìn)一步證明本發(fā)明所分離病毒為豬流行性腹瀉病毒，結(jié)果詳見(jiàn)附圖2。
[0034] 本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒變異毒株的電鏡檢測(cè)：
[0035] T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種2 X IO6個(gè)Vero細(xì)胞，24h內(nèi)按感染復(fù)數(shù)0. 1接種病毒，接種 24h后在顯微鏡下觀察，病變達(dá)到80%，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞層，收集到1.5mL EP管中，反復(fù) 凍融3次，10000 X g離心30分鐘，取上清用3 %磷酸鎢負(fù)染，透射電鏡檢測(cè)