技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)和診療急性心肌梗死的標(biāo)記物，進(jìn)一步講是提供了chd9基因作為標(biāo)記物表達(dá)產(chǎn)物和生物制劑在制備急性心肌梗死預(yù)測(cè)和診療藥物中用途，屬于基因診斷和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
：

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟ad）是由環(huán)境因素與遺傳因素共同作用而導(dǎo)致的最常見(jiàn)心血管疾病。已知的危險(xiǎn)因素，如高血壓、血脂異常、血糖升高、吸煙等長(zhǎng)期積累，結(jié)合遺傳背景最終將導(dǎo)致急性心血管事件（如，急性心肌梗死，ami）的發(fā)生，常常危及患者生命。因此，臨床上需要有效的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方法，對(duì)高危人群給予有效識(shí)別，從而更早的干預(yù)，來(lái)降低急性心血管事件的發(fā)生，改善病人預(yù)后。

基因組中編碼的遺傳信息是穩(wěn)定的，大多數(shù)情況下是不可變的。然而研究表明，大約有25000個(gè)基因在rna水平的表達(dá)是高度可變的，可以反應(yīng)機(jī)體短期內(nèi)的生理和病例變化。外周全血或外周單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)的改變已被證實(shí)對(duì)cad有顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值?；虮磉_(dá)分析可以為疾病近期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供新的生物標(biāo)志物。

在現(xiàn)有研究中未見(jiàn)對(duì)chd9與心肌梗死的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑，所述急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑檢測(cè)chd9基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物。進(jìn)一步的，所述的chd9基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物在急性心肌梗死外周血中低表達(dá)。進(jìn)一步的，所述的chd9基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平熒光定量檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的在于所述急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑檢測(cè)chd9基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步的，采用熒光定量試劑盒、基因芯片、酶聯(lián)免疫、抗體雜交方法外周血中基因的表達(dá)檢測(cè)方法和相關(guān)的生物制劑。

本發(fā)明的目的在于所述急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑檢測(cè)chd9基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步的，包含本chd9基因和或表達(dá)產(chǎn)物用于急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷的生物制劑。

本發(fā)明中熒光定量pcr檢測(cè)中使用的引物對(duì)p，其序列如下：

上游引物序列：5’aagtggaatctcaaactgagcc3’；

下游引物序列：5’gatgcgaagtaaactgccgat3’。

本發(fā)明中熒光定量pcr檢測(cè)體系及反應(yīng)條件：

熒光定量pcr反應(yīng)體系：20ul反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無(wú)核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。權(quán)利要求3中所述的熒光定量pcr反應(yīng)條件：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10分鐘；40個(gè)循環(huán)：95℃變性15秒,60℃退火20秒,72℃20延伸秒；溶解曲線和擴(kuò)增曲線95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有樣本至少重復(fù)測(cè)量三次，結(jié)果取均值。

本發(fā)明進(jìn)行的外周血急性心肌梗死差異基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示：在急性心肌梗死病人的外周血白細(xì)胞中存在著大量差異表達(dá)的基因。其中，chd9基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)。發(fā)明人在前期研究成果的基礎(chǔ)之上，通過(guò)擴(kuò)大樣本量，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證chd9基因在急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程中的差異表達(dá)，并分析chd9基因促進(jìn)急性心肌梗死發(fā)病的可能機(jī)制。

本發(fā)明的積極效果在于：

提供了以chd9基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物一種新的急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷治療靶點(diǎn)，利用chd9基因及其表達(dá)產(chǎn)物制備急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)標(biāo)記物和診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用意義和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為外周血rna實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的chd9基因擴(kuò)增曲線；

圖2為溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高；

圖3取10ul擴(kuò)增產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖4在rna水平急性心肌梗死組外周血中chd9基因表達(dá)明顯低于對(duì)照?qǐng)D；

圖5為chd9基因相對(duì)表達(dá)量在急性心肌梗死中的roc曲線。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)例具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型。

本發(fā)明主要采用熒光定量pcr篩選出急性心肌梗死相關(guān)基因，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床病例關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)了是急性心肌梗死診治標(biāo)志物。

病例的收集

依據(jù)2012年公布的心肌梗死全球統(tǒng)一定義。選取2014年11月-2016年3月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療，明確診斷為急性心肌梗死的病人113例為急性心肌梗死組。非冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病者114例為對(duì)照組。并根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)研究對(duì)象的冠狀動(dòng)脈血管病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，分值越高病變?cè)絿?yán)重。

通過(guò)以下試驗(yàn)表明本發(fā)明醫(yī)療效果

一、本發(fā)明醫(yī)療效果的排除標(biāo)準(zhǔn)：

1.因經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（pci）或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（cabg）引發(fā)的心肌梗死。

2.繼發(fā)于供需失衡相關(guān)的心肌損傷：如冠脈內(nèi)皮功能障礙無(wú)明顯冠脈疾病、冠脈痙攣、冠脈栓塞、快速／緩慢型心律失常、嚴(yán)重貧血、重癥呼吸衰竭、主動(dòng)脈夾層或嚴(yán)重主動(dòng)脈瓣疾病、肥厚型心肌病等。

3.非心肌缺血相關(guān)的心肌損傷：心臟挫傷、手術(shù)、消融、起搏、或除顫儀除顫、伴心臟受累的橫紋肌溶解癥、心肌炎、心臟毒性藥物等。

4.多因素或不確定的心肌損傷：嚴(yán)重心力衰竭、應(yīng)激性心肌病、嚴(yán)重肺栓塞或肺動(dòng)脈高壓、敗血癥和危重病人、腎功能衰竭、嚴(yán)重的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血等。

5.合并有嚴(yán)重感染性疾病、惡性腫瘤。

6.正在患有的、慢性的或復(fù)發(fā)性的傳染性疾病史。

7.（活動(dòng)性或潛伏性）結(jié)核感染史或證據(jù)。

8.患有免疫系統(tǒng)疾病和（或）正在服用激素。懷疑或證實(shí)處于免疫缺陷狀態(tài)的患者。

9.臨床資料或者冠脈造影資料不全者。

詳細(xì)記錄臨床資料，包括：用藥史、血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質(zhì)指數(shù)（bmi）、冠狀動(dòng)脈造影資料、冠心病家族史、吸煙史，以及合并其它臨床疾病情況（如高血壓、糖尿?。┑?。

二、急性心肌梗死患者組及對(duì)照組外周血中chd9基因表達(dá)情況：

方法

1.1外周血采集、總rna提取及cdna合成

留取各研究對(duì)象晨起空腹外周靜脈血4ml，利用血液總rna提取試劑盒（rnasimpletotalrnakit，天根生化科技有限公司，北京），依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)已獲取的外周血進(jìn)行總rna提取，并利用1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(jì)（nanodrop2000）對(duì)rna的質(zhì)量及濃度進(jìn)行檢測(cè)。合格的rna樣本a260/a280值在1.9和2.1之間，且a260/a230值大于2。瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)明亮的28s和18srrna條帶，且28srrna條帶亮度約為18srrna的兩倍。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（toyoborevertraaceqprcrtkit，上海），取總量為1ug合格的總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna樣品保存于-20℃以便下一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)

利用sybr熒光定量試劑盒(sybrpremixextaqtm，takara,大連)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。采用20ul反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無(wú)核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。應(yīng)用mx3005p實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)（stratagene）擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃10分鐘；40個(gè)循環(huán)：95℃15秒,60℃20秒,72℃20秒；95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有樣本至少重復(fù)測(cè)量三次，結(jié)果取均值。每個(gè)樣本所得循環(huán)閾值（ct）以相對(duì)表達(dá)量2-△ct表示（△ct=目的基因ct-內(nèi)參基因ct），并進(jìn)行比較。急性心肌梗死組對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量以2-^△△ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，△△ct=急性心肌梗死組△ct-對(duì)照組△ct。所用pcr引物根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)提供的chd9基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為153bp。收集實(shí)時(shí)熒光定量pcr產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。rt-pcr引物序列如下：

chd9

上游引物5’-aagtggaatctcaaactgagcc-3’

下游引物5’-gatgcgaagtaaactgccgat-3’

gapdh

上游引物5’-acggatttggtcgtattgggcg-3’

下游引物5’-ctcctggaagatggtgatgg-3’

三、chd9基因相對(duì)表達(dá)量與急性心肌梗死患者血脂，血糖等性狀的相關(guān)性分析

1.1方法

1.1.1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用spss22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布的采用±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析，不服從正態(tài)分布的采用四分位數(shù)間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異采用卡方檢驗(yàn)分析；急性心肌梗死相關(guān)危險(xiǎn)因素采用二元logistic回歸分析；chd9基因相對(duì)表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白1和gensini評(píng)分的相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以雙側(cè)p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1臨床資料分析

研究對(duì)象的臨床資料分析結(jié)果表明：在年齡、性別、bmi、高血壓病史、冠心病家族史、收縮壓、舒張壓及高密度脂蛋白膽固醇水平（hdl-c）等方面，兩組未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而與對(duì)照組相比，急性心肌梗死組吸煙史比例更高；合并糖尿病情況及空腹血糖水平明顯高于對(duì)照組；血總膽固醇水平（tc）、甘油三酯水平（tg）和低密度脂蛋白膽固醇水平（ldl-c）明顯高于對(duì)照組。差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

外周血rna實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果顯示：chd9基因擴(kuò)增曲線為顯著平滑的“s型”，見(jiàn)圖1。溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高，見(jiàn)圖2。取10ul擴(kuò)增產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3。電泳結(jié)果顯示，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一明亮條帶，片段大小約153bp，與預(yù)期片段大小一致。pcr擴(kuò)增反應(yīng)成功，產(chǎn)物特異性較好。

2.3chd9基因mrna在急性心肌梗死組和對(duì)照組的表達(dá)量

rt-pcr所得每個(gè)樣本的δct值均為單個(gè)樣本重復(fù)3次測(cè)量所得均值。chd9基因的相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)采用2-δδct方法。結(jié)果顯示，急性心肌梗死組2^-△ct為0.03（0.02-0.05），對(duì)照組2^-△ct為0.06（0.04-0.13），兩組差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（z=-7.09，p=0.00）。在rna水平急性心肌梗死組外周血中chd9基因表達(dá)明顯低于對(duì)照組，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.35±0.29倍，見(jiàn)圖4。

2.4采用logistic回歸分析chd9基因相對(duì)表達(dá)量及其它因素與急性心肌梗死的關(guān)系

按chd9基因的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)將所有研究對(duì)象分為高表達(dá)組（2^-△ct>0.044）和低表達(dá)組（2^-△ct≤0.044），進(jìn)一步采用逐步二元logistic回歸分析chd9基因的相對(duì)表達(dá)量、年齡、性別、bmi、冠心病家族史、吸煙史、高血壓、糖尿病、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇等因素與急性心肌梗死的相關(guān)性。結(jié)果顯示：本研究中chd9基因低表達(dá)組急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)為高表達(dá)組的5倍。chd9基因的低表達(dá)和吸煙、空腹血糖增高、血低密度脂蛋白膽固醇水平升高均是急性心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.5chd9基因相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖及血脂等指標(biāo)的關(guān)系

將所有納入的研究對(duì)象分別按空腹血糖水平和血脂水平分為：血糖正常組和血糖升高組、tc正常組和tc升高組、tg正常組和tg升高組、ldl-c正常組和ldl-c升高組。分別比較組間chd9基因的表達(dá)量。每個(gè)研究對(duì)象chd9基因的相對(duì)表達(dá)量以2^-△ct表示。結(jié)果顯示：chd9基因表達(dá)量在血糖正常組與血糖升高組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（z=-2.62，p=0.01）；chd9基因表達(dá)量在tc正常組與tc升高組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；chd9基因表達(dá)量在tg正常組與tg升高組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；chd9基因表達(dá)量在ldl-c正常組與ldl-c升高組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6chd9基因相對(duì)表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性

根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)急性心肌梗死組冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。分值越高代表冠狀動(dòng)脈狹窄越重。急性心肌梗死組gensini評(píng)分結(jié)果為60.00（36.00-88.00），對(duì)chd9基因和gensini分值進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，結(jié)果顯示：chd9基因的相對(duì)表達(dá)量與gensini分值呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.54，p=0.00），即chd9基因的相對(duì)表達(dá)量越低，gensini分值越高，冠狀動(dòng)脈狹窄則越重。

2.7chd9基因的相對(duì)表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白i（tni）的相關(guān)性

急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測(cè)結(jié)果為0.47（0.11-9.60）ng/ml。血清肌鈣蛋白i（tni）濃度的高低反應(yīng)了急性心肌梗死的范圍的大小。血清tni和chd9基因相對(duì)表達(dá)量的雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示：rs=-0.09（p=0.43）。外周血中chd9基因表達(dá)量的高低與血清tni濃度無(wú)關(guān)。這表明chd9的低表達(dá)與心肌梗死的范圍無(wú)關(guān)。

2.8chd9基因相對(duì)表達(dá)量在急性心肌梗死中的roc曲線和cutoff值

根據(jù)急性心肌梗死組和對(duì)照組各樣本實(shí)時(shí)熒光定量pcr所得chd9相對(duì)表達(dá)量2^-△ct值繪制roc曲線，見(jiàn)圖5。從圖5可知chd9基因的相對(duì)表達(dá)量對(duì)急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價(jià)值，曲線下面積（auc）為0.77±0.03（p=0.00），以約登指數(shù)最大值確定的chd9基因相對(duì)表達(dá)量cutoff值為0.032，敏感度為55.8%，特異性為87.7%。

總結(jié)：chd9基因在急性心肌梗死病人外周血中表達(dá)顯著降低，是急性心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；外周血中chd9基因的低表達(dá)反應(yīng)了冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重程度；chd9基因可能是通過(guò)影響血糖代謝，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，最終導(dǎo)致ami的發(fā)生；外周血中chd9基因的低表達(dá)為急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的生物標(biāo)志物，同時(shí)也為急性心肌梗死的治療提供了潛在的靶標(biāo)基因。

<110>吉林大學(xué)

<120>

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>153

<212>mrna

<213>人（homo）

<400>1

aagtggaatctcaaactgagccattcacaggacttgaccccgaggacctccttcaggagg60

gtcttcttcctcactttgatgagtcaacattcggacaagataattcaagtcacattttag120

atcatgaccttgatcggcagtttacttcgcatc153

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aagtggaatctcaaactgagcc22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gatgcgaagtaaactgccgat21