本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法。

背景技術(shù)：

生物被膜又稱生物膜(biofilm)是在生物或非生物介質(zhì)表面由微生物及其胞外基質(zhì)(Extracellular polymeric substance,EPS)形成的致密、復(fù)雜的生物聚集體。EPS作為生物膜的主要組成物質(zhì)，對(duì)保持生物膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性、代謝物質(zhì)傳質(zhì)通道順暢具有重要作用。EPS是細(xì)胞在固體介質(zhì)誘導(dǎo)下自主合成的富含大分子多糖的胞外結(jié)構(gòu)，具有良好的持水性、溶脹性、透過性，能夠穩(wěn)定細(xì)胞表面的水化層、及時(shí)泵出細(xì)胞的反應(yīng)物、為細(xì)胞創(chuàng)造有益的微環(huán)境，可認(rèn)為是生物相容性最佳的固定介質(zhì)。同時(shí)，EPS為細(xì)胞隔離外界毒性物質(zhì)提供了一道天然屏障，因而提高了EPS中微生物細(xì)胞的抗逆能力。因此，細(xì)胞在EPS中能夠大量增殖形成密集的菌群進(jìn)而展示集群效應(yīng)。集群效應(yīng)可使群體成員實(shí)現(xiàn)生理協(xié)同作用，借助個(gè)體間的互相刺激而使個(gè)體的行為、生理、形態(tài)發(fā)生變化，使多個(gè)生物個(gè)體在行為上相互協(xié)作，從而提高整個(gè)種群的代謝及適存能力。

在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，超過80％的慢性感染疾病都與體內(nèi)細(xì)菌形成EPS有關(guān)，而細(xì)菌形成EPS后對(duì)抗生素等殺菌劑和宿主免疫系統(tǒng)的敏感性顯著降低，因此，大部分有關(guān)EPS機(jī)理的研究都集中在如何清除人體器官及外源性生物植入材料表面上的EPS。然而，作為EPS的另一種存在形式——固定化發(fā)酵過程中細(xì)胞形成的EPS卻至今鮮有研究，尤其是固定化細(xì)胞形成EPS后表現(xiàn)出的較高底物耐受性和較快的發(fā)酵效率的機(jī)制機(jī)理到現(xiàn)在還不是很清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種調(diào)控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供利用調(diào)控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法構(gòu)建得到的丙酮丁醇基因工程菌。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供利用上述基因工程菌在EPS催化體系中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種調(diào)控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法，該方法是利用二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)在丙酮丁醇梭菌的Spo0A基因中插入內(nèi)含子序列。在Spo0A基因中插入內(nèi)含子序列，最終使Spo0A基因不能正常表達(dá)，從而引起丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)的合成。

其中，所述的丙酮丁醇梭菌保藏編號(hào)為CGMCC No.5234，該菌株的具體信息在申請(qǐng)?zhí)枮?01210075094.X的中國(guó)專利中詳細(xì)公開。

其中，所述的Spo0A基因?yàn)镃A_C2071，其核苷酸序列如SEQ ID No.：1所示。Spo0A基因編碼一種孢子生成蛋白，在發(fā)育早期通過多組分磷酸化途徑而被激活，是雙組份應(yīng)答性調(diào)節(jié)蛋白大家族的成員之一，調(diào)控并起始孢子形成作用所需基因的轉(zhuǎn)錄。

其中，利用二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)將SEQ ID No.：2所示的內(nèi)含子序列插入Spo0A基因的第242bp和第243bp之間

其中，所述二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)的操作方法如下：

(1)分析SEQ ID No：1所示的序列，得到內(nèi)含子的核苷酸序列和基因的插入位點(diǎn)；

(2)內(nèi)含子序列構(gòu)建到二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌，篩選得到Spo0A基因失活的菌株

其中，所述的所述二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒為PMTL007C-E2質(zhì)粒，該質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

上述調(diào)控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法構(gòu)建得到的丙酮丁醇基因工程菌。

上述丙酮丁醇基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇中的應(yīng)用。

有益效果：

(1)本發(fā)明將丙酮丁醇梭菌B3中Spo0A基因進(jìn)行插入失活后，使得此基因不能正常表達(dá)，獲得CA_C2071基因插入失活的重組菌株。

(2)本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、高效的調(diào)控EPS合成的方法，借助此方法得到的重組菌株對(duì)EPS具有較高的調(diào)控作用，當(dāng)以葡萄糖為碳源，在100ml厭氧瓶中利用載玻片生物膜培養(yǎng)法培養(yǎng)丙丁菌生物膜時(shí)，生物膜厚度為5.81μm，而同等條件培養(yǎng)的出發(fā)菌株生物膜厚度達(dá)到24.6μm。

附圖說明

圖1為本發(fā)明二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒PMTL007C-E2的質(zhì)粒圖譜。

圖2為本發(fā)明使用二型內(nèi)含子插入失活的機(jī)理圖。

圖3為轉(zhuǎn)化子菌落PCR電泳圖，泳道1：出發(fā)菌基因組驗(yàn)證PCR產(chǎn)物(846bp)；泳道2-23為挑取的紅霉素抗性單菌落的菌液作為模板驗(yàn)證PCR產(chǎn)物(2755bp)；泳道M：DNA Marker DL2000。

圖4為自制反應(yīng)器中細(xì)胞固定化材料的填裝方法圖。

圖5為出發(fā)菌與敲除菌EPS宏觀形態(tài)圖。(在不銹鋼反應(yīng)器中，固定化材料與不銹鋼絲網(wǎng)交替纏繞呈圓柱狀，我們定義固定化材料靠近罐壁的一面為正面，另一面為反面反面。)

圖6為CLSM觀察出發(fā)菌與敲除菌EPS形成過程圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：丙酮丁醇梭菌CA_C2071基因失活突變株的構(gòu)建方法。

1、設(shè)計(jì)內(nèi)含子：

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的丙酮丁醇梭菌的CA_C2071基因序列(如SEQ ID No：1所示)，借助軟件設(shè)計(jì)合適的插入基因位點(diǎn)(http://www.clostron.com)，選擇插入在第242-243個(gè)堿基之間，并生成內(nèi)含子序列，合成內(nèi)含子序列S-242其序列如SEQ ID NO：2所示。

2、CA_C2071插入失活載體的構(gòu)建：

用XhoⅠ和BsrGⅠ雙酶切載體PMTL007C-E2，其序列如SEQ ID NO：5所示。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(Takara)化后，與內(nèi)含子序列S-242通過一步克隆(ClonExpress)連接。將一步克隆連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5a(本實(shí)驗(yàn)室)，涂布到含有25ug/ml氯霉素抗性LB平板，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液體含有25ug/ml氯霉素LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12h，提取重組質(zhì)粒(AXYGEN)，測(cè)序驗(yàn)證,獲得CA_C2071插入失活載體PMTL007C-E2-2071。

3、載體PMTL007C-E2-2071甲基化：

由于已經(jīng)證明丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutlicum)ATCC 824中含有限制性內(nèi)切酶Cac824I，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在對(duì)丙酮丁醇梭菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化前對(duì)重組失活載體PMTL007C-E2-2071進(jìn)行甲基化修飾。具體操作步驟為制備E.coli Top 10/pAN2(本實(shí)驗(yàn)室)的化學(xué)感受態(tài)，將測(cè)序成功的失活載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli Top 10，由于pAN2質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性，故涂布到含有25ug/ml氯霉素和10ug/ml四環(huán)素雙抗性LB平板，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液體含有25ug/ml氯霉素和10ug/ml四環(huán)素LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12h，提取甲基化缺失載體(pAN2質(zhì)粒含有一個(gè)枯草芽孢桿菌噬菌體基因，能編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，能實(shí)現(xiàn)外源質(zhì)粒在大腸桿菌中的甲基化)。

4、電轉(zhuǎn)化甲基化的敲除質(zhì)粒至丙酮丁醇梭菌：

厭氧條件下，取2xYTG培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期的C.acetobutylicumB3培養(yǎng)液60ml，4℃、4000rpm離心10min棄去上清，加入足量預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液EPB(270mM蔗糖，5mMNaH₂PO₄，pH7.4)，洗滌兩次，并用2.3mlEPB重懸。然后取570ul加入0.4cm電轉(zhuǎn)杯放置在冰浴中冷卻，并加入20ul甲基化質(zhì)粒，冰浴放置2min。2.0kV電壓，25uF電容進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。隨后將電轉(zhuǎn)液加入到1ml37℃的2xYTG培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)4h，離心收集細(xì)胞100ul并將細(xì)胞涂布于含有20ug/ml甲砜霉素的P2平板中。厭氧培養(yǎng)24-36h后。

5、篩選CA_C2071插入失活突變株：

挑取轉(zhuǎn)化子，使用引物CA_C2071-T-F(其序列如SEQ ID NO：3所示)和CA_C2071-T-R(其序列如SEQ ID NO：4所示)，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，篩選出內(nèi)含子插入基因組的突變株(插入后，PCR擴(kuò)增出基因條帶電泳圖上比野生型大約1Kbp)。將正確插入的突變株傳代三次，同時(shí)涂布在含有紅霉素抗性和紅霉素、甲砜霉素抗性的P2固體培養(yǎng)基上，篩選出敲除質(zhì)粒丟失的突變株(在同時(shí)含紅霉素和甲砜霉素抗性平板上不能生長(zhǎng)的突變株)。

實(shí)施例2：敲除菌與出發(fā)菌分別在2L發(fā)酵罐中固定化發(fā)酵合成胞外聚合物(EPS)的工藝。

平板培養(yǎng)基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，乙酸銨2g/L，氯化鈉3g/L，七水合硫酸鎂3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鉀1g/L，七水合硫酸亞鐵0.1g/L，瓊脂15g/L，其余為水。

種子培養(yǎng)基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，乙酸銨2g/L，氯化鈉3g/L，七水合硫酸鎂3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鉀1g/L，七水合硫酸亞鐵0.1g/L，其余為水。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L，乙酸銨2.2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，氯化鈉0.01g/L，七水合硫酸鎂0.2g/L，七水合硫酸亞鐵0.01g/L，一水合硫酸錳0.01g/L，其余為水。

將實(shí)施例1中構(gòu)建的CA_C2071基因插入失活的丙酮丁醇梭菌重組菌和出發(fā)菌株CGMCC No.5234接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間12h。將平板培養(yǎng)的重組菌接種到種子培養(yǎng)基(不加瓊脂，其他組分同P2平板培養(yǎng)基)中37℃靜止培養(yǎng)12h。

固定化發(fā)酵：吸附固定化細(xì)胞發(fā)酵放大工藝在自制的不銹鋼反應(yīng)器中進(jìn)行。反應(yīng)器柱狀，有效容積約2L，內(nèi)徑10cm，高30cm，外壁有夾套，可通過硅膠管與外置恒溫水浴鍋相連，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵保溫。反應(yīng)器上下兩端和側(cè)面在適當(dāng)位置裝有用于取樣、液體循環(huán)、探頭檢測(cè)的管道和閥門。材料填裝時(shí)，固定化材料CTF與不銹鋼絲網(wǎng)(孔徑約2mm，厚度不足1mm)交替纏繞，松緊適度，如圖4所示，然后置于2L不銹鋼反應(yīng)器中。發(fā)酵液靜止反應(yīng)12h，維持發(fā)酵溫度37℃，通過蠕動(dòng)泵對(duì)反應(yīng)器中的發(fā)酵液進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)流速約20-35mL/min，每12h換一次液，發(fā)酵培養(yǎng)120h。

由圖5可知，出發(fā)菌EPS宏觀形態(tài)為白色粘液狀團(tuán)聚體，其中含有大量孔穴和通道；敲除菌肉眼基本觀察不到EPS。

實(shí)施例3：利用激光共聚焦顯微鏡觀察敲除菌與出發(fā)菌生物膜的結(jié)構(gòu)與厚度。

利用載玻片生物膜培養(yǎng)法培養(yǎng)丙丁菌生物膜，用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的刀豆蛋白A(FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)雙重免疫熒光技術(shù)染色，用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察生物膜結(jié)構(gòu)和其中胞外多糖的分布,并對(duì)生物膜進(jìn)行逐層水平掃描,根據(jù)三維坐標(biāo)系Z軸距離計(jì)算生物膜厚度。

具體操作如下：

(1)生物膜標(biāo)本的制備

在100mL肖特瓶?jī)?nèi)放入25mm×75mm載玻片，裝入50mL發(fā)酵液厭氧靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)6、24和72h后取出載玻片，用0.1M，pH＝7.4PBS緩沖液反復(fù)沖洗,除掉表面浮游菌,無菌濾紙吸干多余液體,用2.5％戊二醛4℃固定玻片1.5h后，懸浮于0.1M，pH＝7.4的PBS緩沖溶液中，待用。

(2)生物膜標(biāo)本的染色

多糖染色：FITC-ConA與生物膜中的多糖結(jié)合發(fā)出綠色熒光。將FITC-ConA配成1mg/mL溶液，呈黃色，樣品4℃避光染色15-30min后，用PBS緩沖液清洗去除殘留染色劑。FITC-ConA激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：488/505nm。

細(xì)胞染色：PI與菌體內(nèi)的DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，只能染死細(xì)胞。樣品4℃避光染色15-30min后，用PBS緩沖液清洗去除殘留染色劑。PI激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為：536/617nm。

(3)CLSM觀察生物膜及厚度測(cè)量

生物膜觀察:采用LSM 510型激光共聚焦掃描顯微鏡,37℃恒溫載物臺(tái),物鏡倒置。掃描模式:HeNe/Ar激光,Ex/Em為490/525nm和536/617nm。

生物膜厚度確定:建立三維坐標(biāo)體系，調(diào)節(jié)聚焦平面位置，對(duì)生物膜標(biāo)本由外(生物膜游離面)向內(nèi)(生物膜與玻片相貼面)逐層水平掃描,掃描30層，并進(jìn)行3D圖像重建，則第一張與最后一張能觀察到生物膜的掃描圖片間的Z軸距離為生物膜厚度。

由圖6可知，在初始黏附期，出發(fā)菌株生物膜中多糖含量較多，而細(xì)菌含量相比較少，多糖形成多處較大的積聚區(qū)域，但相互之間的聯(lián)系并不緊密，細(xì)菌形成較小團(tuán)塊，形如細(xì)菌鑲嵌于多糖基質(zhì)中；而敲除菌中細(xì)菌大部分成散落分布，大部分區(qū)域細(xì)菌和多糖關(guān)系并不密切。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，出發(fā)菌株生物膜中細(xì)菌大量繁殖，細(xì)菌和多糖的關(guān)聯(lián)開始緊密，已開始形成多糖和細(xì)菌相互包裹的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；而敲除菌中菌落間的細(xì)菌分布厚薄不均，形成溝壑間隙。在成熟穩(wěn)定期，出發(fā)菌株多糖染色明顯多于細(xì)菌染色，細(xì)菌鑲嵌在由大量多糖形成的基質(zhì)中，結(jié)構(gòu)緊密，形成菌囊樣的結(jié)構(gòu)，生物膜厚度為24.6μm；而敲除菌中細(xì)菌和多糖的關(guān)聯(lián)依舊并不緊密，生物膜厚度為5.81μm。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工業(yè)大學(xué)

<120> 一種調(diào)控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法

<130> SG20181008001

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 846

<212> DNA

<213> CA_C2071基因核苷酸序列

<400> 1

atggaaagta gaaaaataag tgttttaatt gcagatgata ataaggaatt ttgtaatatt 60

cttaatgatt acttgcttaa ccaaagcgat atgatagttg ttggaatagc aaaggatgga 120

gtggaagctt taaagcttat agagaataaa aagcctgacc ttgttgttct cgatataata 180

atgccaagat tagatggact aggagtatta gaaaaactta acaataaaga tgcagaaaac 240

cttccaagaa taatagtttt atccgctgtt ggacaggata aaataacaca aagagctata 300

acattagggg cggactacta tgtagttaaa ccttttgata tggatgtatt cactaataga 360

ataagagaaa tgtttaataa tactatatca aattcagagc agaaaaggtc atatcaagtt 420

gaagagaaag aggcaagctt tgcaggtaca attgcaaatg atgtttactc tgataatata 480

ggtaataaag cggttgattt agaaagcgaa attacatcaa taatacatca aataggtgtt 540

ccagcacata taaaaggtta tatgtattta agggaagcta taacaatggt agttaataat 600

atggagcttt tatcagcagt tactaaggaa ttatatcctt ctattgcaaa aaaatacaat 660

actacagcta gcagagtaga aagagcaata agacatgcta ttgaagttgc atggtcacgt 720

ggacaggttg aaactataaa taagttattt ggatatacta tcaacaatgg caaaggtaaa 780

cctactaata gtgaatttat tgctatgatt gctgacaagc taagacttaa aaataaagtt 840

agctaa 846

<210> 2

<211> 309

<212> DNA

<213> 內(nèi)含子核苷酸序列

<400> 2

ttatccttaa ttatccttgg agtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt agtttaaggt 60

actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa agctgatacg 120

ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta cgactgagtc 180

gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt tctaatttcg 240

gttataatcc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg taagttactt 300

ccaaggact 309

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CA_C2071-T-F

<400> 3

ggaaagtaga aaaataagtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CA_C2071-T-R

<400> 4

cagcaatcat agcaataaat 20

<210> 5

<211> 8925

<212> DNA

<213> PMTL007C-E2質(zhì)粒核苷酸序列

<400> 5

cctgcagggt gtagtagcct gtgaaataag taaggaaaaa aaagaagtaa gtgttatata 60

tgatgattat tttgtagatg tagataggat aatagaatcc atagaaaata taggttatac 120

agttatataa aaattacttt aaaaattaat aaaaacatgg taaaatataa atcgtataaa 180

gttgtgtaat ttttaagctt gagctcataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 240

gattacggat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 300

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 360

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gctaataaag 420

atcttgtaca atctgtagga gaacctatgg gaacgaaacg aaagcgatgc cgagaatctg 480

aatttaccaa gacttaacac taactgggga taccctaaac aagaatgcct aatagaaagg 540

aggaaaaagg ctatagcact agagcttgaa aatcttgcaa gggtacggag tactcgtagt 600

agtctgagaa gggtaacgcc ctttacatgg caaaggggta cagttattgt gtactaaaat 660

taaaaattga ttagggagga aaacctcaaa atgaaaccaa caatggcaat tttagaaaga 720

atcagtaaaa attcacaaga aaatatagac gaagttttta caagacttta tcgttatctt 780

ttacgtccag atatttatta cgtggcgacg cgtgaagttc ctatactttc tagagaatag 840

gaacttcgcg actcatagaa ttatttcctc ccgttaaata atagataact attaaaaata 900

gacaatactt gctcataagt aacggtactt aaattgttta ctttggcgtg tttcattgct 960

tgatgaaact gatttttagt aaacagttga cgatattctc gattgaccca ttttgaaaca 1020

aagtacgtat atagcttcca atatttatct ggaacatctg tggtatggcg ggtaagtttt 1080

attaagacac tgtttacttt tggtttagga tgaaagcatt ccgctggcag cttaagcaat 1140

tgctgaatcg agacttgagt gtgcaagagc aaccctagtg ttcggtgaat atccaaggta 1200

cgcttgtaga atccttcttc aacaatcaga tagatgtcag acgcatggct ttcaaaaacc 1260

acttttttaa taatttgtgt gcttaaatgg taaggaatac tcccaacaat tttatacctc 1320

tgtttgttag ggaattgaaa ctgtagaata tcttggtgaa ttaaagtgac acgagtattc 1380

agttttaatt tttctgacga taagttgaat agatgactgt ctaattcaat agacgttacc 1440

tgtttactta ttttagccag tttcgtcgtt aaatgccctt tacctgttcc aatttcgtaa 1500

acggtatcgg tttcttttaa attcaattgt tttattattt ggttgagtac tttttcactc 1560

gttaaaaagt tttgagaata ttttatattt ttgttcatac cagcaccaga agcaccagca 1620

tctcttgggt taattgaggc ctgagtataa ggtgacttat acttgtaatc tatctaaacg 1680

gggaacctct ctagtagaca atcccgtgct aaattgtagg actgcccttt aataaatact 1740

tctatattta aagaggtatt tatgaaaagc ggaatttatc agattaaaaa tactttctct 1800

agagaaaatt tcgtctggat tagttactta tcgtgtaaaa tctgataaat ggaattggtt 1860

ctacataaat gcctaacgac tatccctttg gggagtaggg tcaagtgact cgaaacgata 1920

gacaacttgc tttaacaagt tggagatata gtctgctctg catggtgaca tgcagctgga 1980

tataattccg gggtaagatt aacgacctta tctgaacata atgccatatg aatccctcct 2040

aatttatacg ttttctctaa caacttaatt atacccacta ttattatttt tatcaatata 2100

gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcacgcgt tgggaaatgg caatgatagc 2160

gaaacaacgt aaaactcttg ttgtatgctt tcattgtcat cgtcacgtga ttcataaaca 2220

caagtgaatg tcgacagtga atttttacga acgaacaata acagagccgt atactccgag 2280

aggggtacgt acggttcccg aagagggtgg tgcaaaccag tcacagtaat gtgaacaagg 2340

cggtacctcc ctacttcacc atatcatttt ctgcagcccc ctagaaataa ttttgtttaa 2400

ctttaagaag gagatataca tatatggcta gatcgtccat tccgacagca tcgccagtca 2460

ctatggcgtg ctgctagcgc tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcactc gtagtagtct 2520

gagaagggta acgcccttta catggcaaag gggtacagtt attgtgtact aaaattaaaa 2580

attgattagg gaggaaaacc tcaaaatgaa accaacaatg gcaattttag aaagaatcag 2640

taaaaattca caagaaaata tagacgaagt ttttacaaga ctttatcgtt atcttttacg 2700

tccagatatt tattacgtgg cgtatcaaaa tttatattcc aataaaggag cttccacaaa 2760

aggaatatta gatgatacag cggatggctt tagtgaagaa aaaataaaaa agattattca 2820

atctttaaaa gacggaactt actatcctca acctgtacga agaatgtata ttgcaaaaaa 2880

gaattctaaa aagatgagac ctttaggaat tccaactttc acagataaat tgatccaaga 2940

agctgtgaga ataattcttg aatctatcta tgaaccggta ttcgaagatg tgtctcacgg 3000

ttttagacct caacgaagct gtcacacagc tttgaaaaca atcaaaagag agtttggcgg 3060

cgcaagatgg tttgtggagg gagatataaa aggctgcttc gataatatag accacgttac 3120

actcattgga ctcatcaatc ttaaaatcaa agatatgaaa atgagccaat tgatttataa 3180

atttctaaaa gcaggttatc tggaaaactg gcagtatcac aaaacttaca gcggaacacc 3240

tcaaggtgga attctatctc ctcttttggc caacatctat cttcatgaat tggataagtt 3300

tgttttacaa ctcaaaatga agtttgaccg agaaagtcca gaaagaataa cacctgaata 3360

tcgggagctc cacaatgaga taaaaagaat ttctcaccgt ctcaagaagt tggagggtga 3420

agaaaaagct aaagttcttt tagaatatca agaaaaacgt aaaagattac ccacactccc 3480

ctgtacctca cagacaaata aagtattgaa atacgtccgg tatgcggacg acttcattat 3540

ctctgttaaa ggaagcaaag aggactgtca atggataaaa gaacaattaa aactttttat 3600

tcataacaag ctaaaaatgg aattgagtga agaaaaaaca ctcatcacac atagcagtca 3660

acccgctcgt tttctgggat atgatatacg agtaaggaga tctggaacga taaaacgatc 3720

tggtaaagtc aaaaagagaa cactcaatgg gagtgtagaa ctccttattc ctcttcaaga 3780

caaaattcgt caatttattt ttgacaagaa aatagctatc caaaagaaag atagctcatg 3840

gtttccagtt cacaggaaat atcttattcg ttcaacagac ttagaaatca tcacaattta 3900

taattctgaa ctccgcggga tttgtaatta ctacggtcta gcaagtaatt ttaaccagct 3960

caattatttt gcttatctta tggaatacag ctgtctaaaa acgatagcct ccaaacataa 4020

gggaacactt tcaaaaacca tttccatgtt taaagatgga agtggttcgt gggggatccc 4080

gtatgagata aagcaaggta agcagcgccg ttattttgca aattttagtg aatgtaaatc 4140

cccttatcaa tttacggatg agataagtca agctcctgta ttgtatggct atgcccggaa 4200

tactcttgaa aacaggttaa aagctaaatg ttgtgaatta tgtgggacgt ctgatgaaaa 4260

tacttcctat gaaattcacc atgtcaataa ggtcaaaaat cttaaaggca aagaaaaatg 4320

ggaaatggca atgatagcga aacaacgtaa aactcttgtt gtatgctttc attgtcatcg 4380

tcacgtgatt cataaacaca agtgaatgtc gagcacccgt tctcggagca ctgtccgacc 4440

gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga 4500

tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatcg ccaagccgcc gatggtagtg tggggtctcc 4560

ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact 4620

gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc 4680

cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc 4740

cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt 4800

ttctacaaac tcttcctgtc gtcatatcta caagccatcc ccccacagat acgggcgcgc 4860

cgccattatt tttttgaaca attgacaatt catttcttat tttttattaa gtgatagtca 4920

aaaggcataa cagtgctgaa tagaaagaaa tttacagaaa agaaaattat agaatttagt 4980

atgattaatt atactcattt atgaatgttt aattgaatac aaaaaaaaat acttgttatg 5040

tattcaatta cgggttaaaa tatagacaag ttgaaaaatt taataaaaaa ataagtcctc 5100

agctcttata tattaagcta ccaacttagt atataagcca aaacttaaat gtgctaccaa 5160

cacatcaagc cgttagagaa ctctatctat agcaatattt caaatgtacc gacatacaag 5220

agaaacatta actatatata ttcaatttat gagattatct taacagatat aaatgtaaat 5280

tgcaataagt aagatttaga agtttatagc ctttgtgtat tggaagcagt acgcaaaggc 5340

ttttttattt gataaaaatt agaagtatat ttattttttc ataattaatt tatgaaaatg 5400

aaagggggtg agcaaagtga cagaggaaag cagtatctta tcaaataaca aggtattagc 5460

aatatcatta ttgactttag cagtaaacat tatgactttt atagtgcttg tagctaagta 5520

gtacgaaagg gggagcttta aaaagctcct tggaatacat agaattcata aattaattta 5580

tgaaaagaag ggcgtatatg aaaacttgta aaaattgcaa agagtttatt aaagatactg 5640

aaatatgcaa aatacattcg ttgatgattc atgataaaac agtagcaacc tattgcagta 5700

aatacaatga gtcaagatgt ttacataaag ggaaagtcca atgtattaat tgttcaaaga 5760

tgaaccgata tggatggtgt gccataaaaa tgagatgttt tacagaggaa gaacagaaaa 5820

aagaacgtac atgcattaaa tattatgcaa ggagctttaa aaaagctcat gtaaagaaga 5880

gtaaaaagaa aaaataattt atttattaat ttaatattga gagtgccgac acagtatgca 5940

ctaaaaaata tatctgtggt gtagtgagcc gatacaaaag gatagtcact cgcattttca 6000

taatacatct tatgttatga ttatgtgtcg gtgggacttc acgacgaaaa cccacaataa 6060

aaaaagagtt cggggtaggg ttaagcatag ttgaggcaac taaacaatca agctaggata 6120

tgcagtagca gaccgtaagg tcgttgttta ggtgtgttgt aatacatacg ctattaagat 6180

gtaaaaatac ggataccaat gaagggaaaa gtataatttt tggatgtagt ttgtttgttc 6240

atctatgggc aaactacgtc caaagccgtt tccaaatctg ctaaaaagta tatcctttct 6300

aaaatcaaag tcaagtatga aatcataaat aaagtttaat tttgaagtta ttatgatatt 6360

atgtttttct attaaaataa attaagtata tagaatagtt taataatagt atatacttaa 6420

tgtgataagt gtctgacagt gtcacagaaa ggatgattgt tatggattat aagcggccgg 6480

ccagtgggca agttgaaaaa ttcacaaaaa tgtggtataa tatctttgtt cattagagcg 6540

ataaacttga atttgagagg gaacttagat ggtatttgaa aaaattgata aaaatagttg 6600

gaacagaaaa gagtattttg accactactt tgcaagtgta ccttgtacct acagcatgac 6660

cgttaaagtg gatatcacac aaataaagga aaagggaatg aaactatatc ctgcaatgct 6720

ttattatatt gcaatgattg taaaccgcca ttcagagttt aggacggcaa tcaatcaaga 6780

tggtgaattg gggatatatg atgagatgat accaagctat acaatatttc acaatgatac 6840

tgaaacattt tccagccttt ggactgagtg taagtctgac tttaaatcat ttttagcaga 6900

ttatgaaagt gatacgcaac ggtatggaaa caatcataga atggaaggaa agccaaatgc 6960

tccggaaaac atttttaatg tatctatgat accgtggtca accttcgatg gctttaatct 7020

gaatttgcag aaaggatatg attatttgat tcctattttt actatgggga aatattataa 7080

agaagataac aaaattatac ttcctttggc aattcaagtt catcacgcag tatgtgacgg 7140

atttcacatt tgccgttttg taaacgaatt gcaggaattg ataaatagtt aacttcaggt 7200

ttgtctgtaa ctaaaaacaa gtatttaagc aaaaacatcg tagaaatacg gtgttttttg 7260

ttaccctaag tttaaactcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 7320

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 7380

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 7440

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 7500

gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 7560

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 7620

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 7680

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 7740

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 7800

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 7860

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 7920

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 7980

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 8040

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 8100

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcagggcccc 8160

ctgcttcggg gtcattatag cgattttttc ggtatatcca tcctttttcg cacgatatac 8220

aggattttgc caaagggttc gtgtagactt tccttggtgt atccaacggc gtcagccggg 8280

caggataggt gaagtaggcc cacccgcgag cgggtgttcc ttcttcactg tcccttattc 8340

gcacctggcg gtgctcaacg ggaatcctgc tctgcgaggc tggccggcta ccgccggcgt 8400

aacagatgag ggcaagcgga tggctgatga aaccaagcca accaggaagg gcagcccacc 8460

tatcaaggtg tactgccttc cagacgaacg aagagcgatt gaggaaaagg cggcggcggc 8520

cggcatgagc ctgtcggcct acctgctggc cgtcggccag ggctacaaaa tcacgggcgt 8580

cgtggactat gagcacgtcc gcgagctggc ccgcatcaat ggcgacctgg gccgcctggg 8640

cggcctgctg aaactctggc tcaccgacga cccgcgcacg gcgcggttcg gtgatgccac 8700

gatcctcgcc ctgctggcga agatcgaaga gaagcaggac gagcttggca aggtcatgat 8760

gggcgtggtc cgcccgaggg cagagccatg acttttttag ccgctaaaac ggccgggggg 8820

tgcgcgtgat tgccaagcac gtccccatgc gctccatcaa gaagagcgac ttcgcggagc 8880

tggtgaagta catcaccgac gagcaaggca agaccgatcg ggccc 8925