本發(fā)明涉及一種模擬潮汐與培養(yǎng)條件梯度變化的comammox選擇性富集培養(yǎng)裝置和方法。

背景技術：

硝化過程長期以來被認為必須要分兩步進行，由原先的氨氧化細菌與亞硝酸鹽氧化細菌的組合到最近的氨氧化細菌/古菌與亞硝酸鹽氧化細菌的組合來完成整個硝化過程(et al.,2005)。盡管人們通過反應活化能的分析推測，單個微生物從氨氮到硝氮的全程硝化所獲得的能量比其中的任意一步都大，理論上采用這一過程的全程硝化菌(complete ammonia oxidizer,comammox)比氨氧化細菌/古菌及亞硝酸鹽氧化細菌更加具有競爭優(yōu)勢(Costa et al.,2006)，但是由于生長緩慢、原位富集程度低等原因，人們直到2015年才證實了comammox的存在，并認為comammox傾向于緩慢、基質(zhì)輸入受限的生長，生物量聚集在微生物絮體或生物膜的某一空間部位(Daims et al.,2015；van Kessel et al.,2015)。

目前已經(jīng)富集的三株comammox都是Nitrospira屬(Daims et al.,2015；van Kessel et al.,2015)，在海洋環(huán)境中Nitrospira屬在海水和沉積物中都有檢出(Watson et al.,1986；Taylor et al.,2007)。通過對NCBI nr數(shù)據(jù)庫的搜索，在海洋沉積物宏基因組中檢測到了Nitrospira-like amoA，推測comammox在海洋環(huán)境中存在(van Kessel et al.,2015)。這是獲得海洋comammox的接種物的基本依據(jù)。

Comammox的發(fā)現(xiàn)進一步豐富了氮循環(huán)的內(nèi)容，comammox在生物地球化學循環(huán)中的作用亟待研究，獲得comammox的富集物或純培物成為研究的一個瓶頸。為獲得海洋中的comammox，有必要設計模擬原位海洋環(huán)境的富集裝置和培養(yǎng)條件，來選擇性富集comammox。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種富集來自海洋的comammox，提供富集所需的培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法。所采用的具體技術方案如下:

海洋comammox富集培養(yǎng)裝置，包括圓柱形罐體、控溫夾套、恒溫水浴鍋、控溫夾套進水口、控溫夾套出水口、培養(yǎng)基供應桶、反應器進水管、液位傳感器、反應器出水管和廢液桶；培養(yǎng)基供應桶通過反應器進水管連接圓柱形罐體的內(nèi)腔；圓柱形罐體的內(nèi)腔還通過反應器出水管連接廢液桶；反應器進水管和反應器出水管均夾持于不同的蠕動泵中；液位傳感器設置于圓柱形罐體內(nèi)腔中，且高于反應器出水管末端高度；圓柱形罐體外壁上套有中空的控溫夾套，控溫夾套上設有控溫夾套進水口和控溫夾套出水口，控溫夾套出水口、恒溫水浴鍋和控溫夾套進水口通過管路連接形成循環(huán)回路。

作為優(yōu)選，還設有控制裝置，控制裝置分別連接液位傳感器以及反應器進水管、反應器出水管上的蠕動泵。

作為優(yōu)選，所述的控溫夾套進水口設置于圓柱形罐體底部，所述的控溫夾套出水口設置于圓柱形罐體頂部。

作為優(yōu)選，所述的反應器出水管末端距離圓柱形罐體內(nèi)腔底部的高度為10～20cm。將接種物在反應器內(nèi)的高度設定為10cm的依據(jù)是氨氮在沉積物中的擴散能力，經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，氨氮在沉積物中24h內(nèi)能夠擴散的深度小于4cm，因此氨氮從最大值到0的梯度變化范圍能在10cm范圍內(nèi)全部體現(xiàn)?？紤]到長期運行氨氮可能會進一步向深層擴散，因此設定沉積物的深度在10-20cm，從而實現(xiàn)氨氮從最大值到0的梯度變化，而其中總有一層適合comammox生長。

作為優(yōu)選，所述的液位傳感器高于反應器出水管末端5～10cm。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述裝置的海洋comammox富集培養(yǎng)方法，步驟如下：

向圓柱形罐體內(nèi)加入含有comammox菌種的海洋潮間帶沉積物后形成10～20cm的接種物沉淀區(qū)，接種物沉淀區(qū)高度與反應器出水管末端平齊；配置培養(yǎng)基并經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后冷卻，儲備到培養(yǎng)基供應桶，由控制柜控制蠕動泵進行抽液，經(jīng)過反應器進水管供應到培養(yǎng)基進水排水區(qū)；當培養(yǎng)基進水排水區(qū)的液面達到液位傳感器的位置時，控制柜控制進水的蠕動泵停止工作，啟動出水的蠕動泵將培養(yǎng)基進水排水區(qū)內(nèi)的液體經(jīng)過反應器出水管排出到廢液桶；然后不斷在進水和出水之間切換循環(huán)，模擬海洋的潮汐變化；富集培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的水溫度保持在20℃±0.1℃。恒溫保持在20℃附近是為了將培養(yǎng)溫度設定在海洋的四季溫度變化范圍內(nèi)。

作為優(yōu)選，進水時間和出水時間均持續(xù)12h，保持與常規(guī)的潮汐時間對應。

作為優(yōu)選，培養(yǎng)基中以氨氮為氮源和能源，添加抗生素萬古霉素和枯草桿菌抗生素，以人工海水來維持細胞滲透壓和其它離子需求。

本發(fā)明填補了海洋comammox富集裝置的空白，提供了一種簡易的原位模擬海洋comammox富集裝置，操作簡單，可以定向選擇富集comammox。

附圖說明

圖1是海洋comammox富集培養(yǎng)裝置示意圖。

圖中：圓柱形罐體1、接種物沉淀區(qū)2、培養(yǎng)基進水排水區(qū)3、控溫夾套4、恒溫水浴鍋5、控溫夾套進水口6、控溫夾套出水口7、控制柜8、培養(yǎng)基供應桶9、反應器進水管10、反應器出水管12、廢液桶13。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步闡述。

如圖1所示，一種海洋comammox富集培養(yǎng)裝置，包括圓柱形罐體1、控溫夾套4、恒溫水浴鍋5、控溫夾套進水口6、控溫夾套出水口7、控制裝置8、培養(yǎng)基供應桶9、反應器進水管10、液位傳感器11、反應器出水管12和廢液桶13。培養(yǎng)基供應桶9通過反應器進水管10連接圓柱形罐體1的內(nèi)腔。圓柱形罐體1的內(nèi)腔還通過反應器出水管12連接廢液桶13。反應器進水管10和反應器出水管12均夾持于不同的蠕動泵中，培養(yǎng)基供應桶9中事先存儲配制好的培養(yǎng)基，當需要進水時，反應器進水管10上的蠕動泵開始工作，將培養(yǎng)基輸送至培養(yǎng)基供應桶9中；當需要出水時，反應器出水管12上的蠕動泵開始工作，培養(yǎng)基供應桶9中的水重新抽取至廢液桶13中。液位傳感器11設置于圓柱形罐體1內(nèi)腔中，且高于反應器出水管12末端高度?？刂蒲b置8分別連接液位傳感器11以及反應器進水管10、反應器出水管12上的蠕動泵，根據(jù)液位傳感器11的感應信號，反饋控制兩個蠕動泵的運行狀態(tài)。控制裝置8可以采用控制柜或者單片機、PLC等，當采用控制柜時，可以將兩個蠕動泵集成于控制柜中。

圓柱形罐體1內(nèi)填充海洋潮間帶沉積物后，開始進水，當液位升高至液位傳感器11所處位置時，停止進水并啟動出水。由此，圓柱形罐體1形成接種物沉淀區(qū)2和培養(yǎng)基進水排水區(qū)3。且為了模擬潮間帶的潮汐水位變化，可以在一天內(nèi)設置進水和出水的來回切換，較佳的是進水時間和出水時間均持續(xù)12h。而且由于接種物沉淀區(qū)2存在一定的高度，培養(yǎng)基中的氮源在12小時內(nèi)不能擴散到最深處，從而形成一個從最高濃度到0的氨氮濃度梯度，使接種物沉淀區(qū)2中必然存在一個適合comammox菌生長的區(qū)域。

另外，comammox菌對于生長溫度有要求，因此可以在圓柱形罐體1外壁上套有中空的控溫夾套4。控溫夾套4可以直接采用中空結(jié)構(gòu)，其內(nèi)壁與圓柱形罐體1接觸一側(cè)采用導熱材料，也可以直接與圓柱形罐體1一體成型，兩者之間預留出用于通水的空腔?？販貖A套4上設有控溫夾套進水口6和控溫夾套出水口7，控溫夾套出水口7、恒溫水浴鍋5和控溫夾套進水口6通過管路連接形成循環(huán)回路?？販貖A套進水口6設置于圓柱形罐體1底部，所述的控溫夾套出水口7設置于圓柱形罐體1頂部。反應器出水管12末端距離圓柱形罐體1內(nèi)腔底部的高度為10～20cm。液位傳感器11高于反應器出水管12末端5～10cm。

利用上述裝置的海洋comammox富集培養(yǎng)方法，步驟如下：

向圓柱形罐體1內(nèi)加入含有comammox菌種的海洋潮間帶沉積物后形成10～20cm的接種物沉淀區(qū)2，接種物沉淀區(qū)2高度與反應器出水管12末端平齊。配置好的培養(yǎng)基經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后冷卻，儲備到培養(yǎng)基供應桶9，由控制柜8控制蠕動泵進行抽液，經(jīng)過反應器進水管10供應到培養(yǎng)基進水排水區(qū)3；當培養(yǎng)基進水排水區(qū)3的液面達到液位傳感器11的位置時，控制柜8控制進水的蠕動泵停止工作，啟動出水的蠕動泵將培養(yǎng)基進水排水區(qū)3內(nèi)的液體經(jīng)過反應器出水管12排出到廢液桶13；然后不斷在進水和出水之間切換循環(huán)，模擬海洋的潮汐變化；富集培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的水溫度保持在20℃±0.1℃。

另外，初始時調(diào)試進水蠕動泵流量使12h內(nèi)反應器內(nèi)液位從0(以接種物沉淀區(qū)2上表面開始計)達到液位傳感器11，并使出水蠕動泵流量略大于進水蠕動泵流量，使出水時間保持在11-12h。當培養(yǎng)基進水排水區(qū)3液位達到液位傳感器11觸發(fā)進水蠕動泵停止12h后，控制裝置8內(nèi)的控制電路重新啟動進水蠕動泵并停止出水蠕動泵的運行。由此，能夠保證反應器在長期運行過程中模擬海洋潮汐變化過程并防止由于每個進出水周期下進水略多于出水而導致反應器積水或進出水時長紊亂。

培養(yǎng)基可以根據(jù)實際需要進行配置。本發(fā)明中提供一種優(yōu)選的配置，具體為以氨氮為氮源和能源，并添加抗生素萬古霉素(50mg l^-1)和枯草桿菌抗生素(50mg l^-1)，以人工海水來維持細胞滲透壓和其它離子需求。培養(yǎng)基的具體培養(yǎng)如下：NH₄Cl,53.5mg l^-1；NaHCO₃,100mg l^-1；NaCl,26g l^-1；MgCl₂·6H₂O,3g l^-1；MgSO₄·7H₂O,3g l^-1；CaCl₂,0.5g l^-1；KBr,0.2g l^-1；Na₂HPO₄,0.05g l^-1；微量元素Ⅰ,1ml l^-1；微量元素Ⅱ,1ml l^-1；用NaOH溶液調(diào)pH到7.0-7.2；

該培養(yǎng)基設定較低的氨氮濃度(相對于氨氧化細菌而言)，使comammox更具有競爭優(yōu)勢。同時，添加的兩種抗生素對雜菌具有一定的去除作用，有利于加強comammox的定向選擇。