本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種穩(wěn)定敲除MSTN基因的細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

在哺乳動物中，MSTN主要在骨骼肌中表達(dá)，并且在生長時期和成熟期的骨骼肌中均有表達(dá)。在豬胚胎期21～35d可以檢測到MSTN mRNA分子，在49d該基因表達(dá)水平明顯提高，妊娠105d時開始降低，出生后2周達(dá)到最低水平，在生長期豬的骨骼肌、心肌和乳腺中一直有表達(dá)。

Taylor WE等于2001年研究檢測了重組MSTN對鼠骨骼肌細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組MSTN蛋白可抑制細(xì)胞的增生、DNA的合成以及蛋白質(zhì)的合成，從而抑制肌肉的生長。Rios等將編碼鼠MSTN cDNA重組體瞬時轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞，有效地抑制了細(xì)胞的增殖，并發(fā)現(xiàn)MSTN蛋白可能具有上調(diào)細(xì)胞周期依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶抑制因子的作用。Joulia通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSTN基因在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)減少了分化過程中G0/G1期細(xì)胞的數(shù)目，另外還檢測到P21和P53蛋白表達(dá)有所提高。Thomas M通過向培養(yǎng)基中添加MSTN蛋白，進(jìn)一步證明隨著該種蛋白濃度的增加，對C2C12成肌細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，MSTN可抑制成肌細(xì)胞從C1期向S期的轉(zhuǎn)化，并且Western雜交結(jié)果表明MSTN可以影響與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，如可以促進(jìn)P21的表達(dá)、降低Cdk2的表達(dá)。

Wayne E研究表明，MSTN基因抑制C2C12細(xì)胞增生可能是通過該基因作用于TGF家族的其他成員，如絲氨酸-蘇氨酸激酶家族的特異受體。這種對細(xì)胞增生的抑制作用可以通過除去MSTN而解除，對C2C12的抑制作用比對中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)更加明顯，提供了MSTN基因優(yōu)先作用于骨骼肌的證據(jù)。

Lee SJ發(fā)現(xiàn)純化的C-末端二聚體復(fù)合物能夠作用于激活素(ACT II)受體，MSTN可與Act RIIB連接，ACT是多功能的生長因子，有促進(jìn)細(xì)胞系分化，誘導(dǎo)胚胎中胚層發(fā)育及維持神經(jīng)存活、誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡等作用，其生物學(xué)活性與TGF-β有相似之處。另外，高濃度的MSTN蛋白前體還可與卵泡抑素(FS)相結(jié)合，而Fs通過與ACT結(jié)合起作用。也有研究認(rèn)為MSTN可與卵泡抑素相關(guān)基因(FLRG)直接作用，二者結(jié)合的復(fù)合物是血液循環(huán)中的MSTN蛋白存在的一種主要形式，F(xiàn)LRG可抑制MSTN的活性。通過這條途徑，MSTN基因可抑制肌肉的生長，但是各種因子相互作用的具體途徑還有待進(jìn)一步研究。研究還發(fā)現(xiàn)，MSTN基因與肌源性決定基因(MyoD)的功能相關(guān)。超表達(dá)的內(nèi)源性MSTN可降低MyoD蛋白水平并誘導(dǎo)其磷酸化模式的改變，在成肌細(xì)胞分化周期中MyoD表達(dá)發(fā)生變化：在細(xì)胞周期的C1期MSTN啟動子的活性相對較高，此時MyoD表達(dá)水平最大，認(rèn)為MSTN可能是MyoD的下游靶基因，MyoD可以通過調(diào)控MSTN基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期。

總之，目前認(rèn)為MSTN基因可以影響到多種與生長分化有關(guān)的蛋白質(zhì)或生長因子的作用，失活MSTN基因可以解除MSTN對肌肉生長的抑制作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于失活MSTN基因可以解除MSTN對肌肉生長的抑制作用，本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定敲除MSTN的細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究并不懈努力，最終獲得了如下技術(shù)方案：一種穩(wěn)定敲除MSTN基因的細(xì)胞系，包括真核表達(dá)載體，所述的真核表達(dá)載體含有用于敲除MSTN基因的序列。

在本發(fā)明最優(yōu)選的實施例中，所述用于敲除MSTN基因的序列為表達(dá)sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R組成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。

在本發(fā)明最優(yōu)選的實施例中，所述的細(xì)胞系為豬腎細(xì)胞PK15細(xì)胞系。

在本發(fā)明最優(yōu)選的實施例中，所述的真核載體為pX330質(zhì)粒。

在本發(fā)明最優(yōu)選的實施例中，所述用于敲除MSTN基因(用于表達(dá)sgRNA)的DNA序列插入到所述pX330質(zhì)粒經(jīng)過Bbs Ⅰ酶切形成的粘性末端之間。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種穩(wěn)定敲除MSTN基因的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)計sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R組成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示，逆轉(zhuǎn)錄得到表達(dá)sgRNA的序列；

(2)利用表達(dá)sgRNA的序列構(gòu)建包括用于敲除MSTN基因的真核表達(dá)載體；

(3)將所述用于敲除MSTN基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞中，得到所述穩(wěn)定敲除MSTN基因的PK15細(xì)胞系。

在本發(fā)明構(gòu)建方法最優(yōu)選的一個實施例中，所述用于敲除MSTN基因的序列為表達(dá)sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R組成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。在本發(fā)明構(gòu)建方法最優(yōu)選的一個實施例中，所述細(xì)胞系為PK15細(xì)胞系。

在本發(fā)明構(gòu)建方法最優(yōu)選的一個實施例中，所述真核載體為pX330質(zhì)粒。

在本發(fā)明構(gòu)建方法最優(yōu)選的一個實施例中，所述用于敲除MSTN基因(用于表達(dá)sgRNA)的DNA序列插入到所述pX330質(zhì)粒經(jīng)過Bbs Ⅰ酶切形成的粘性末端之間。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一對特異識別MSTN基因的sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R組成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。

本發(fā)明的第四個目的在于一對DNA分子，由編碼權(quán)利要求7中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和編碼權(quán)利要求7中的所述sgRNA-R的DNA分子乙組成。優(yōu)選地，所述的一對DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子甲如序列表的序列4所示，所述的DNA分子乙如序列表的序列5或序列6所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過在PK15細(xì)胞基因組中刪除了MSTN基因的第三外顯子序列中1063～1082的204bp堿基序列，構(gòu)建了穩(wěn)定敲除MSTN基因的細(xì)胞系，不僅在體外成功模擬了MSTN的表達(dá)狀態(tài)，為研究MSTN基因在肌肉發(fā)育中作用提供了模型，而且也為MSTN的功能研究提供了幫助。

附圖說明

圖1為原始的pX330質(zhì)粒的圖譜；

圖2為穩(wěn)定敲除MSTN的細(xì)胞系的構(gòu)建方法的流程圖；

圖3為western檢測PK15穩(wěn)定敲除MSTN基因細(xì)胞系蛋白表達(dá)量的結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明構(gòu)建的細(xì)胞模型在明場和熒光下的觀察結(jié)果圖；

圖5為載體測試以及試驗載體的線性化結(jié)果圖；

圖6為細(xì)胞基因組與供體DNA之間連接的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；

圖7為構(gòu)建的Cas9/sgRNA表達(dá)載經(jīng)PstnI內(nèi)切酶消化后的電泳圖譜；

圖8為供體DNA經(jīng)內(nèi)切酶Nsi I和Xho I消化后的電泳圖譜。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)，不受下面公開的具體實施的限制。

以下實施例中用到的試劑和儀器：pX330載體購自Biovector。oligo dT、各種限制性內(nèi)切酶和Taq酶均購自北京Invitrogen公司。T4DNA連接酶購自NEB公司。膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。質(zhì)粒少量抽提試劑盒購自Roche公司。質(zhì)粒大量抽提試劑盒購自TIANGEN公司。DMEM1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自HyClone公司；采用電轉(zhuǎn)染的方法，電轉(zhuǎn)染試劑購自Sigma公司；PK15細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。熒光倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品。

如圖1所示，用于敲除MSTN基因表達(dá)sgRNA的DNA序列插入所述pX330質(zhì)粒粒經(jīng)過Bbs Ⅰ酶切形成的粘性末端之間。

如圖2所示的上述穩(wěn)定敲除MSTN的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將用于敲除MSTN基因的表達(dá)sgRNA的DNA序列序列插入到Bbs I酶切質(zhì)粒所形成的的粘性末端之間，得到包括用于敲除MSTN表達(dá)的真核表達(dá)載體。得到的包括用于敲除MSTN表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體可以通過PCR酶切后，跑DNA電泳鑒定。

實施例1：sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及活性驗證

表達(dá)sgRNA的雙鏈DNA(退火產(chǎn)物)合成：NEB Buffer3(10×)，20μL體系。取單鏈的Cas9/sgRNA-MSTN-F和Cas9/sgRNA-MSTN-R核酸片段各10pmol退火形成雙鏈。退火條件95℃，5min關(guān)閉PCR儀讓其自然冷卻2h。

Cas9/sgRNA表達(dá)載體合成：Bbs Ⅰ酶切pX330質(zhì)粒載體將其線性化，凝膠回收線性化載體。退火產(chǎn)物和線性化載體體積比1:1，混合于試劑Solution Ⅰ環(huán)化載體。

供體DNA合成：引物Cas9-T3-LF和Cas9-T2-LR擴(kuò)增打靶載體555bp左同源臂；引物Cas9-T2-RF和Cas9-T2-RR擴(kuò)增423bp的右同源臂，左、右同源臂亞克隆于HRX-2MCS載體。合成的供體DNA含有正篩選標(biāo)記Neo、EGFP，負(fù)篩選標(biāo)記DesRed。

表1引物設(shè)計

Cas-S引物測序表明在特異的位點含有sgRNA序列，PstnI內(nèi)切酶消化后形成了一條帶為100000bp(見圖7)，與測序結(jié)果一致，證明Cas9/sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。

供體DNA含有正篩選標(biāo)記Neo基因和EGFP基因，負(fù)篩選標(biāo)記DesRed，圖中箭頭代表載體序列方向；一旦MSTN打靶位點雙鏈斷裂產(chǎn)生，供體DNA轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞可實現(xiàn)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組，從而在MSTN基因外顯子3上實現(xiàn)長度為204bp序列的特異性敲除。合成的供體DNA總長為9167bp，內(nèi)切酶Nsi I和Xho I消化供體DNA，被消化的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離形成了大小不同的2條帶(見圖8)。其帶型大小與測序分析結(jié)果一致，一條短鏈2395bp，一條長鏈為6772bp。證明構(gòu)建的Cas9/sgRNA表達(dá)載體有活性。

實施例2：確定篩選培養(yǎng)基中合適濃度的G418濃度

G418的配制：配制1M Hepes：23.8g HEPES粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH調(diào)節(jié)PH至7.3，過濾除菌，4℃保存，終濃度為1mol/L。

制備篩選培養(yǎng)基：用培養(yǎng)基將G418稀釋為300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1100μg/mL、1200μg/mL。24孔板，每孔1mL培養(yǎng)基(含有G418的完全培養(yǎng)基)，每個濃度4個重復(fù)，則每次換液需各個濃度培養(yǎng)基4mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長狀態(tài)，鋪24孔板(20000/孔)，12h換液，加篩選培養(yǎng)基。

確定G418最佳篩選濃度：將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天換液一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)。試驗中所確定的最佳篩選濃度為600μg/mL。

實施例3：電轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞及抗性細(xì)胞克隆的篩選

接種PK15細(xì)胞至6孔板，用含10％胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至密度約為70～80％時可用于轉(zhuǎn)染。將電轉(zhuǎn)試劑及質(zhì)粒溶液平衡至室溫，在離心管內(nèi)準(zhǔn)備下列混合液：50μL電轉(zhuǎn)液、2.5μg質(zhì)粒，用該溶液重懸細(xì)胞?；靹蚝笥?00μL的移液槍將細(xì)胞懸液加入1mm電擊杯中，放入電擊槽。電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)定：電壓170V，脈沖為1pulse，時間為3ms。給電擊的細(xì)胞更換新的培養(yǎng)基后將混合液加入9cm標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿，搖勻。靜置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12h移除培養(yǎng)基，更換為新鮮的含有10％胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24小時后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。在換液一兩次后(換液后培養(yǎng)過夜)，細(xì)胞達(dá)50％-80％時，吸出所有培養(yǎng)液，離心3000-4000rpm，吸上清0.22μm過濾，加入2倍體積的新鮮的最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4℃?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)6天左右細(xì)胞大量死亡時，可以換用適應(yīng)性培養(yǎng)基?；蛘呖梢栽黾友鍧舛扰囵B(yǎng)，例如原來用10％血清，此時則可以采用20％血清。培養(yǎng)10天后將G418濃度減半，維持篩選壓力。篩選約14天后可見有抗性克隆出現(xiàn)。挑單克隆:高倍鏡下標(biāo)記陽性克隆，套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽性克隆，將其轉(zhuǎn)入多孔板培養(yǎng)。G418濃度為800μg/mL篩選大約25d，借助倒置熒光顯微鏡(Leica 4000B，Gemany)篩選陽性細(xì)胞克隆。

單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA,RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)，同時western檢測目的基因表達(dá)。RT-PCR檢測結(jié)果和western檢測目的基因的結(jié)果如圖3所示，其中：(A)在MSTN第3外顯子，PK15只有野生型，PK3108含有野生型和包含標(biāo)記基因兩種，L18含有包含標(biāo)記基因和204bp缺失這兩種(沒有標(biāo)志以及一側(cè)的Loxp)。泳道M是1kb的marker(TaKaRa)，泳道1是空白對照，泳道2是PK15細(xì)胞基因組，泳道3是PK3108細(xì)胞基因組，泳道4是pTurbo-Cre，泳道5是PK3108-2細(xì)胞基因組，泳道6是供體供體DNA，泳道7是L18細(xì)胞基因組。(B)Western blot檢測PK3108、L18、PK15以及對照組細(xì)胞系中MSTN的表達(dá)。MSTN敲除后與對照相比，表達(dá)量明顯降低。說明我們轉(zhuǎn)入的sgRNA已經(jīng)切開PK15細(xì)胞基因組并使MSTN基因失活。由圖3可見，MSTN的蛋白表達(dá)量比正常細(xì)胞明顯降低，說明目的基因已切開PK15細(xì)胞基因組并使MSTN基因失活。

實施例4：PK15MSTN knock-out穩(wěn)定細(xì)胞系蛋白表達(dá)量的檢測

本實施例中使用三鷹公司的兔抗鼠MSTN蛋白C端多肽特異性抗體以及山羊抗鼠IgG抗體。

將正常的PK15細(xì)胞與我們所構(gòu)建的穩(wěn)定敲除MSTN(MSTN knock-out)的PK15細(xì)胞系同時收樣做蛋白檢測。首先，去除培養(yǎng)基后加入4℃PBS將細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下來放入15m1離心管中，2000轉(zhuǎn)5min離心，去除上清，再每管加入1m1 4℃PBS把細(xì)胞沉淀吹勻后轉(zhuǎn)移到1.5m1EP管內(nèi)再次離心并去上清。接著開始裂解細(xì)胞，將RAPA強(qiáng)裂解液與蛋白酶抑制劑，100:1的比例混合后加到細(xì)胞沉淀中，4℃搖晃裂解1h后，4℃14000轉(zhuǎn)離心，取上清即樣品。最后測樣品蛋白濃度，并加入Loading buffer煮沸8min，再調(diào)平上樣量用SDS-聚丙烯凝膠電泳跑膠。電泳3小時，轉(zhuǎn)膜2小時，之后抗體孵育，一抗2小時，二抗1小時，顯色曝光。

實施例5：目的細(xì)胞的篩選:

將正常的PK15細(xì)胞與我們所構(gòu)建的穩(wěn)定敲除MSTN(MSTN knock-out)的PK15細(xì)胞系同時培養(yǎng)，正常的PK15細(xì)胞貼壁生長，與MSTN敲除的PK15細(xì)胞形態(tài)差異不明顯。

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，使用G418濃度為800μg/ml的10％胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得抗性克隆。在含G418的培養(yǎng)液中，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞死亡。將獲得的抗性細(xì)胞混合克隆，再用G418進(jìn)行系列稀釋、鑒定、選擇后得到單克隆抗性細(xì)胞株，用10％胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)。

圖4為本發(fā)明構(gòu)建的細(xì)胞模型在明場和熒光下的觀察結(jié)果；左上、下為明場下觀察的細(xì)胞圖片，中上、下為綠色熒光下觀察的細(xì)胞圖片，右上、下為紅色熒光下觀察的細(xì)胞圖片。只有中下這個有綠色熒光的激發(fā)，說明基因敲除成功。

圖5為載體測試以及試驗載體的線性化結(jié)果圖，其中：(A)MSTN第3外顯子的Cas9/sgRNA體外表達(dá)載體構(gòu)建。序列結(jié)果顯示sgRNA正確的插入所設(shè)計的PX330載體的位點里面。(B)M泳道是1kb大小的Takara marker，泳道1是空白對照，泳道2是環(huán)狀Cas9/sgRNA表達(dá)載體，泳道3是用Kpn Ⅰ酶切的線性化的Cas9/sgRNA表達(dá)載體。(C)pTurbo-Cre的長度是5894bp，EcoR Ⅰ酶切線性化后的兩個片段大小分別是4794bp和1100bp，這將在體外表達(dá)刪除兩邊增加相同的Loxp序列的標(biāo)記基因。泳道M是1kb大小的Takara marker，泳道1是空白對照，泳道2是環(huán)狀pTurbo-Cre載體，泳道3是EcoR Ⅰ酶切的線性化的pTurbo-Cre載體。(D)供體DNA包含陽性標(biāo)志Neo/EGFP陰性標(biāo)志DesRed。供體DNA長度是8583bp，Nsi Ⅰ和Xho Ⅰ線性化后的兩個片段大小分別是6578bp和2005bp。泳道M是1kb大小的Takara marker，泳道1是空白對照，泳道2是環(huán)狀供體DNA，泳道3是用Nsi Ⅰ和Xho Ⅰ酶切的線性化的供體DNA。

圖6細(xì)胞基因組與供體DNA之間連接的PCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中：(A)上游接頭：泳道M是DL5000marker，泳道1是空白對照，泳道2是PK15細(xì)胞基因組，泳道3是PK3108細(xì)胞基因組，泳道4是pTurbo-Cre，泳道5是PK3108-2細(xì)胞基因組，泳道6是供體供體DNA，泳道7是L18細(xì)胞基因組。(B)下游接頭：泳道M是DL5000marker，泳道1是空白對照，泳道2是PK15細(xì)胞基因組，泳道3是PK3108細(xì)胞基因組，泳道4是pTurbo-Cre，泳道5是PK3108-2細(xì)胞基因組，泳道6是供體供體DNA，泳道7是L18細(xì)胞基因組。

本研究首次成功構(gòu)建穩(wěn)定敲除MSTN(MSTN knock-out)的PK15細(xì)胞系，通過失活MSTN基因，以明顯降低MSTN的蛋白表達(dá)量。該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立，不僅成功在體外模擬了骨骼肌細(xì)胞MSTN的表達(dá)狀態(tài)，為研究MSTN基因在肌肉發(fā)育中的作用提供了模型，而且也為MSTN的功能的研究提供了幫助。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> MSTN雙敲細(xì)胞系及其構(gòu)建方法

<160> 6

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcuguguaa ugcauguaug ugg 23

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggauuuugaa gcuuuuggau ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcaaagaac aaauaauaua ugg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctgtgtaa tgcatgtatg tgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggattttgaa gcttttggat ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcaaagaac aaataatata tgg 23