一種牙鲆精巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海水魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體說是一種牙鲆精巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)建與培養(yǎng)動物細(xì)胞系早已成為研宄內(nèi)分泌學(xué)、毒理學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤治療的有力工具。截至目前已有近280余株不同的魚類細(xì)胞系相繼建立起來，而海水魚類及咸水魚類的細(xì)胞系僅有約100株，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足其在生理學(xué)、病毒學(xué)、毒理學(xué)、腫瘤及基因工程等多個領(lǐng)域的應(yīng)用需求。
[0003]牙鮮(Paralichthys olivaceus)，屬硬骨魚綱、福鰭亞綱、鱗形目、鱗亞目、牙鮮科、牙鲆屬。其肉質(zhì)鮮嫩，是重要的海水增養(yǎng)殖魚類之一。與大多數(shù)鲆鰈魚相似，雌性魚個體比相應(yīng)的雄性個體大的特性使得全雌養(yǎng)殖倍受重視。牙鲆的性染色體屬于XX-XY型，至今未找到性染色體和性別決定基因(Fujiwara等，2007)，其性別表型的形成是由遺傳和環(huán)境因子協(xié)同作用而致(GSD+TSD，Luckenbach等，2009)。有關(guān)牙鮮性別分化分子生物學(xué)的研宄，目前國內(nèi)外學(xué)者研宄多注重于性別相關(guān)基因的克隆和表達(dá)譜分析，缺乏深入地探討。其中，牙鲆性腺來源細(xì)胞系的缺乏，限制了其性別相關(guān)基因的功能研宄以及性別表達(dá)調(diào)控機(jī)制的揭示。同時，近年來，隨著環(huán)境污染日益加劇和養(yǎng)殖業(yè)過度膨脹，病害問題造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，極大影響了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此，伴隨著性別控制和病害防治研宄的深入，體外分離培養(yǎng)牙鲆細(xì)胞的應(yīng)用意義日益凸顯。但是，迄今為止，國內(nèi)外僅有牙鲆鰭條細(xì)胞系(中國海洋大學(xué)，童裳亮，Aquaculture，1997，156:327-333)、胚胎細(xì)胞系(中國水產(chǎn)研宄院黃海水產(chǎn)研宄所，陳松林，Diseases of Aquatic Organisms, 2004，60:241-246)、腎臟細(xì)胞系(中國水產(chǎn)研宄院黃海水產(chǎn)研宄所，王娜，Journal of Fish Diseases, 2011，34:81-85)和申請人所在實(shí)驗室建立的腦細(xì)胞系、肌衛(wèi)星細(xì)胞系等5個細(xì)胞系，未見有該魚種性腺組織細(xì)胞系建立的報道。因此，體外培養(yǎng)的精巢細(xì)胞將成為研宄牙鲆性別相關(guān)基因功能、性別分化及病害防治的重要研宄平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)操作簡便的牙鲆精巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0006]一種牙鲆精巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法:
[0007](I)原代培養(yǎng):取健康雄魚精巢于DF12培養(yǎng)基(含400U/mL青霉素，^Oyg/mL鏈霉素)中，PBS清洗后將精巢組織充分剪碎，并加入胰蛋白酶消化，而后用細(xì)胞培養(yǎng)液充分懸浮，離心收集沉淀，向沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液使其懸浮，25±0.2°C培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)；次日，待組織塊完成貼壁后小心補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0008](2)傳代培養(yǎng):待原代培養(yǎng)組織塊周圍細(xì)胞迀出、增殖至形成巢式細(xì)胞暈時，加入0.25%胰蛋白酶消化懸起細(xì)胞，利用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行原瓶初次傳代培養(yǎng)，待原瓶傳代細(xì)胞長滿瓶底后，以1:1-1:2 (v/v)分瓶傳代，以后7-10d傳代一次；傳至10代后將細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清含量減為細(xì)胞培養(yǎng)液總體積的10%，目前，該細(xì)胞已經(jīng)傳至40余代(42-47代)，細(xì)胞系建立成功；
[0009]所述細(xì)胞培養(yǎng)液為在DF12培養(yǎng)液中加入占細(xì)胞培養(yǎng)液總體積20 %的胎牛血清，10ng/ml重組人喊性成纖維細(xì)胞生長因子(Recombinant Human FGFb，bFGF)，15ng/ml重組人表皮生長因子(Recombinant Human EGF，EGF)，pH 值為 7.2-7.4，100U/mL 青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，4°C存放，備用。
[0010]步驟(I)中清洗后精巢組織剪成糜狀。
[0011]在步驟(I)中精巢組織剪成糜狀后，加入0.25(wt)%胰蛋白酶消化lOmin。
[0012]在步驟(I)培養(yǎng)中的精巢組織外植體小塊經(jīng)短暫消化和離心收集后，先用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后在培養(yǎng)箱中正置過夜培養(yǎng)，待組織塊貼壁，第二天再補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0013]在步驟(2)中，細(xì)胞初次傳代時將吸出的舊培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入一備用離心管內(nèi)，待細(xì)胞消化完成后在新鮮培養(yǎng)液中加入備用離心管內(nèi)的舊培養(yǎng)液制備l:l(v/v)比例細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代。
[0014]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0015]采用本發(fā)明方法構(gòu)建的牙鲆精巢細(xì)胞系可以進(jìn)行連續(xù)傳代，目前已傳40余代，能提供大量的牙鲆精巢細(xì)胞，細(xì)胞生長溫度為25°C，細(xì)胞形態(tài)為成纖維樣，生長曲線正常，染色體眾數(shù)為正常的48條，也檢測到雄性相關(guān)基因dmrtl的表達(dá)，可以應(yīng)用于性別分化和病理學(xué)研宄；而且，以PEGFP-N3進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗，觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，證實(shí)牙鲆精巢細(xì)胞系可以直接應(yīng)用于外源基因功能研宄。
【附圖說明】
[0016]圖1A、圖1B為本發(fā)明實(shí)施例提供的相差顯微鏡下傳代培養(yǎng)的牙鲆精巢細(xì)胞系圖，其中A為牙鲆精巢細(xì)胞原代培養(yǎng)第13天圖(100X) ;B為牙鲆精巢細(xì)胞第25代圖(100X)。
[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的牙鲆精巢細(xì)胞系第27代的生長曲線圖。
[0018]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的牙鲆精巢細(xì)胞系的第31代染色體中期分裂相(200X) ο
[0019]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的dmrtl基因?qū)ρ栗r精巢細(xì)胞分子鑒定圖。其中M為天根公司DS?2000Marker ；A為dmrtl ;B為以ddW代替cDNA作為模板的陰性對照。
[0020]圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的牙鲆精巢細(xì)胞系轉(zhuǎn)染PEGFP-N3后的熒光顯微圖片(100X) ο
【具體實(shí)施方式】
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[0021]本發(fā)明建立了魚類精巢細(xì)胞的分離及離體培養(yǎng)體系，操作方法簡單，重復(fù)性強(qiáng)，較之前報道的其他魚類的精巢細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法更容易掌握和操作，應(yīng)用價值極大，為進(jìn)一步的實(shí)驗研宄提供了材料和技術(shù)支持。
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例詳述本發(fā)明的構(gòu)建、鑒定和應(yīng)用方法。
[0023]實(shí)施例1
[0024]牙鲆精巢細(xì)胞系的建立方法，步驟如下:
[0025]I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液:取Hyclone公司DF12培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入占細(xì)胞培養(yǎng)液總體積20%的胎牛血清，lOng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Recombinant HumanFGFb, bFGF)，15ng/ml 重組人表皮生長因子(Recombinant Human EGF, EGF)，100U/mL 青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，pH值為7.2，4°C存放，備用。
[0026]2)原代培養(yǎng):無菌條件下取體重為347.5g健康牙鲆的精巢組織，置于添加了400U/mL青霉素和400 μ g/mL鏈霉素的4mL Hyclone公司DF12培養(yǎng)液的無菌玻璃平皿中浸泡5min后，吸棄培養(yǎng)液，用2mL PBS (pH 7.2)沖洗精巢組織兩次，吸出PBS，將精巢組織剪成糜狀小塊，加入ImL 0.25%胰蛋白酶消化lOmin，再加入3mL上述步驟I)細(xì)胞培養(yǎng)液充分懸浮，2200g快速離心2min，吸棄上清，向組織小塊沉淀中加入ImL上述步驟I)細(xì)胞培養(yǎng)液用槍輕輕吸打懸浮后接種于25cm2培養(yǎng)瓶，于25±0.2°C培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)。次日，待組織塊完成貼壁后小心補(bǔ)加ImL細(xì)胞培養(yǎng)液，然后每隔4d半量更換培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液一次。
[0027]3)傳代培養(yǎng):待步驟2)原代培養(yǎng)細(xì)胞不斷從組織塊周圍迀出并快速增殖，當(dāng)組織塊周圍細(xì)胞暈形成并停止生長后，將舊的培養(yǎng)液移入一備用無菌離心管內(nèi)，用PBS(pH 7.2)沖洗細(xì)胞I次，吸棄PBSjpA ImL的0.25%胰蛋白酶液消化。顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續(xù)在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞消化完全，在原瓶中加入新鮮培養(yǎng)液與舊的培養(yǎng)液按照1:1 (v/v)比例混合得到的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后進(jìn)行傳代。在后續(xù)繼代培養(yǎng)期間，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入2mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吸打使細(xì)胞懸浮，按1:l(v/v)的比例進(jìn)行分瓶傳代；根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，約7-10d傳代一次；傳至10代后，進(jìn)行1:1-1:2(v/v)分瓶傳代，每3-5d傳代一次，進(jìn)而細(xì)胞系建立成功。目前，該細(xì)胞已經(jīng)傳至42代。細(xì)胞已能穩(wěn)定增殖，細(xì)胞系命名為P0TC。該細(xì)胞系主要細(xì)胞類型為成纖維樣細(xì)胞(如圖認(rèn)3所示)。
[0028]實(shí)施例2
[0029]牙鲆精巢細(xì)胞系的鑒定和應(yīng)用
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