一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于植物組織和細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]良好的植物懸浮細(xì)胞系不僅是體細(xì)胞胚大量同步發(fā)生的最佳材料，也是許多作物原生質(zhì)體的主要來(lái)源，酶解后細(xì)胞壁被講解的僅由質(zhì)膜包圍的裸露單細(xì)胞可以作為外源基因?qū)氲闹苯邮荏w，還可進(jìn)行種間甚至是屬間的體細(xì)胞雜交，從而創(chuàng)造新的種質(zhì)資源。此夕卜，植物懸浮細(xì)胞還可用來(lái)制造人工種子，篩選突變體以及生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)等。因此，如何建立良好的植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系是非常有實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的研究課題。
[0003]不同物種及同一物種不同品種其懸浮細(xì)胞系建立的難易程度存在很大差異。目前在巴西橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis Mull.Arg.，以下簡(jiǎn)稱橡膠樹(shù))中僅有少數(shù)幾個(gè)品種成功建立了穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系并用于后續(xù)的科學(xué)研究。然而目前橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系建立的方法均是從花藥或內(nèi)珠被固體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)篩選出易碎胚性愈傷組織后，再轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在這一階段仍需經(jīng)過(guò)多次繼代篩選培養(yǎng)才最終獲得穩(wěn)定分散的懸浮細(xì)胞系，從外植體的起始培養(yǎng)到細(xì)胞懸浮系的最終建立需花費(fèi)6-10個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，相當(dāng)耗時(shí)費(fèi)力。前期的實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，亦非常不利于后續(xù)試驗(yàn)材料的獲取，從而限制了某些有價(jià)值的科學(xué)研究的開(kāi)展。此外，懸浮細(xì)胞系在建立后隨著繼代次數(shù)的增加，分化能力逐漸下降甚至消失，細(xì)胞系的變異風(fēng)險(xiǎn)增大。也就是說(shuō)，懸浮細(xì)胞系建立后并非就一勞永逸，繼代培養(yǎng)一段時(shí)間后仍需從起始材料重新建立新的具有良好分化能力的細(xì)胞系。因此，探尋一種快速穩(wěn)定且適用于橡膠樹(shù)多個(gè)品種的懸浮細(xì)胞系建立的方法，可有效解決上述問(wèn)題，且為批量體細(xì)胞胚同步誘導(dǎo)再生植株，或進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交，以及利用原生質(zhì)體為受體進(jìn)行外源基因的直接轉(zhuǎn)化等技術(shù)體系快速提供良好的材料來(lái)源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單易行且快速建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法，包括材料的選取和消毒、懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程、繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程。具體步驟如下:
[0006](I)材料的選取和消毒:在早上九點(diǎn)前摘取橡膠樹(shù)單核靠邊期未成熟雄花蕾，先用75%酒精對(duì)花蕾進(jìn)行表面消毒50?70秒，再用0.1%的氯化汞消毒8?12分鐘，無(wú)菌水漂洗3?5次后用滅菌金屬網(wǎng)收集花蕾，置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中。
[0007](2)懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程:在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖針完整剝出上述消毒花蕾中的花藥，將50?100?；ㄋ幗臃N于含15?30ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于80?10rpm搖床上，溫度為26?28°C條件下暗培養(yǎng)30?40天，期間更換I?2次液體培養(yǎng)基。
[0008]所述液體培養(yǎng)基的成分為:改良的MS基本培養(yǎng)基、0.1?Img.L—M-BAj.2?2mg.IZ1NAAa-Smg.L—hd-D'0.l — l.0mg.L—1TDZj.I?5mg.IZ1AgNO3WO ?80ml.L—1 椰子水和40?50g.L—1鹿糖。
[0009]MS的改良成分為:MgS04.7H20 550mg.L—\KH2PO442Omg.L—\CaCl226Omg.L-\MnSO4.H2O 30mg.L—\CuSO4.5H20 0.25mg.L^10
[0010](3)繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程:在花藥懸浮培養(yǎng)長(zhǎng)出愈傷組織后每5-7天用與步驟(2)相同的液體培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)I次，并篩除老化和褐化的組織，持續(xù)繼代培養(yǎng)20?30天游離出小細(xì)胞團(tuán)后，吸取適量的小細(xì)胞團(tuán)按細(xì)胞團(tuán)體積占液體培養(yǎng)基體積3%_6%的比例添加新的液體培養(yǎng)基繼續(xù)繼代培養(yǎng)I?3次，即獲得穩(wěn)定分散的懸浮細(xì)胞系。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0012](I)本發(fā)明提供的快速建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法簡(jiǎn)單易行、耗時(shí)短，極大降低了生產(chǎn)成本，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且普遍適用于國(guó)內(nèi)多個(gè)重要栽培品種。
[0013](2)本發(fā)明提供的快速建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法可為批量體細(xì)胞胚同步誘導(dǎo)再生植株，或進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交，以及利用原生質(zhì)體為受體進(jìn)行外源基因的直接轉(zhuǎn)化等技術(shù)體系快速提供良好的材料來(lái)源。
[0014](3)本發(fā)明采用直接懸浮培養(yǎng)的方法一步到位建立生長(zhǎng)迅速、分散均勻的懸浮細(xì)胞系，為利用生物技術(shù)育種方式進(jìn)行橡膠樹(shù)品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新開(kāi)拓了新的便利途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
[0016]本發(fā)明一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法實(shí)施時(shí)，步驟如下:
[0017](I)材料的選取和消毒是在早上九點(diǎn)前摘取橡膠樹(shù)單核靠邊期未成熟雄花蕾，先用75%酒精對(duì)花蕾進(jìn)行表面消毒60秒，再用0.1%的氯化汞消毒10分鐘，無(wú)菌水漂洗4次后用滅菌金屬網(wǎng)收集花蕾，置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中。
[0018](2)懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程是在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖針完整剝出上述滅菌花蕾中的花藥，將60?；ㄋ幗臃N于含15ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于90rpm搖床上，溫度為27°C條件下暗培養(yǎng)30天，期間更換I次液體培養(yǎng)基。
[0019]所述液體培養(yǎng)基的成分為:改良的MS基本培養(yǎng)基、0.5mg.L—M-BA、I.2mg.L—1NAAUJmg.1^2,4~?>,OAmg.IZ1TDZJmg.!/1AgNO3JOml.L—1 椰子水和45g.L—1 蔗糖。
[0020]MS的改良成分為:MgS04.7H20 550mg.L—\KH2PO442Omg.L—\CaCl226Omg.L-\MnSO4.H2O 30mg.L—\CuSO4.5H20 0.25mg.L^10
[0021](3)繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程是在花藥懸浮培養(yǎng)長(zhǎng)出愈傷組織后每6天用與步驟(2)相同的液體培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)I次，并篩除老化和褐化的組織，持續(xù)繼代培養(yǎng)4次游離出小細(xì)胞團(tuán)后，吸取適量的小細(xì)胞團(tuán)按細(xì)胞團(tuán)占液體體積3 %的比例添加新的液體培養(yǎng)基繼續(xù)繼代培養(yǎng)2次，即獲得穩(wěn)定分散的懸浮細(xì)胞系。
實(shí)施例2
[0022]本發(fā)明一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法實(shí)施時(shí)，步驟如下:
[0023](I)材料的選取和消毒是在早上九點(diǎn)前摘取橡膠樹(shù)單核靠邊期未成熟雄花蕾，先用75%酒精對(duì)花蕾進(jìn)行表面消毒50秒，再用0.1%的氯化汞消毒12分鐘，無(wú)菌水漂洗4次后用滅菌金屬網(wǎng)收集花蕾，置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中。
[0024](2)懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程是在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖針完整剝出上述滅菌花蕾中的花藥，將80?；ㄋ幗臃N于含20ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于90rpm搖床上，溫度為27°C條件下暗培養(yǎng)30天，期間更換I次液體培養(yǎng)基。
[0025]所述液體培養(yǎng)基的成分為:改良的MS基本培養(yǎng)基、0.5mg.L—M-BA、1.2mg.L—1NAAdJmg.L—hj-D'0.emg.IZ1TDZdmg.!/1AgNO3JOml.L—1 椰子水和45g.L—1 蔗糖。
[0026]MS的改良成分為:MgS04.7H20 550mg.L—\KH2PO442Omg.L—\CaCl226Omg.L-\MnSO4-H2O 30mg.L—\CuSO4.5H20 0.25mg.L—、
[0027](3)繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程是在花藥懸浮培養(yǎng)長(zhǎng)出愈傷組織后每6天用與步驟(2)相同的液體培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)I次，并篩除老化和褐化的組織，持續(xù)繼代培養(yǎng)4次游離出小細(xì)胞團(tuán)后，吸取適量的小細(xì)胞團(tuán)按細(xì)胞團(tuán)占液體體積5 %的比例添加新的液體培養(yǎng)基繼續(xù)繼代培養(yǎng)2次，即獲得穩(wěn)定分散的懸浮細(xì)胞系。
[0028]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法，其特征在于包括材料的選取和消毒、懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程和繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程;步驟如下: (1)材料的選取和消毒:選取橡膠樹(shù)單核靠邊期未成熟雄花蕾為起始材料，并采用75%酒精和0.1 %氯化汞常規(guī)二次消毒的方法對(duì)其進(jìn)行表面消毒； (2)懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程:在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖針完整剝出上述消毒花蕾中的花藥，將50?100粒花藥接種于含15?30ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于80?10rpm搖床上，溫度為26?28°C條件下暗培養(yǎng)30?40天，期間更新I?2次液體培養(yǎng)基； 所述液體培養(yǎng)基的成分為:改良的MS基本培養(yǎng)基、0.1?Img.L—?2mg.L—1NAAd-Smg.L—hd-D'0.l — l.0mg.L—1TDZJ.1?5mg.IZ1AgNO3AO?80ml.L—1 椰子水和40?50g.L—1鹿糖； 所述改良的MS基本培養(yǎng)基中的改良成分為:MgS04.7H20 550mg.L"1 ,KH2P04420mg.L—\CaCh260mg.L-1^MnSO4.H2O 30mg.L—1、C11SO4.5H20 0.25mg.L_1； (3)繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程:在花藥懸浮培養(yǎng)長(zhǎng)出愈傷組織后每5-7天用與步驟(2)相同的液體培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)I次，并篩除老化和褐化的組織，持續(xù)繼代培養(yǎng)20?30天游離出小細(xì)胞團(tuán)后，吸取適量的小細(xì)胞團(tuán)按細(xì)胞團(tuán)占液體體積3%?6%的比例添加新的液體培養(yǎng)基繼續(xù)繼代培養(yǎng)I?3次，即獲得穩(wěn)定分散的懸浮細(xì)胞系。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法，包括材料的選取和消毒、懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程和繼代篩選培養(yǎng)過(guò)程。本發(fā)明提供快速建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法工藝流程簡(jiǎn)單，用時(shí)相對(duì)較短，只需60～90天即可建立一個(gè)穩(wěn)定均勻、分散性良好、生長(zhǎng)迅速的懸浮細(xì)胞系，比采用常規(guī)方法建立橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系花費(fèi)的時(shí)間至少縮短一半以上，極大降低了生產(chǎn)成本，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，可為批量體細(xì)胞胚同步誘導(dǎo)再生植株，或進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交，以及利用原生質(zhì)體為受體進(jìn)行外源基因的直接轉(zhuǎn)化等技術(shù)體系快速提供良好的材料來(lái)源。
【IPC分類】C12N5/04, A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105557524
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510951623
【發(fā)明人】戴雪梅, 楊先鋒, 黃天帶, 李季, 辛士超, 黃華孫
【申請(qǐng)人】中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日