本發(fā)明涉及一種高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體的制備方法。

背景技術(shù)：

高大環(huán)柄菇，又名高腳環(huán)柄菇、大環(huán)柄菇、高腳小傘，隸屬真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇科大環(huán)柄菇屬，是亞熱帶地區(qū)的一種大型腐生食用菌，在江西省有分布。其菌體大型，食味佳，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，尤以人體必需的8種氨基酸含量高而著稱，具有巨大的開發(fā)利用價值。東華理工大學(xué)食用菌研究中心馴化的高大環(huán)柄菇為出發(fā)菌株，對其原生質(zhì)體的制備條件進行探索，以獲得其原生質(zhì)體制備的最佳條件，為高大環(huán)柄菇優(yōu)良新品種的細胞融合選育、誘變選育和高大環(huán)柄菇優(yōu)良新品種細胞工程菌株的建構(gòu)奠定基礎(chǔ)，從而促進高大環(huán)柄菇的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體的制備方法。

一種高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:

（1）稱量黃豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆?jié){機將其磨成豆?jié){，過濾后加入葡萄糖20．0g，調(diào)節(jié)總?cè)莘e為10130mL(pH自然)，混合均勻，分裝滅菌以備用；

（2）將固體斜面培養(yǎng)好的高大環(huán)柄菇菌種接種于已滅菌豆?jié){培養(yǎng)基中，在25-30℃，150-200r/min下?lián)u床培養(yǎng)；

（3）待菌絲體長出來以后，取培養(yǎng)一定時間的菌絲培養(yǎng)液5mL于無菌離心管中，用滅菌的滲透壓穩(wěn)滲荊洗滌，在800r/min離心，棄去上清液收集菌體，再加入1mL相應(yīng)的酶解液，置一定溫度下恒溫培養(yǎng)，隔時搖動，并用無菌吸管猛吸多次，促使原生質(zhì)體從殘余菌絲上釋放，間隔一定時間取樣在10x40倍的光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體產(chǎn)出量；

（4）在3000-3500r/min離心10min棄去酶液上清液，用滲透壓穩(wěn)滲洗滌2次即獲得純化原生質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述步驟（2）培養(yǎng)環(huán)境為28℃，180r/min。

優(yōu)選地，所述步驟（4）在3200r/min離心。

本發(fā)明所述方法制備的高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)出量高，可充分發(fā)揮酶的效力，本發(fā)明工藝簡單，使用實用性強，可工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

實施例1。

一種高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:

（5）稱量黃豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆?jié){機將其磨成豆?jié){，過濾后加入葡萄糖20．0g，調(diào)節(jié)總?cè)莘e為10130mL(pH自然)，混合均勻，分裝滅菌以備用；

（6）將固體斜面培養(yǎng)好的高大環(huán)柄菇菌種接種于已滅菌豆?jié){培養(yǎng)基中，在25-30℃，150-200r/min下?lián)u床培養(yǎng)；

（7）待菌絲體長出來以后，取培養(yǎng)一定時間的菌絲培養(yǎng)液5mL于無菌離心管中，用滅菌的滲透壓穩(wěn)滲荊洗滌，在800r/min離心，棄去上清液收集菌體，再加入1mL相應(yīng)的酶解液，置一定溫度下恒溫培養(yǎng)，隔時搖動，并用無菌吸管猛吸多次，促使原生質(zhì)體從殘余菌絲上釋放，間隔一定時間取樣在10x40倍的光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體產(chǎn)出量；

（8）在3000-3500r/min離心10min棄去酶液上清液，用滲透壓穩(wěn)滲洗滌2次即獲得純化原生質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述步驟（2）培養(yǎng)環(huán)境為28℃，180r/min。

實施例2。

一種高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:

（9）稱量黃豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆?jié){機將其磨成豆?jié){，過濾后加入葡萄糖20．0g，調(diào)節(jié)總?cè)莘e為10130mL(pH自然)，混合均勻，分裝滅菌以備用；

（10）將固體斜面培養(yǎng)好的高大環(huán)柄菇菌種接種于已滅菌豆?jié){培養(yǎng)基中，在25-30℃，150-200r/min下?lián)u床培養(yǎng)；

（11）待菌絲體長出來以后，取培養(yǎng)一定時間的菌絲培養(yǎng)液5mL于無菌離心管中，用滅菌的滲透壓穩(wěn)滲荊洗滌，在800r/min離心，棄去上清液收集菌體，再加入1mL相應(yīng)的酶解液，置一定溫度下恒溫培養(yǎng)，隔時搖動，并用無菌吸管猛吸多次，促使原生質(zhì)體從殘余菌絲上釋放，間隔一定時間取樣在10x40倍的光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體產(chǎn)出量；

（12）在3000-3500r/min離心10min棄去酶液上清液，用滲透壓穩(wěn)滲洗滌2次即獲得純化原生質(zhì)體；

（13）所述步驟（2）培養(yǎng)環(huán)境為28℃，180r/min；

所述步驟（4）在3200r/min離心。