本發(fā)明涉及日本乙型腦炎病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙型腦炎是一種可通過蚊蟲媒介傳播的人畜共患傳染病，其由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起。JEV屬于蟲媒病毒黃病毒科黃病毒屬。豬是乙腦病毒的主要感染動(dòng)物之一，可與蚊蟲形成循環(huán)傳播模式。感染該病毒可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)和死胎，公豬單側(cè)或兩側(cè)性睪丸腫大。此病毒主要造成母豬繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)高產(chǎn)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前核酸方面的檢測(cè)方法主要為傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR以及核酸雜交技術(shù)等。定量或者半定量的PCR方法已經(jīng)有許多的研究報(bào)道，往往也顯示出不錯(cuò)的效果。但是，在感染早期，病毒感染量較低時(shí)，這些方法的檢測(cè)靈敏度低、檢出率低，不能提供及時(shí)準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合，該核酸組合包括檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的引物和探針，利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)出待測(cè)樣本中低含量的日本乙型腦炎病毒，特異性強(qiáng)。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合在檢測(cè)日本乙型腦炎病毒中的應(yīng)用，提高檢測(cè)的靈敏性和特異性。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒，該試劑包括上述核酸組合，該試劑盒可用于檢測(cè)低日本乙型腦炎病毒含量的待測(cè)樣本，其具有靈敏性好、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作方便等特點(diǎn)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合，其包括引物對(duì)和與引物對(duì)相對(duì)應(yīng)的探針，引物對(duì)包括堿基序列如SEQ ID NO.1所示的第一義務(wù)和如SEQ ID NO.2所示的第二引物，探針的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光報(bào)告基團(tuán)選自HEX、FAM或VIC中的任意一種，探針的3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，淬滅基團(tuán)為BHQ或TAMRA。

上述的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合在檢測(cè)日本乙型腦炎病毒中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒，其包括上述的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合。

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合、試劑盒及其應(yīng)用的有益效果是：

本發(fā)明的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合，根據(jù)日本乙型腦炎病毒全基因組的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，該核酸組合包括堿基序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物、如SEQ ID NO.1所示的第二引物以及堿基序列如SEQ ID NO.3所示的探針。該核酸組合用于日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)具有很好的特異性。將該核酸組合制備成檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒或者用于微滴數(shù)字PCR平臺(tái)上檢測(cè)日本乙型腦炎病毒，可實(shí)現(xiàn)對(duì)低日本乙型腦炎病毒含量的樣本進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、檢出率高等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例7中不同退火溫度的擴(kuò)增圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例8中qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例8中qPCR的特異性驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例8中ddPCR的特異性驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例9中靈敏性驗(yàn)證結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合、試劑盒及其應(yīng)用進(jìn)行具體說(shuō)明。

微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的快速、準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)DNA絕對(duì)定量的PCR方法。其原理是通過把稀釋到一定濃度的DNA分子分布在一定數(shù)目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子數(shù)目為1或0，然后通過PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)的累計(jì)讀取陽(yáng)性微滴數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出(現(xiàn)有的微滴數(shù)字PCR儀器基本上都自動(dòng)相應(yīng)軟件可自動(dòng)計(jì)算出DNA分子數(shù))樣本中的DNA分子數(shù)。該方法無(wú)需內(nèi)參基因無(wú)需制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在微量核酸待測(cè)樣本的檢測(cè)中顯示出很好的檢測(cè)效果。

乙型腦炎是一種可通過蚊蟲媒介傳播的人畜共患傳染病，具有有明顯的季節(jié)性及區(qū)域性。乙型腦炎主要流行于東亞、南亞和太平洋地區(qū)，每年因日本乙型腦炎病毒感染而死亡的易感人群在亞洲各國(guó)均有大量報(bào)道，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成一定威脅。同時(shí)，豬作為日本乙型腦炎病毒主要的易感動(dòng)物，感染該病毒后使得母豬繁殖障礙，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)增產(chǎn)造成巨大危害。因此，建立一種高度靈敏，能在早期檢測(cè)極微病毒量的日本乙型腦炎病毒ddPCR檢測(cè)技術(shù)，不僅對(duì)該病的鑒別診斷和預(yù)防控制提供支撐，也為我國(guó)公共衛(wèi)生安全和人畜共患病實(shí)時(shí)監(jiān)控提供技術(shù)參考。

基于此，發(fā)明人根據(jù)日本乙型腦炎病毒的全基因組的保守序列設(shè)計(jì)出了可用于ddPCR平臺(tái)的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合，其包括引物對(duì)和與引物對(duì)相對(duì)應(yīng)的探針，引物對(duì)包括堿基序列分別如SEQ ID NO.1-2所示的引物，探針的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，選自HEX、FAM或VIC中的任意一種，探針的3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)BHQ或TAMRA。

具體地，引物對(duì)包括SEQ ID NO.1所示的第一引物即上游引物和如SEQ ID NO.2所示的第二引物即下游引物，上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

通過上述核酸組合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)，其具很好的特異性。

本發(fā)明提供了檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒，其包括上述任一種的核酸組合。

該試劑盒可用于在ddPCR平臺(tái)上檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有日本乙型腦炎病毒，該試劑盒在ddPCR平臺(tái)上的運(yùn)用，與現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法相比，尤其適用于對(duì)低日本乙型腦炎病毒含量的待測(cè)樣本的檢測(cè)，具有靈敏性好、特異性強(qiáng)、檢出率高的特點(diǎn)。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒還可以包括在進(jìn)行ddPCR時(shí)配套的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一種或多種等成分。

本發(fā)明提供了上述的任意一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合在檢測(cè)日本乙型腦炎病毒中的應(yīng)用。該檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合其不僅可在ddPCR平臺(tái)進(jìn)行應(yīng)用，還可以通過熒光定量PCR、普通PCR等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)，只要采用本發(fā)明提供的核酸組合用于檢測(cè)日本乙型腦炎病毒即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

將本發(fā)明提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合應(yīng)用于日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)包括以下操作步驟：

(1)配制PCR反應(yīng)體系

往PCR體系中加入上述的引物對(duì)和與引物對(duì)相對(duì)應(yīng)的探針，以進(jìn)行PCR，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣本中日本乙型腦炎病毒的高靈敏性檢測(cè)。其中，PCR體系包括PCR反應(yīng)混合液和待測(cè)樣本的DNA模板。PCR反應(yīng)混合液可通過市面購(gòu)買，也可自行配制，PCR反應(yīng)混合液主要包括PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶等成分。

優(yōu)選地，引物對(duì)在PCR體系中的終濃度分別為0.88-0.92μM。更優(yōu)選地，引物對(duì)在PCR體系中的終濃度分別為0.9μM。

優(yōu)選地，探針在PCR體系中的終濃度為0.23-0.27μM。更優(yōu)選地，引物對(duì)在PCR體系中的終濃度為0.25μM。

(2)微滴生成

將PCR體系與微滴生成油混合形成微滴，并進(jìn)行微滴數(shù)字PCR。

優(yōu)選地，微滴生成油與PCR體系的體積比為6.8-7.2:2。更優(yōu)選地，微滴生成油與PCR體系的體積比為7:2。

優(yōu)選地，微滴生成后，對(duì)其進(jìn)行封閉處理，封閉處理的程序?yàn)椋簻囟?78-182℃，時(shí)間8-12s；更優(yōu)選地，封閉處理程序?yàn)椋簻囟?80℃，時(shí)間10s。封閉處理即是對(duì)反應(yīng)容器進(jìn)行封閉，防止在反應(yīng)過程中液體蒸發(fā)。

當(dāng)然，本發(fā)明在其他的實(shí)施例中，也可以采用將PCR反應(yīng)體系分散到ddPCR反應(yīng)芯片上的方式形成微滴，并不限于采用微滴生成油包裹的方式。

(3)在預(yù)設(shè)條件進(jìn)行微滴數(shù)字PCR反應(yīng)

優(yōu)選地，進(jìn)行微滴數(shù)字PCR的預(yù)設(shè)條件為：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，50-60℃退火1min，40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應(yīng)。

(4)檢測(cè)

在微滴分析儀器上檢測(cè)相應(yīng)的熒光信號(hào)，得到檢測(cè)結(jié)果。

綜上，本發(fā)明提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合及其應(yīng)用、試劑盒以及方法具有很高的靈敏性和很強(qiáng)的特異性，能夠有效地對(duì)低日本乙型腦炎病毒含量的待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出率高，克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法中對(duì)低日本乙型腦炎病毒含量的待測(cè)樣本的檢測(cè)靈敏度不高的缺陷，為日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)提供了更多的科學(xué)依據(jù)和支撐。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合，其包括引物對(duì)和探針。該引物對(duì)和探針根據(jù)日本乙型腦炎病毒全基因組的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)得到，可用于檢測(cè)出待測(cè)樣本中是否含有日本乙型腦炎病毒。

具體地，引物對(duì)的上游引物為：

5’-TGGACCACAACACTTGGAACAT-3’(其堿基序列如SEQ ID NO.1所示)。

引物對(duì)的下游引物為：

5’-CACAGTCGTCTCCGCTGATC-3’(其堿基序列如SEQ ID NO.2所示)。

探針為：

HEX-5’-CTTTGAGAATGGAGAGGAGAGAGTGA-3’-BHQ(其堿基序列如SEQ ID NO.3所示)。

綜上，本實(shí)施例提供的核酸組合可通過采用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，檢測(cè)出待測(cè)樣本中是否含有日本乙型腦炎病毒，實(shí)現(xiàn)對(duì)日本乙型腦炎病毒的快速檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度。

應(yīng)當(dāng)理解的是，在其他的實(shí)施例中，本發(fā)明提供核酸組合中的探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)可以是FAM或VIC，3’端的淬滅基團(tuán)可以是TAMRA。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒，該試劑盒包括實(shí)施例1提供的核酸組合。該試劑盒可用于在微滴數(shù)字PCR平臺(tái)上檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有日本乙型腦炎病毒。本實(shí)施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，能夠檢測(cè)出樣本中的極微量的病毒。

應(yīng)當(dāng)理解的是，在其他的實(shí)施例中，本發(fā)明提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒還可以包括在進(jìn)行微滴數(shù)字PCR時(shí)配套的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一種或多種等成分。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了應(yīng)用上述核酸組合檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法，具體如下。

1.配制ddPCR反應(yīng)體系20μL：ddPCR緩沖液10μL，上、下游引物終濃度各為0.9μM，探針終濃度為0.25μM，待測(cè)樣本的DNA模板2μL，雙蒸H₂O補(bǔ)足至20μL。

上、下游引物以及探針的堿基序列同實(shí)施例1。

2.生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反應(yīng)體系方式形成微滴，微滴生成油與ddPCR反應(yīng)體系的體積比7:2。在本實(shí)施例中，將PCR反應(yīng)體系20μL加入微滴生成卡中間一排，微滴生成油(droplet generation oil)70μL加入微滴生成卡最底一排，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀(QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國(guó)伯樂公司)，自動(dòng)生成微滴。

3.封閉ddPCR體系：吸取生成的微滴40μL加入96孔反應(yīng)板內(nèi)，用預(yù)熱好的熱封儀(PX1PCR熱封儀、美國(guó)伯樂公司)對(duì)96孔反應(yīng)板進(jìn)行封膜，封膜程序?yàn)椋簻囟?80℃，時(shí)間10s。

4.按如下ddPCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，60℃退火1min，40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應(yīng)。

5.檢測(cè)：在微滴分析儀(QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國(guó)伯樂公司)的HEX通道檢測(cè)HEX熒光信號(hào)。根據(jù)熒光信號(hào)值，檢測(cè)出待測(cè)樣本中的日本乙型腦炎病毒的濃度。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了應(yīng)用上述核酸組合檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法，其與實(shí)施例3中提供的方法大致相同，其區(qū)別在于：本實(shí)施例提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法的ddPCR反應(yīng)體系中上、下游引物終濃度各為0.92μM；ddPCR反應(yīng)體系中探針終濃度為0.23μM；微滴生成油與ddPCR反應(yīng)體系的體積比為6.8:2；封膜程序?yàn)椋簻囟?82℃，時(shí)間8s。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了應(yīng)用上述核酸組合檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法，其與實(shí)施例3中提供的方法大致相同，其區(qū)別在于：本實(shí)施例提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法的ddPCR反應(yīng)體系中上、下游引物終濃度各為0.88μM；ddPCR反應(yīng)體系中探針終濃度為0.27μM；微滴生成油與ddPCR反應(yīng)體系的體積比為7.2:2；封膜程序?yàn)椋簻囟?78℃，時(shí)間12s。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供了應(yīng)用上述核酸組合檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法，其與實(shí)施例3中提供的方法大致相同，其區(qū)別在于：本實(shí)施例提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的方法的ddPCR反應(yīng)體系中上、下游引物終濃度各為0.9μM；ddPCR反應(yīng)體系中探針終濃度為0.25μM；微滴生成油與ddPCR反應(yīng)體系的體積比為7:2；封膜程序?yàn)椋簻囟?78℃，時(shí)間8s。

實(shí)施例7

本實(shí)施例提供了應(yīng)用上述核酸組合對(duì)日本乙型腦炎病毒進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增的擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化。

本實(shí)施例中采用實(shí)施例3中的方法分別在60℃、59.2℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃的退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較不同溫度下的擴(kuò)增效率。結(jié)果如圖1所示。

由圖1(1-8分別代表：退火溫度分別為60℃、59.2℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃、陰性對(duì)照)可知，退火溫度在60℃、59.2℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃下均能擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率差異不明顯，陰性對(duì)照沒有熒光信號(hào)。

實(shí)施例8

對(duì)實(shí)施例1提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

1利用qPCR方法檢測(cè)上述核酸組合的擴(kuò)增效率：

以濃度依次為10⁴copies/μL、10⁵copies/μL、10⁶copies/μL、10⁷copies/μL、10⁸copies/μL的PMD-19T-JEV重組質(zhì)粒為模板，用qPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(JEV cDNA質(zhì)粒模板PMD-19T-JEV的制備方法可參考：利用JEV特異性引物對(duì)病毒核酸RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化回收，純化后的DNA與載體PMD-19T在16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，在含100ng/mL的氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16-24h，篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序鑒定。按照質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說(shuō)明書提取PMD-19T-JEV重組質(zhì)粒，利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Nanodrop 2000)測(cè)定重組質(zhì)粒濃度，置于-70℃保存?zhèn)溆谩?

1.1配制qPCR反應(yīng)體系20μL：2×qPCR反沖液10μL，上游引物和下游引物終濃度各為0.4μM，探針終濃度為0.6μM，待測(cè)樣本的DNA模板2μL，雙蒸水H₂O補(bǔ)足20μL。

上、下游引物以及探針的堿基序列同實(shí)施例1。

1.2按如下qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s，58℃退火30s，72℃30s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖2所示。

由圖2(圖2-A為qPCR的擴(kuò)增曲線，圖2-B為qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線)可知，日本乙型腦炎病毒qPCR的擴(kuò)增效率E＝95.7％，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R²＝0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2利用qPCR方法驗(yàn)證上述核酸組合的特異性：分別以豬日本乙型腦炎病毒(JEV，SA14-14-2株)疫苗、豬偽狂犬病毒(PRV，Bartha-K61,HB-98株)疫苗、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2，LG,ZJ/C株)疫苗、豬瘟病毒(CSFV，兔化弱毒株)疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV，R98、CH-1a、CH-1R株)疫苗、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV，JXA1-R、HUN4株)疫苗為待測(cè)樣本，檢測(cè)上述核酸組合的特異性。

2.1配制qPCR反應(yīng)體系20μL：2×qPCR反沖液10μL，上游引物和下游引物終濃度各為0.4μM，探針終濃度為0.6μM，標(biāo)準(zhǔn)品(JEV cDNA質(zhì)粒模板)2μL，雙蒸水H₂O補(bǔ)足20μL。

2.2按如下qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s，58℃退火30s，72℃30s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖3所示和表1所示。

由圖3和表1可知，以PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的DNA/cDNA為模板的反應(yīng)孔中均沒有檢測(cè)出熒光信號(hào)，而以JEV cDNA質(zhì)粒為模板的反應(yīng)孔中檢測(cè)到熒光信號(hào)。由此表明，以JEV cDNA質(zhì)粒為模板的反應(yīng)孔中有擴(kuò)增，上述核酸組合對(duì)日本乙型腦炎病毒具有很好的特異性。

3利用ddPCR方法檢測(cè)上述核酸組合的特異性：分別以豬日本乙型腦炎病毒(JEV，SA14-14-2株)疫苗、豬偽狂犬病毒(PRV，Bartha-K61,HB-98株)疫苗、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2，LG,ZJ/C株)疫苗、豬瘟病毒(CSFV，兔化弱毒株)疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV，R98、CH-1a、CH-1R株)疫苗、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV，JXA1-R、HUN4株)疫苗為待測(cè)樣本，檢測(cè)上述核酸組合的特異性。

3.1配制ddPCR反應(yīng)體系20μL：ddPCR緩沖液10μL，上、下游引物終濃度各為0.9μM，探針終濃度為0.25μM，待測(cè)樣本的DNA模板2μL，雙蒸H₂O補(bǔ)足至20μL。

上、下游引物以及探針的堿基序列同實(shí)施例1。

3.2生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反應(yīng)體系方式形成微滴，微滴生成油與ddPCR反應(yīng)體系的體積比7:2。在本實(shí)施例中，將PCR反應(yīng)體系20μL加入微滴生成卡中間一排，微滴生成油70μL加入微滴生成卡最底一排，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀(QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國(guó)伯樂公司)，自動(dòng)生成微滴。

3.3封閉ddPCR體系：吸取生成的微滴40μL加入96孔反應(yīng)板內(nèi)，用預(yù)熱好的熱封儀(PX1PCR熱封儀、美國(guó)伯樂公司)對(duì)96孔反應(yīng)板進(jìn)行封膜，封膜程序?yàn)椋簻囟?80℃，時(shí)間10s。

3.4按如下ddPCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，60℃退火1min，40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應(yīng)。

3.5檢測(cè)：在微滴分析儀(QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國(guó)伯樂公司)的HEX通道檢測(cè)HEX熒光信號(hào)。根據(jù)熒光信號(hào)值，檢測(cè)出待測(cè)樣本中的日本乙型腦炎病毒的濃度。結(jié)果如圖4所示和表1所示。

由圖4和表1可知，以PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的DNA/cDNA為模板的反應(yīng)孔中均沒有檢測(cè)出熒光信號(hào)，而以JEV cDNA質(zhì)粒為模板的反應(yīng)孔中檢測(cè)到熒光信號(hào)。由此表明，以JEV cDNA質(zhì)粒為模板的反應(yīng)孔中有擴(kuò)增，在ddPCR檢測(cè)平臺(tái)上，上述核酸組合對(duì)日本乙型腦炎病毒具有很好的特異性。

利用qPCR和ddPCR分別檢測(cè)JEV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的結(jié)果如表1所示。

表1特異性檢測(cè)結(jié)果

注：“+”表示檢測(cè)到熒光信號(hào)，“－”表示未檢測(cè)到熒光信號(hào)。

綜上，本發(fā)明提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合以及試劑盒對(duì)日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)具有很好的特異性。

實(shí)施例9

本實(shí)施例提供了應(yīng)用上述核酸組合檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的靈敏性的驗(yàn)證。

本實(shí)施中主要通過將檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的qPCR方法與ddPCR方法進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)價(jià)上述核酸組合在兩種方法中檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的靈敏性。以終濃度為10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL、10^-1copies/μL的PMD-19T-JEV重組質(zhì)粒為模板，分別以qPCR和ddPCR兩種方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體地：

1 qPCR方法按照如下步驟進(jìn)行：

1.1配制qPCR反應(yīng)體系20μL：2×qPCR緩沖液10μL，上游引物和下游引物終濃度各0.4μM，探針終濃度為0.6μM，PMD-19T-JEV重組質(zhì)粒2μL，雙蒸水H₂O補(bǔ)足20μL。

上、下游引物以及探針的堿基序列同實(shí)施例1。

1.2按如下qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s，58℃退火30s，72℃30s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖5-A所示。

2 ddPCR方法按照如下步驟進(jìn)行：

2.1配制ddPCR反應(yīng)體系20μL：ddPCR緩沖液10μL，上、下游引物終濃度各為0.9μM，探針終濃度為0.25μM，PMD-19T-JEV重組質(zhì)粒2μL，雙蒸H₂O補(bǔ)足至20μL。

上、下游引物以及探針的堿基序列同實(shí)施例1。

2.2生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反應(yīng)體系方式形成微滴，微滴生成油與ddPCR反應(yīng)體系的體積比7:2。在本實(shí)施例中，將PCR反應(yīng)體系20μL加入微滴生成卡中間一排，微滴生成油70μL加入微滴生成卡最底一排，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀(QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國(guó)伯樂公司)，自動(dòng)生成微滴。

2.3封閉ddPCR體系：吸取生成的微滴40μL加入96孔反應(yīng)板內(nèi)，用預(yù)熱好的熱封儀(PX1PCR熱封儀、美國(guó)伯樂公司)對(duì)96孔反應(yīng)板進(jìn)行封膜，封膜程序?yàn)椋簻囟?80℃，時(shí)間10s。

2.4按如下ddPCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，60℃退火1min，40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應(yīng)。

2.5檢測(cè)：在微滴分析儀(QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國(guó)伯樂公司)的HEX通道檢測(cè)HEX熒光信號(hào)。根據(jù)熒光信號(hào)值，檢測(cè)出待測(cè)樣本中的日本乙型腦炎病毒的濃度。結(jié)果如圖5-B所示。

由圖5(圖5-A為qPCR的靈敏性驗(yàn)證結(jié)果；圖5-B為ddPCR的靈敏性驗(yàn)證結(jié)果，其中1-7中分別代表擴(kuò)增模板拷貝數(shù)分別為10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL、10^-1copies/μL。)可知，qPCR的最低檢出濃度為10²copies/μL，ddPCR的最低檢出濃度為10⁰copies/μL。由此說(shuō)明ddPCR檢測(cè)方法的最低檢出濃度比qPCR高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明中提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合應(yīng)用于ddPCR檢測(cè)方法對(duì)日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)具有很高的靈敏性。

實(shí)施例10

本實(shí)施例中提供了檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合分別結(jié)合qPCR和ddPCR檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)實(shí)際樣本。

qPCR的檢測(cè)方法同實(shí)施例8；

ddPCR的檢測(cè)方法同實(shí)施例8；

對(duì)57份疑似患病豬的樣品進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，同時(shí)用qPCR對(duì)樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，并對(duì)兩者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。57份樣品中包括：31份內(nèi)臟樣品、18份精液樣品、6份流產(chǎn)胎樣品、2份腦組織樣品。檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2.樣品信息及檢測(cè)結(jié)果

注：SAU:Sichuan Agricultural University(四川農(nóng)業(yè)大學(xué))；陽(yáng)性總檢出率＝(檢出陽(yáng)性樣品總數(shù)/57)×100％。

由表2可知，在57份實(shí)際樣品中，qPCR檢出陽(yáng)性樣品總數(shù)為23個(gè)，陽(yáng)性檢出率為40.4％；ddPCR檢出陽(yáng)性樣品總數(shù)為31個(gè)，陽(yáng)性檢出率為54.4％。ddPCR的陽(yáng)性檢出率高于qPCR的陽(yáng)性檢出率，由此表明：本發(fā)明提供的核酸組合可應(yīng)用于qPCR和ddPCR檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)，并且ddPCR可以彌補(bǔ)qPCR的不足，可對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果可疑的樣品進(jìn)行進(jìn)一步確證。

綜上所述，本發(fā)明提供的檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合，根據(jù)日本乙型腦炎病毒全基因組的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，該核酸組合包括堿基序列分別如SEQ ID NO.1-2所示的引物對(duì)和堿基序列如SEQ ID NO.3所示的探針。該核酸組合用于日本乙型腦炎病毒的檢測(cè)具有很好的特異性。將還核酸組合制備成檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑盒或者用于微滴數(shù)字PCR平臺(tái)上檢測(cè)日本乙型腦炎病毒，可實(shí)現(xiàn)對(duì)低日本乙型腦炎病毒含量的樣本進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、檢出率高等特點(diǎn)。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 、成都大學(xué)

<120> 一種檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的核酸組合、試劑盒及其應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggaccacaa cacttggaac at 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacagtcgtc tccgctgatc 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctttgagaat ggagaggaga gagtga 26