一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)環(huán)境中6種病毒污染的多重rt-pcr方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬場(chǎng)環(huán)境中主要病毒污染監(jiān)測(cè)的多重RT-PCR技術(shù)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]養(yǎng)豬業(yè)逐漸向集約化、規(guī)?；l(fā)展，密集型飼養(yǎng)方式是當(dāng)前主要的養(yǎng)殖模式，豬傳染病主要以環(huán)境中的空氣、飼料、飲水、器具、糞便等作為媒介進(jìn)行傳播。豬瘟病毒(CSFV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)等是污染規(guī)?；i場(chǎng)的主要病毒。現(xiàn)有的技術(shù)主要用于豬發(fā)病后的診斷，而缺乏對(duì)環(huán)境中病毒污染的監(jiān)測(cè)技術(shù)，更不能建立預(yù)警機(jī)制，不能提前防控病毒感染，也不能監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)病原的凈化情況。因此，建立豬場(chǎng)環(huán)境中上述6種病毒污染多重RT-PCR監(jiān)測(cè)方法，監(jiān)測(cè)豬舍和豬場(chǎng)環(huán)境中空氣、飼料、飲水、器具、糞便和豬群的上述6種病毒污染，為建立豬場(chǎng)環(huán)境中主要病毒污染預(yù)警機(jī)制及主要病毒病防控和凈化體系提供了技術(shù)支持。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)試效果好，使用方便的一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)環(huán)境中6種病毒污染的多重RT-PCR方法和應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是，1、一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)環(huán)境中6種病毒污染的方法，其特征在于包括以下步驟:
I)引物設(shè)計(jì)利用軟件在豬瘟病毒(CSFV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0005]CSFVF GCTCCCTGGGTGTTCTAAGT CSFVR TGCTGTCCTTCTCATGCTCTT PRRSVF GGCCAGCCAGTCAATCAG PRRSVR GGCAAACTAAACTCCACAGTG JEVF CAAACTGGCTCTGAAAGG
JEVR TGTCTCAGGTCCATCTACG PCV-2F CAGCACCCTGTAACGTTTG PCV-2R AGGAGTACCATTCCAACGG PPVF ACATCTAAATATGCCAGAACACG PPVR GTTTGCCATGAGTGAGTTAATTT PRVF CTCCTTGAGCGTCTTCGTCG PRVR CCTTCCTGTCCAACCCCTTC
把對(duì)應(yīng)片段連接到載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得大量擴(kuò)增后，按照1:5的比例將保護(hù)劑和DNA混合均勾，制成專用marker，作為參照標(biāo)準(zhǔn)。
[0006]2)多重RT-PCR的建立建立了一個(gè)體系同時(shí)檢測(cè)上述6種病毒的多重RT-PCR方法。
[0007]3)空氣樣品采集通過(guò)液體撞擊法采集豬舍內(nèi)和豬場(chǎng)環(huán)境中空氣；用截留分子量為1kD的超濾管超濾離心對(duì)病毒進(jìn)行分離濃縮。
[0008]該監(jiān)測(cè)方法所涉及6種病毒(CSFV、JEV、PRRSV, PCV-2、PRV和PPV)的目的片段分別為 829bp、1045 bp、275 bp、382 bp、142 bp 和 636bp。
[0009]該多重RT-PCR采用50 μ L反應(yīng)體系:2 X TaqMaster Mix為25 μ L，6種病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6種病毒混合核酸共3 μ L，滅菌蒸餾水19 μ L0反應(yīng)條件為:94 °C5min ；94 °C 45s ；56 °C lm30s ； 72 °C 50s 循環(huán)數(shù)為 40 次，最后 72 °C延伸 10min，4 °(:保存。
[0010]豬舍和豬場(chǎng)環(huán)境中空氣樣品采集的位置和點(diǎn)數(shù)為:豬舍內(nèi)采集樣品的位置為豬舍過(guò)道中央距離地面高度0.5-lm處根據(jù)豬舍的面積確定采樣點(diǎn)數(shù)，30m2左右I個(gè)采樣點(diǎn)，豬場(chǎng)內(nèi)采集樣品的位置為豬場(chǎng)中央及院墻周圍四個(gè)角落共5個(gè)采樣點(diǎn)，距離地面0.5-lm，每個(gè)采樣點(diǎn)采集時(shí)間為40min，豬場(chǎng)外采集樣品的位置為豬場(chǎng)上、下風(fēng)口距離200m處各3個(gè)采樣點(diǎn)。糞便采集選用早晨喂食后采集新鮮的糞便樣品20g左右。
[0011]該方法可用于監(jiān)測(cè)豬舍和豬場(chǎng)環(huán)境中空氣、飼料、飲水、器具、糞便和豬群的上述6種病毒污染，為建立豬場(chǎng)環(huán)境中主要病毒污染預(yù)警機(jī)制及主要病毒病防控和凈化體系提供了技術(shù)支持。
[0012]本發(fā)明的發(fā)明思路是:
1.根據(jù)Genbank的序列，通過(guò)DNAstar比對(duì)分析其保守序列，針對(duì)其保守序列設(shè)計(jì)引物。
[0013]2.獲取豬瘟病毒(CSFV)、細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)、圓環(huán)病毒-2型(PCV-2)、豬繁殖呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)的參考毒株，
3.提取病毒的核酸，進(jìn)行單項(xiàng)的PCR和RT-PCR，并將其連接到pMD-18 T載體，將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)保存，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，膠回收各個(gè)片段測(cè)定濃度并稀釋至其相應(yīng)濃度，按照1:5的比例將保護(hù)劑和DNA混合均勻，制成專用marker。
[0014]4.通過(guò)液體撞擊法采集豬舍和豬場(chǎng)內(nèi)外環(huán)境中空氣，用截留分子量為1kD的超濾管離心對(duì)病毒進(jìn)行分離濃縮，其他樣品如飼料、飲水、器具、糞便和豬群的采樣方法采用常規(guī)的收集方法，濃縮方法相同。
[0015]5.多重RT-PCR，采用50 μ L反應(yīng)體系:2 X Taq MasterMix為25 μ L，6種病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6種病毒混合核酸共3 μ L，滅菌蒸餾水19 μ L0反應(yīng)條件為:94°C5min ；94°C 45s ；56°C lm30s ； 72°C 50s 循環(huán)數(shù)為 40 次，最后 72°C延伸 10min，4°C保存。
[0016]6.通過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用I X TAE緩沖液、I1V電壓、室溫條件下電泳時(shí)間30min左右，當(dāng)loading Buffer達(dá)到膠的中間位置即可，電泳后與專用marker進(jìn)行比對(duì)，出現(xiàn)相應(yīng)條帶，判定為陽(yáng)性。
[0017]7.任一個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即可判定該場(chǎng)受到病毒污染威脅，提示該豬場(chǎng)應(yīng)采取相應(yīng)防控措施。
[0018]8.預(yù)警機(jī)制:豬場(chǎng)外上、下風(fēng)口任何一個(gè)樣品檢出病毒陽(yáng)性，而豬場(chǎng)、豬舍內(nèi)樣品為陰性，為一級(jí)預(yù)警；豬場(chǎng)內(nèi)任何一個(gè)樣品檢出病毒陽(yáng)性，而豬舍內(nèi)樣品為陰性，或疫苗免疫排毒期豬舍內(nèi)疫苗毒為陽(yáng)性，為二級(jí)預(yù)警；非疫苗免疫排毒期豬舍內(nèi)空氣、飼料、飲水、器具的任何一個(gè)樣品檢出病毒陽(yáng)性，而同棟豬舍的豬群或糞便樣品為陰性，為三級(jí)預(yù)警；非疫苗免疫排毒期在豬群或糞便的任何一個(gè)樣品檢出病毒陽(yáng)性，為四級(jí)預(yù)警。
[0019]【附圖說(shuō)明】:
圖1是本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定的圖。
[0020]圖面說(shuō)明:圖1瓊脂糖凝膠檢測(cè)JEV、CSFV, PRRSV, PPV、PCV-2、PRV 6病毒的多重PCR 結(jié)果，M:DL2000 DNA Marker ；1:專用 Marker 2:JEV, CSFV，PRRSV，PPV，PCV-2, PRV 多重 RT-PCR, 3 JEV, 4:CSFV，5:PPV，6:PCV-2, 7:PRRSV，8:PRV0
[0021]【具體實(shí)施方式】:
以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)該理解為對(duì)本發(fā)明的限制，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或者條件的修改或者替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0022]下面實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0023]實(shí)施例1、專用Marker的制備
本發(fā)明利用Genbank的參考序列，進(jìn)行序列比較，選擇保守序列，利用生物信息技術(shù)針對(duì)各個(gè)序列設(shè)計(jì)引物，提取病毒的核酸，進(jìn)行PCR或RT-PCR，并膠回收PCR產(chǎn)物，將其連接到pMD-18T載體，將其轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中保存，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收各個(gè)片段，測(cè)定其濃度，將其稀釋至相應(yīng)濃度添加保護(hù)劑(36%甘油，0.05%的溴酚藍(lán)，
0.05% 二甲苯腈藍(lán)FF，30mM的EDTA)。并按保護(hù)劑和DNA的比例為1:5混合均勻，即制成專用 Marker。專用 Marker 由 DNA 片段 1045bp、829bp、636bp、382bp、275bp 和 142bp 組成，共六條帶，其中636bp條帶的DNA量為30ng/^L，其余條帶為10 ng/^L。在_20°C保存一年，避免反復(fù)凍融。
[0024]實(shí)驗(yàn)例2、6種病毒多重RT-PCR方法
將提取PCV-2、PPV、PRV的DNA和JEV、CSFV, PRRSV的cDNA混合作為模板進(jìn)行多重RT-PCR的檢測(cè)，多重PCR采用50 μ L的反應(yīng)體系:2XTaq MasterMix為25 μ L，6種病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6種病毒混合核酸共3 μ L，滅菌蒸餾水19 μ L0瞬時(shí)離心混合均勻。反應(yīng)條件為:94°C 5min ；94°C 45s ；56°C lm30s ； 72°C 50s 循環(huán)數(shù)為 40 次，最后 72°C延伸10min，4°C保存。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0025]實(shí)驗(yàn)例3、豬場(chǎng)環(huán)境的監(jiān)測(cè)
將便攜式氣體采樣栗和氣泡收集瓶相連，收集瓶?jī)?nèi)加入20 mL pH=7.2的PBS緩沖液(含5%甘油)，工作流量為6 L/min，收集時(shí)間為30min，樣品在24小時(shí)內(nèi)處理完畢。