埃茲蛋白在防治乙型腦炎病毒感染中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗乙型腦炎病毒感染的新靶點(diǎn)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV)， 屬于黃病毒科（Flaviviridae)黃病毒屬（Flavivirus)，為有包膜的單正鏈RNA病毒 [Gubler,D. ,G.Kuno,andL.Markoff.Flaviviruses,p. 2007. 1153-1252.InD.M.Knipe andP.M.Howley(ed. ),Fieldsvirology, 5thed. ,vol. 1.Lippincott-ffilliams&ffilki ns,Philadelphia,PA. ]。JEV為流行性乙型腦炎的病原體，主要以蚊蟲為媒介進(jìn)行傳播， 感染后能夠引發(fā)腦炎或腦膜炎等嚴(yán)重的急性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對(duì)人類健康威脅巨大。乙型 腦炎主要流行于東亞、東南亞以及大洋洲的部分地區(qū)，目前主要的控制手段為疫苗預(yù)防 以及蚊蟲的消除，然而全球每年報(bào)告的乙型腦炎病例仍有35, 000-50, 000例，死亡人數(shù) 超過 10,000 例[Misra,U.K.andJ.Kalita.Overview:Japaneseencephalitis.Prog. Neurobiol. 2010. 91:108-120.]，由于診斷和報(bào)告機(jī)制不完善，實(shí)際的感染和死亡病例要超 過這些數(shù)字，可見乙型腦炎仍然是危害公眾健康的重大問題，因而研究JEV致病機(jī)理和預(yù) 防手段，尋找新的抗病毒策略，已成為亟待解決的前沿課題。
[0003]JEV感染具有嗜神經(jīng)性，易造成嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)疾病及其并發(fā)癥，這 也是導(dǎo)致乙型腦炎患者發(fā)展為重癥甚至死亡的主要原因[DenizotM,NealJW，Gasque P.Encephalitisduetoemergingviruses:CNSinnateimmunityandpotential therapeutictargets.JInfect. 2012. 65 (1) : 1-16.]。JEV經(jīng)血液循環(huán)感染CNS需要穿越 血腦屏障，然而病毒如何穿過血腦屏障侵入CNS的機(jī)制還不清楚。血腦屏障（BloodBrain Barrier，BBB)是位于循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間一道主要的屏障，它限制著不同物質(zhì)在 兩個(gè)部位之間的自由運(yùn)輸，對(duì)維持CNS的體內(nèi)平衡以及保護(hù)CNS免受外界病原微生物的侵 襲中起著至關(guān)重要的作用[DyrnaF，HanskeS,KruegerM，BechmannI.Theblood-brain barrier.JNeuroimmunePharmacol. 2013 ;8 (4) : 763-73.]。血腦屏障是由無窗孔的腦微 血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、細(xì)胞基膜和周細(xì)胞共同組成的一個(gè) 細(xì)胞復(fù)合體。在這個(gè)細(xì)胞復(fù)合體中，最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain MicrovascularEndothelialCells，BMECs)及其緊密連接，其嚴(yán)整性的丟失被認(rèn)為是病毒 感染致腦組織損傷的一個(gè)重要原因。因此，探明JEV感染BMECs的機(jī)制并以此尋找新的抗 病毒靶點(diǎn)，對(duì)于保護(hù)血腦屏障的功能，以及防治JEV所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染至關(guān)重要。
[0004] 為了有效地感染細(xì)胞，病毒必須利用宿主細(xì)胞的膜分子及其囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)完成 對(duì)宿主細(xì)胞的入侵，才能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并釋放出有感染性的子代病毒顆粒。因此，作 為病毒感染宿主細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)，細(xì)胞入侵已成為抗病毒藥物篩選的重要靶標(biāo)。研究表 明，JEV可利用不同的宿主因子和感染途徑來侵入靶細(xì)胞，如JEV需借助網(wǎng)格蛋白依賴的 內(nèi)吞途徑（clathrin-mediatedendocytosis)感染非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）[Nawa M,TakasakiT,YamadaΚ,KuraneI，AkatsukaΤ·InterferenceinJapaneseencephalitis virusinfectionofVerocellsbyacationicamphiphilicdrug,chlorpromazine.JGenVirol. 2003, 84(Pt7) : 1737-41.]，但感染神經(jīng)細(xì)胞并不需要依賴網(wǎng)格蛋 白[KaliaM,KhasaR,SharmaM,NainM,VratiS.Japaneseencephalitisvirus infectsneuronalcellsthroughaclathrin-independentendocyticmechanism.J Virol, 2013, 87(1) : 148-62. ]。JEV可通過其包膜蛋白與熱休克蛋白70相互作用來感染白 紋伊蚊細(xì)胞（C6/36 細(xì)胞）[ChuangCK,YangTH,ChenTH,YangCF,ChenWJ.Heatshock cognateprotein70isoformDisrequiredforclathrin-dependentendocytosisof JapaneseencephalitisvirusinC6/36cells.JGenVirol.2015, 96(Pt4):793-803.] 以及人肝癌細(xì)胞（Huh7細(xì)胞）[ZhuYZ,CaoMM,WangWB,etal.Associationofheat-shock protein70withlipidraftsisrequiredforJapaneseencephalitisvirus infectioninHuh7cells.JGenVirol. 2012, 93(Pt1):61-71.]。目前，關(guān)于JEV感染 BMECs的途徑及機(jī)制仍不清楚。
[0005] 病毒侵入靶細(xì)胞主要借助了參與宿主細(xì)胞自身物質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵分子，這些宿主 細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子在細(xì)胞的跨膜物質(zhì)運(yùn)輸，囊泡的形成、內(nèi)吞以及分泌中發(fā)揮著重要的作 用。如金屬蛋白酶調(diào)節(jié)了細(xì)胞粘附，細(xì)胞膜分子的降解；網(wǎng)格蛋白（clathrin)主要負(fù) 責(zé)受體介導(dǎo)的的內(nèi)吞過程；Flotillin分子能夠與脂筏內(nèi)蛋白分子相互作用并內(nèi)吞入細(xì) 胞內(nèi)；ADP核糖基化因子6分子參與調(diào)解細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白裝配；GTP酶激 活蛋白分子GRAF1在網(wǎng)格蛋白非依賴型的囊泡運(yùn)輸中具有重要的調(diào)節(jié)作用；白細(xì)胞介 素2受體內(nèi)吞調(diào)節(jié)了信號(hào)通路并影響了細(xì)胞增殖；epsin蛋白調(diào)節(jié)了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi) 吞囊泡的運(yùn)輸過程等[DohertyGJ,McMahonHT.Mechanismsofendocytosis.AnnuRev Biochem. 2009,78:857-902.]。在這些分子中，網(wǎng)格蛋白被證實(shí)參與了JEV感染的過程，而 其它分子在JEV感染中的作用還未有報(bào)道。
[0006] 埃茲蛋白（Ezrin)為膜細(xì)胞骨架連接蛋白，是連接細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間的 ERM(ezrin-radixin-moesin，埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白）家族成員之一。常與根蛋白、 膜突蛋白共同表達(dá)于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。研究表明，Ezrin介導(dǎo)膜與細(xì)胞骨架的連接，是細(xì)胞信號(hào) 傳導(dǎo)和生長(zhǎng)過程中胞膜與細(xì)胞骨架的重要聯(lián)系和調(diào)節(jié)分子。因此，Ezrin在維持細(xì)胞極性、 參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等方面均發(fā)揮著作用[NeischAL，F(xiàn)ehon RG.Ezrin,RadixinandMoesin:keyregulatorsofmembrane-cortexinteractions andsignaling.CurrOpinCellBiol. 2011，23 (4): 377-82·]。近些年研究也發(fā)現(xiàn)Ezrin 蛋白也參與了多種病毒的感染與致病過程。如Ezrin蛋白作為正向調(diào)節(jié)因子參與了免 疫缺陷病毒（HIV-1)的感染過程[YoshinaoKubo，HiroakiYoshii，HarukaKamiyama，et al.Ezrin,Radixin,andMoesin(ERM)proteinsfunctionaspleiotropicregulatorsof humanimmunodeficiencyvirustype1infection.Virology, 2008,375:130-140.]〇 Ezrin蛋白在丙型肝炎病毒（HCV)的感染過程中能夠被HCV包膜E2蛋白誘導(dǎo)磷酸化，磷酸 化的Ezrin蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架從而介導(dǎo)了HCV的有效感染[TerenceN.Bukong,Karen Kodys,andGyongyiSzabo.HumanEzrin-Moesin-RadixinProteinsModulateHepatitis CVirusInfection.Hepatology, 2013, 58:1569-1579]?？梢奅zrin蛋白在參與病毒感染 與致病過程中的重要作用。
[0007]目前還沒有任何關(guān)于埃茲蛋白分子在JEV感染中作用的報(bào)道，對(duì)于該分子進(jìn)行深 入研究不僅能夠提升對(duì)JEV感染與致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也可以為預(yù)防與治療JEV感染提供新 的思路與靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗乙型腦炎病毒感染的新靶點(diǎn)。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供埃茲蛋白（Ezrin)分子的新用途，特別是在抗乙型腦 炎病毒感染中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第三目的在于提供干擾Ezrin蛋白分子表達(dá)的siRNA。
[0011] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：
[0012] 本發(fā)明，以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)作為靶細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)靶 細(xì)胞宿主蛋白的表達(dá)，來尋找可有效抑制JEV感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)的宿主因 子，從而保護(hù)血腦屏障的功能。本實(shí)驗(yàn)選擇了一組參與或調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分子來 進(jìn)行篩選，這些分子在宿主細(xì)胞的跨膜物質(zhì)運(yùn)輸，囊泡的內(nèi)吞與分泌以及對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào) 節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，它們往往也是在病毒感染過程中易被病毒"劫持"并利用的分 子。這些分子包括：ADAM金屬蛋白酶（ADAM10)、ADP核糖基化因子6(ARF6)、網(wǎng)格蛋白輕 鏈A(CLTA)、