本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種鑒別檢測(cè)PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株與高致病性疫苗株（JXA1-R株）的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，適用于臨床或科研中鑒別檢測(cè)樣品是否是PRRSV經(jīng)典株感染，或者是PRRSV高致病性變異株感染，或者是PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）感染，亦或是其中兩者或三者的共同感染。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前、后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。

1991年，荷蘭學(xué)者Wensvoort等人在感染豬體內(nèi)分離到歐洲型PRRSV，命名為L(zhǎng)elystad病毒(LV)；同年，美國(guó)學(xué)者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為VR-2332。目前，豬繁殖與呼吸綜合征已在世界范圍內(nèi)流行，我國(guó)自1996年以來(lái)普遍存在該病。2006年6月起，我國(guó)南方一些省份的豬場(chǎng)暴發(fā)了一種“高熱”綜合征，發(fā)病豬的體溫高于41℃，病豬食欲不振甚至廢絕，腹部、耳尖及后軀發(fā)紅，發(fā)病率達(dá)70%～100%，死亡率達(dá)50%～100%不等。該病傳播迅速，在短短的半年內(nèi)幾乎傳遍了大半個(gè)中國(guó)，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

由于PRRSV在流行過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生演化重組，不同來(lái)源的PRRSV基因的重組產(chǎn)生了大量的中間毒株，包括野毒間的重組毒株、疫苗毒株和野毒株的重組毒株、以及疫苗毒株演化而來(lái)的毒株。這種變化使得病毒的致病力持續(xù)增強(qiáng)，疫病防控的難度也逐漸加大。

傳統(tǒng)的豬繁殖與呼吸障礙綜合征的診斷方法有多種，如檢測(cè)病原的有病毒分離、免疫組化、免疫熒光試驗(yàn)等方法，檢測(cè)抗體的有ELISA、血清病毒中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫過(guò)氧化酶單層試驗(yàn)等血清學(xué)方法，但這些診斷方法不同程度地存在諸如敏感性低、特異性差、需時(shí)長(zhǎng)、無(wú)法區(qū)分PRRSV的不同毒株感染等的局限性。國(guó)內(nèi)外已建立了針對(duì)所有PRRSV的RT-PCR方法，但此種方法只能檢測(cè)是否有PRRSV感染，無(wú)法判斷是PRRSV經(jīng)典株感染，或者是PRRSV高致病性變異株感染，亦或是兩者共同感染。此外，已有的針對(duì)PRRSV高致病性變異株的RT-PCR檢測(cè)方法，只能檢測(cè)出PRRSV高致病性變異株，無(wú)法判斷是單一的PRRSV高致病性變異株感染，還是PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株亦或是高致病性疫苗株的共同感染。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株與高致病性疫苗株的鑒別檢測(cè)方法意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒別PRRSV的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒只需一次擴(kuò)增反應(yīng)就可同時(shí)檢測(cè)出樣本中是否含有PRRSV JXA1-R、經(jīng)典株和高致病性變異株，臨床應(yīng)用操作便捷，實(shí)用性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，適合于養(yǎng)殖場(chǎng)和專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)PRRSV病毒株的快速鑒定，同時(shí)可為PRRS的疫情監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查及綜合防控提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于鑒別PRRSV的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括5×M-MLV反轉(zhuǎn)錄Buffer、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP Mixture、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、兩對(duì)引物和DEPC水；

引物是根據(jù)GenBank公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒序列，在其N(xiāo)SP2基因保守序列區(qū)域及JXA1-R株與其它高致病性PRRSV毒株13380-13900 nt區(qū)域設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物。

所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為將豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、高致病性毒株及高致病性疫苗株（JXA1-R株）分別接種Marc-145細(xì)胞后，收集48-72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)定TCID₅₀，通過(guò)β-丙內(nèi)酯滅活后，三種毒株混合至最終含量均為10⁴ TCID₅₀/mL。

應(yīng)用所述試劑盒檢測(cè)待檢樣品中是否含有PRRSV的方法，包括如下步驟 ：

1、病毒RNA的提取

采用Trizol法提取，分別取美洲型PRRSV國(guó)內(nèi)分離株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ、PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的細(xì)胞培養(yǎng)液各400 μL，凍融2-3次，加800 μL Trizol，室溫作用5 min；加入200 μL氯仿，室溫作用10 min；4℃，12000 rpm，離心15 min；吸取上清液，加入等體積異丙醇，-20℃作用10 min；4℃，12000 rpm，離心15 min；棄上清液，加入1 mL75%乙醇，8000 rpm，離心5 min；棄乙醇，晾干，即得病毒基因組總RNA，立即反轉(zhuǎn)錄或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

cDNA 的合成體系采用20 μL體系, 其中含2μL RNA, 5×M-MLV反轉(zhuǎn)錄Buffer 4 μL, 10 mM dNTP 2 μL, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL (100U)，Random Primer 1 μL(30 pM/μL) Rnasin 0.5 μL, 再用DEPC水補(bǔ)至20 μL，42℃ 1h，95℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，即得cDNA，立即進(jìn)行PCR或置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、多重RT-PCR

以病毒基因組cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL體系，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL（NSP2-F：5’-TGAYGGGCGACAATGTCC-3’；

NSP2-R：5’-CGCAGACAAATCCAGAVG-3’；JXA1-F：5’-ATTTGAATGTTCGCACGGTC TC

-3’；JXA1-R：5’- CCGCTGAAACTCTGGTTAAAGG-3’），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板cDNA 2.5μL，用DEPC水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

4、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果判定

取PCR產(chǎn)物7 μL于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓80-120 V，時(shí)間15-20 min，根據(jù)電泳圖像判斷檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)電泳圖按照PRRSV普通株的目的條帶為319 bp，PRRSV高致病性毒株的目的條帶為229 bp，PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的目的條帶為229 bp 和610 bp，判定是PRRSV三種毒株的單獨(dú)感染或是混合感染。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明利用兩對(duì)引物鑒別美洲型 PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株和高致病性疫苗株（JXA1-R株）三種毒株，減少了鑒定不同PRRSV病毒株的檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間；且只需一次PCR反應(yīng)即可鑒別出三種PRRSV毒株，解決了臨床樣品檢測(cè)中無(wú)法區(qū)分PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株和高致病性疫苗株（JXA1-R株）單獨(dú)感染亦或共同感染的問(wèn)題。

2、本發(fā)明具有敏感性高、特異性強(qiáng)，可重復(fù)性好等諸多優(yōu)勢(shì)，僅對(duì)PRRSV的核酸產(chǎn)生特異性的擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒、豬輪狀病毒等均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，試劑盒的可檢測(cè)出RNA樣品的濃度為96 copies/反應(yīng)。

3、簡(jiǎn)便快速，僅需約1個(gè)小時(shí)，加上核酸的提取和瓊脂糖凝膠檢測(cè)，共需約2小時(shí)。

4、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，僅需一次PCR擴(kuò)增即可鑒別出PRRSV的三種毒株，對(duì)于需要同時(shí)檢測(cè)PRRSV三種毒株的樣本來(lái)說(shuō)，成本降低了約2/3。

5、本發(fā)明為我國(guó)PRRSV的臨床檢測(cè)提供了新手段，該試劑盒可用于種豬流通環(huán)節(jié)中PRRSV的檢驗(yàn)檢疫，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的PRRSV的疫情監(jiān)控、鑒別診斷以及疫病的凈化，為提升我國(guó)PRRSV的綜合防控水平提供了技術(shù)支撐。

附圖說(shuō)明

圖1：PRRSV多重RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果，注：M:DL2000 Marker；1-10： PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV普通株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬輪狀病毒（RV）及陰性對(duì)照（H₂O）。

圖2： PRRSV多重RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果，注：M:DL2000 Marker；1-7:384, 192, 96, 48, 24, 12, 6 copies/反應(yīng)。

圖3：PRRSV多重RT-PCR臨床檢測(cè)電泳圖，注：M:DL2000 Marker；1-4：PRRSV高致病性變異株、PRRSV高致病性疫苗株、PRRSV普通株及陰性對(duì)照（H₂O）。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

本發(fā)明研究過(guò)程中用到的病毒毒株包括：豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬輪狀病毒（RV）均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

病毒特異性引物設(shè)計(jì)：所述的病毒特異性引物，指的是根據(jù)GenBank公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒序列，在其N(xiāo)SP2基因保守序列區(qū)域及JXA1-R株與其它高致病性PRRSV毒株13380-13900 nt區(qū)域設(shè)計(jì)的與其基因高度保守區(qū)的特異性片段完全相同或者反向互補(bǔ)。

本發(fā)明所列的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向書(shū)寫(xiě)。

實(shí)施例1 PRRSV多重RT-PCR鑒別方法的特異性試驗(yàn)

用復(fù)合RT-PCR方法檢測(cè)6株其它豬源病毒毒株6份，1份PRRSV經(jīng)典株CH-1a，1份PRRSV高致病性變異株07HBEZ，1份PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R，以考查該方法檢測(cè)不同樣品的特異性。

1 病毒株

PRRSV經(jīng)典株：美洲型PRRSV國(guó)內(nèi)分離株CH-1a，由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所提供；PRRSV高致病性變異株：由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定的07HBEZ (GenBank ID: FJ495082.2)；PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R：購(gòu)自市售疫苗，經(jīng)Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)增殖后用于本發(fā)明；其它豬病病毒：豬瘟病毒 (CSFV)， 豬偽狂犬病毒(PRV)，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，豬細(xì)小病毒 (PPV)，豬日本乙型腦炎病毒 (JEV) 和豬輪狀病毒(RV)。

2 病毒培養(yǎng)

將凍存的美洲型PRRSV國(guó)內(nèi)分離株CH-1a和PRRSV高致病性變異株07HBEZ取出，加入適量含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后，接種于生長(zhǎng)良好的Marc145細(xì)胞單層，37℃吸附1h，加入含2％小牛血清的細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)3-5d，觀察細(xì)胞病變（CPE），待出現(xiàn)典型細(xì)胞病變達(dá)70％時(shí)收毒，-70℃保存?zhèn)溆茫籔RRSV高致病性疫苗株JXA1-R取自市售疫苗，無(wú)菌操作經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后按前述方法培養(yǎng)。其它病毒分別接種適應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

3 病毒RNA的提取

采用Trizol法提取，分別取美洲型PRRSV國(guó)內(nèi)分離株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及其它病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液各400μL，凍融2-3次，加800μL Trizol，室溫作用5 min；加入200μL氯仿，室溫作用10 min；4℃，12000 rpm，離心10 min；吸取上清液，加入等體積異丙醇，-20℃作用5 min；4℃，12000 rpm，離心10 min；棄上清液，加入1 mL75%乙醇，8000 rpm，離心5 min；棄乙醇，晾干，即得病毒基因組總RNA，立即反轉(zhuǎn)錄或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 陰性對(duì)照

取滅菌的DEPC水，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5 PRRSV復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法的操作程序

25 μL反應(yīng)體系，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 2 μL，上、下游引物（NSP2-F：5’-TGAYGGGCGACAATGTCC-3’；NSP2-R：5’-CGCAGACAAATCCAGAVG-3’；JXA1-F：5’-ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC-3’；JXA1-R：5’- CCGCTGAAACTCTGGTTAAAGG-3’）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板cDNA 2.5μL，用DEPC水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

6 電泳

稱(chēng)取1 g瓊脂糖放入500 mL錐形瓶中，加入1×TAE電泳緩沖液100 mL，于微波爐中熔解，再加入5 μL染色液混勻。在電泳槽模內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待完全凝固后取出置于電泳槽中，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL混合1 μL上樣緩沖液，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以80-120V電壓于1×TAE電泳緩沖液中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

7 結(jié)果判定

PRRSV普通株的目的條帶為319 bp，PRRSV高致病性變異株的目的條帶為229 bp，PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的目的條帶為229 bp 和610 bp、陰性對(duì)照無(wú)條帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

8 結(jié)果

用PRRSV復(fù)合RT-PCR方法檢測(cè)6株其它豬源病毒毒株，結(jié)果均為陰性，PRRSV經(jīng)典株CH-1a，PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）均擴(kuò)增出目的條帶，而陰性對(duì)照DEPC水未擴(kuò)增出任何目的帶（見(jiàn)圖1）。

實(shí)施例2 PRRSV多重RT-PCR鑒別方法的敏感性試驗(yàn)

用復(fù)合RT-PCR方法檢測(cè)不同含量的PRRSV經(jīng)典株CH-1a， PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R，以考查該方法檢的敏感性。

1 病毒

PRRSV經(jīng)典株CH-1a，PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R。

2 方法

將PRRSV經(jīng)典株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R分別稀釋為384, 192, 96, 48, 24, 12, 6 copies/反應(yīng)，提取RNA，按前述PRRSV復(fù)合RT-PCR擴(kuò)增每個(gè)稀釋度樣品。

3 結(jié)果

用PRRSV復(fù)合RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)不同稀釋度樣品的結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明該P(yáng)RRSV復(fù)合RT-PCR的敏感性為96 copies/反應(yīng)。

實(shí)施例3 應(yīng)用PRRSV復(fù)合RT-PCR方法檢測(cè)臨床樣品

分別檢測(cè)PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及PRRSV高致病性野毒株陽(yáng)性組織樣品各3份，同時(shí)重復(fù)檢測(cè)3次，并設(shè)雙蒸水作為陰性對(duì)照，以檢測(cè)該方法的穩(wěn)定性。

1 材料

PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及PRRSV高致病性野毒株陽(yáng)性組織樣品各3份。

2 方法

采用Trizol法分別提取PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV高致病性野毒株陽(yáng)性組織樣品的RNA，按前述復(fù)合RT-PCR擴(kuò)增每個(gè)樣品。

3 結(jié)果

PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV高致病性野毒株陽(yáng)性組織樣品的cDNA均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶，陰性對(duì)照無(wú)任何條帶產(chǎn)生（圖3），說(shuō)明該鑒別診斷方法穩(wěn)定性好，可直接應(yīng)用于臨床。

<<110>湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一種鑒別PRRSV的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒

<160>4

<210>1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaygggcga caatgtcc 18

<210> 2

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcagacaaa tccagavg 18

<210> 3

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atttgaatgt tcgcacggtc tc 22

<210> 4

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctgaaac tctggttaaa gg 22