本發(fā)明涉及一種菌種的富集培養(yǎng)方法,特別是涉及一種銅綠假單胞菌的高效富集培養(yǎng)方法。
背景技術(shù):
銅綠假單胞菌是自然界分布最廣泛的細(xì)菌之一,廣泛存在于土壤、水、空氣和人體呼吸道及腸道內(nèi),是環(huán)境污染和醫(yī)學(xué)研究中經(jīng)常使用的代表性菌株。在科研工作中,傳統(tǒng)的銅綠假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)方法都是采用搖床震蕩培養(yǎng),這種培養(yǎng)方式具有以下缺點(diǎn):1)碳源供應(yīng)與菌種生長(zhǎng)速度不匹配。由于搖床震蕩培養(yǎng)屬于批式培養(yǎng),營(yíng)養(yǎng)液一次性加入,這就造成培養(yǎng)初期鞏固由于細(xì)菌量較少,碳源供應(yīng)過(guò)量;而在培養(yǎng)后期,細(xì)菌大量增長(zhǎng)導(dǎo)致碳源不足,致使細(xì)菌增殖速度降低甚至停止。
現(xiàn)有技術(shù)的搖床震蕩培養(yǎng)采用的培養(yǎng)瓶體積較小(一般250-300ml),一次性培養(yǎng)出的細(xì)菌量非常有限,當(dāng)細(xì)菌需求量較大時(shí)往往需要采用多臺(tái)搖床和大量培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)過(guò)程非常繁瑣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種銅綠假單胞菌的高效富集培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
一種銅綠假單胞菌的高效培養(yǎng)富集方法,包括如下步驟:
1)使用連續(xù)培養(yǎng)富集裝置,所述裝置包括高位水箱1和培養(yǎng)富集器2,高位水箱的頂壁內(nèi)表面設(shè)置有紫外滅菌燈3,在高位水箱的頂壁上設(shè)置有第一透氣孔4和加料孔10,脫脂棉與第一透氣孔活動(dòng)連接,所述培養(yǎng)富集器包括培養(yǎng)富集器本體5,培養(yǎng)富集器本體的中上部呈圓筒狀,下部呈漏斗狀,圓筒狀部分的徑深比為1:3.5-4,培養(yǎng)富集器本體的頂壁上設(shè)置有第二透氣孔6和菌種加入口11,脫脂棉與第二透氣孔活動(dòng)連接,在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的7/8-9/10的位置設(shè)置有高液位傳感器,在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的3/5-2/3位置設(shè)置有低液位傳感器,在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)部設(shè)置有管式超濾膜組件7,管式超濾膜組件的出口通過(guò)管道與設(shè)置在培養(yǎng)富集器本體外的泵8連接,培養(yǎng)富集器本體的底部設(shè)置有濃菌液收集口9,高位水箱的底部通過(guò)管道與培養(yǎng)富集器本體的底部的切向進(jìn)入口連接;高位水箱的底部與培養(yǎng)富集器本體頂部之間的高度差≧2米;高液位傳感器、低液位傳感器、營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12和泵8分別通過(guò)導(dǎo)線與自動(dòng)控制系統(tǒng)連接;
2)用無(wú)菌水作溶劑配制含胰蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液,加入到高位水箱1中;
3)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12打開(kāi),高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速2-3m/s,以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中,使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌;將銅綠假單胞菌從菌種加入口11加入到培養(yǎng)富集器本體內(nèi),使所述菌株與營(yíng)養(yǎng)液混合并增殖,當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí),營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉,控制泵8以膜通量=15-20L/m2·h的抽吸流速,使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后,經(jīng)泵排出,當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí),泵停止;
4)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)打開(kāi);高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速2-3m/s,以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中,使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌;當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí),營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉,控制泵8以膜通量=15-20L/m2·h的抽吸流速,使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后,經(jīng)泵排出,當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí),泵停止;
5)重復(fù)步驟4),菌株培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選40-50小時(shí);
6)培養(yǎng)富集后的銅綠假單胞菌被截留在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)并沉積在培養(yǎng)富集器本體漏斗狀部,經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集。
優(yōu)選的:營(yíng)養(yǎng)液中胰蛋白胨的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L。
本發(fā)明中碳源(營(yíng)養(yǎng)液)是連續(xù)補(bǔ)入和排出的,保證了培養(yǎng)器內(nèi)菌株始終處于碳源充足狀態(tài),細(xì)菌能夠一直保持高速生長(zhǎng);代謝產(chǎn)物大量累積會(huì)抑制細(xì)菌活性,本發(fā)明及時(shí)排出菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液,不存在代謝產(chǎn)物過(guò)度累積問(wèn)題,細(xì)菌能夠一直保持較好的活性和增殖速度;本發(fā)明的方法中采用的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置可以根據(jù)需要的細(xì)菌量靈活調(diào)整,即使細(xì)菌量需求較大時(shí)一套培養(yǎng)裝置也完全可以滿足需求。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明的方法采用的一種連續(xù)培養(yǎng)富集裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明的方法與搖床震蕩培養(yǎng)下銅綠假單胞菌的增殖速度對(duì)比。
圖3為本發(fā)明的方法與搖床震蕩培養(yǎng)下菌液濃度對(duì)比。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明各實(shí)施例使用的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC NO:1.10452;購(gòu)買(mǎi)于:中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;購(gòu)買(mǎi)時(shí)間:2015年12月16日;聯(lián)系方式:010-64807355。
本發(fā)明以上述菌株為例,是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明,但并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制,其它的銅綠假單胞菌菌株也可以用于本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1
一種銅綠假單胞菌的高效培養(yǎng)富集方法,包括如下步驟:
1)使用連續(xù)培養(yǎng)富集裝置,所述裝置包括高位水箱1和培養(yǎng)富集器2,高位水箱的頂壁內(nèi)表面設(shè)置有紫外滅菌燈3,在高位水箱的頂壁上設(shè)置有第一透氣孔4和加料孔10,脫脂棉與第一透氣孔活動(dòng)連接,所述培養(yǎng)富集器包括培養(yǎng)富集器本體5,培養(yǎng)富集器本體的中上部呈圓筒狀,下部呈漏斗狀,圓筒狀部分的徑深比為1:3.5,培養(yǎng)富集器本體的頂壁上設(shè)置有第二透氣孔6和菌種加入口11,脫脂棉與第二透氣孔活動(dòng)連接,在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的7/8的位置設(shè)置有高液位傳感器,在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的2/3位置設(shè)置有低液位傳感器,在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)部設(shè)置有管式超濾膜組件7,管式超濾膜組件的出口通過(guò)管道與設(shè)置在培養(yǎng)富集器本體外的泵8連接,培養(yǎng)富集器本體的底部設(shè)置有濃菌液收集口9,高位水箱的底部通過(guò)管道與培養(yǎng)富集器本體的底部的切向進(jìn)入口連接;高位水箱的底部與培養(yǎng)富集器本體頂部之間的高度差=2米;高液位傳感器、低液位傳感器、營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12和泵8分別通過(guò)導(dǎo)線與自動(dòng)控制系統(tǒng)連接;
2)用無(wú)菌水作溶劑配制含胰蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液,加入到高位水箱1中;營(yíng)養(yǎng)液中胰蛋白胨的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L;
3)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12打開(kāi),高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速3m/s,以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中,使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌;將銅綠假單胞菌從菌種加入口11加入到培養(yǎng)富集器本體內(nèi),使所述菌株與營(yíng)養(yǎng)液混合并增殖,當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí),營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉,控制泵8以膜通量=20L/m2·h的抽吸流速,使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后,經(jīng)泵排出,當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí),泵停止;
4)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)打開(kāi);高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速3m/s,以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中,使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌;當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí),營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉,控制泵8以膜通量=20L/m2·h的抽吸流速,使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后,經(jīng)泵排出,當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí),泵停止;
5)重復(fù)步驟4),菌株培養(yǎng)時(shí)間40小時(shí);
6)培養(yǎng)富集后的銅綠假單胞菌被截留在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)并沉積在培養(yǎng)富集器本體漏斗狀部,經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集。
實(shí)施例2
一種銅綠假單胞菌的高效培養(yǎng)富集方法,包括如下步驟:
1)使用連續(xù)培養(yǎng)富集裝置,除圓筒狀部分的徑深比為1:4;在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的9/10的位置設(shè)置有高液位傳感器,在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的3/5位置設(shè)置有低液位傳感器,高位水箱的底部與培養(yǎng)富集器本體頂部之間的高度差=2.5米,其它部分同實(shí)施例1的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置;
2)用無(wú)菌水作溶劑配制含胰蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液,加入到高位水箱1中;營(yíng)養(yǎng)液中胰蛋白胨的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L;
3)除高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液的流速2m/s,泵8的膜通量=15L/m2·h的抽吸流速外,其它同實(shí)施例1的步驟3);
4)除高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液的流速2m/s,泵8的膜通量=15L/m2·h的抽吸流速外,其它同實(shí)施例1的步驟4);
5)重復(fù)步驟4),菌株培養(yǎng)時(shí)間50小時(shí);
6)培養(yǎng)富集后的銅綠假單胞菌被截留在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)并沉積在培養(yǎng)富集器本體漏斗狀部,經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集。
對(duì)比
取相同菌密度的銅綠假單胞菌(CGMCC NO:1.10452)菌液各5ml,分別加入搖床震蕩培養(yǎng)瓶和實(shí)施例1步驟1)的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置,配制的營(yíng)養(yǎng)液組分濃度為:胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化鈉10g/L。
搖床震蕩培養(yǎng)瓶中營(yíng)養(yǎng)液為一次性加入,兩者均培養(yǎng)40h,
培養(yǎng)期間每隔一段時(shí)間以脂磷法同時(shí)測(cè)定搖床震蕩培養(yǎng)瓶和實(shí)施例1步驟(1)中的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置中銅綠假單胞菌總量,測(cè)定結(jié)果如圖2所示。
測(cè)定結(jié)果證明,本發(fā)明的培養(yǎng)方法能夠使銅綠假單胞菌在培養(yǎng)期間一直保持著指數(shù)增長(zhǎng),而搖床震蕩培養(yǎng)由于后期營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足和代謝產(chǎn)物累積致使菌群很快從指數(shù)增長(zhǎng)轉(zhuǎn)為靜止期。
培養(yǎng)40h,以脂磷法同時(shí)測(cè)定搖床震蕩培養(yǎng)瓶中銅綠假單胞菌總量和實(shí)施例1經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集的銅綠假單胞菌總量(見(jiàn)圖3,其中1為搖床震蕩培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌,2為實(shí)施例1方法獲得的銅綠假單胞菌),經(jīng)測(cè)定,實(shí)施例1的方法獲得的銅綠假單胞菌總量是搖床震蕩培養(yǎng)瓶的2.8倍。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出,通過(guò)本發(fā)明可以連續(xù)、方便的獲得大量高活性、高濃度的銅綠假單胞菌液。