本發(fā)明涉及一種菌種的富集培養(yǎng)方法，特別是涉及一種銅綠假單胞菌的高效富集培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

銅綠假單胞菌是自然界分布最廣泛的細(xì)菌之一，廣泛存在于土壤、水、空氣和人體呼吸道及腸道內(nèi)，是環(huán)境污染和醫(yī)學(xué)研究中經(jīng)常使用的代表性菌株。在科研工作中，傳統(tǒng)的銅綠假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)方法都是采用搖床震蕩培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式具有以下缺點(diǎn)：1)碳源供應(yīng)與菌種生長(zhǎng)速度不匹配。由于搖床震蕩培養(yǎng)屬于批式培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液一次性加入，這就造成培養(yǎng)初期鞏固由于細(xì)菌量較少，碳源供應(yīng)過(guò)量；而在培養(yǎng)后期，細(xì)菌大量增長(zhǎng)導(dǎo)致碳源不足，致使細(xì)菌增殖速度降低甚至停止。

現(xiàn)有技術(shù)的搖床震蕩培養(yǎng)采用的培養(yǎng)瓶體積較小(一般250-300ml)，一次性培養(yǎng)出的細(xì)菌量非常有限，當(dāng)細(xì)菌需求量較大時(shí)往往需要采用多臺(tái)搖床和大量培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過(guò)程非常繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種銅綠假單胞菌的高效富集培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種銅綠假單胞菌的高效培養(yǎng)富集方法，包括如下步驟：

1)使用連續(xù)培養(yǎng)富集裝置，所述裝置包括高位水箱1和培養(yǎng)富集器2，高位水箱的頂壁內(nèi)表面設(shè)置有紫外滅菌燈3，在高位水箱的頂壁上設(shè)置有第一透氣孔4和加料孔10，脫脂棉與第一透氣孔活動(dòng)連接，所述培養(yǎng)富集器包括培養(yǎng)富集器本體5，培養(yǎng)富集器本體的中上部呈圓筒狀，下部呈漏斗狀，圓筒狀部分的徑深比為1:3.5-4，培養(yǎng)富集器本體的頂壁上設(shè)置有第二透氣孔6和菌種加入口11，脫脂棉與第二透氣孔活動(dòng)連接，在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的7/8-9/10的位置設(shè)置有高液位傳感器，在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的3/5-2/3位置設(shè)置有低液位傳感器，在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)部設(shè)置有管式超濾膜組件7，管式超濾膜組件的出口通過(guò)管道與設(shè)置在培養(yǎng)富集器本體外的泵8連接，培養(yǎng)富集器本體的底部設(shè)置有濃菌液收集口9，高位水箱的底部通過(guò)管道與培養(yǎng)富集器本體的底部的切向進(jìn)入口連接；高位水箱的底部與培養(yǎng)富集器本體頂部之間的高度差≧2米；高液位傳感器、低液位傳感器、營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12和泵8分別通過(guò)導(dǎo)線與自動(dòng)控制系統(tǒng)連接；

2)用無(wú)菌水作溶劑配制含胰蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液,加入到高位水箱1中；

3)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12打開(kāi)，高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速2-3m/s，以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中，使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌；將銅綠假單胞菌從菌種加入口11加入到培養(yǎng)富集器本體內(nèi)，使所述菌株與營(yíng)養(yǎng)液混合并增殖，當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉，控制泵8以膜通量＝15-20L/m²·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后，經(jīng)泵排出，當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí)，泵停止；

4)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)打開(kāi)；高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速2-3m/s，以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中，使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌；當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉，控制泵8以膜通量＝15-20L/m²·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后，經(jīng)泵排出，當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí)，泵停止；

5)重復(fù)步驟4)，菌株培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選40-50小時(shí)；

6)培養(yǎng)富集后的銅綠假單胞菌被截留在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)并沉積在培養(yǎng)富集器本體漏斗狀部，經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集。

優(yōu)選的：營(yíng)養(yǎng)液中胰蛋白胨的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L。

本發(fā)明中碳源(營(yíng)養(yǎng)液)是連續(xù)補(bǔ)入和排出的，保證了培養(yǎng)器內(nèi)菌株始終處于碳源充足狀態(tài)，細(xì)菌能夠一直保持高速生長(zhǎng)；代謝產(chǎn)物大量累積會(huì)抑制細(xì)菌活性，本發(fā)明及時(shí)排出菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液，不存在代謝產(chǎn)物過(guò)度累積問(wèn)題，細(xì)菌能夠一直保持較好的活性和增殖速度；本發(fā)明的方法中采用的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置可以根據(jù)需要的細(xì)菌量靈活調(diào)整，即使細(xì)菌量需求較大時(shí)一套培養(yǎng)裝置也完全可以滿足需求。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的方法采用的一種連續(xù)培養(yǎng)富集裝置結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明的方法與搖床震蕩培養(yǎng)下銅綠假單胞菌的增殖速度對(duì)比。

圖3為本發(fā)明的方法與搖床震蕩培養(yǎng)下菌液濃度對(duì)比。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明各實(shí)施例使用的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC NO：1.10452；購(gòu)買(mǎi)于：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；購(gòu)買(mǎi)時(shí)間：2015年12月16日；聯(lián)系方式：010-64807355。

本發(fā)明以上述菌株為例，是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，其它的銅綠假單胞菌菌株也可以用于本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

一種銅綠假單胞菌的高效培養(yǎng)富集方法，包括如下步驟：

1)使用連續(xù)培養(yǎng)富集裝置，所述裝置包括高位水箱1和培養(yǎng)富集器2，高位水箱的頂壁內(nèi)表面設(shè)置有紫外滅菌燈3，在高位水箱的頂壁上設(shè)置有第一透氣孔4和加料孔10，脫脂棉與第一透氣孔活動(dòng)連接，所述培養(yǎng)富集器包括培養(yǎng)富集器本體5，培養(yǎng)富集器本體的中上部呈圓筒狀，下部呈漏斗狀，圓筒狀部分的徑深比為1:3.5，培養(yǎng)富集器本體的頂壁上設(shè)置有第二透氣孔6和菌種加入口11，脫脂棉與第二透氣孔活動(dòng)連接，在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的7/8的位置設(shè)置有高液位傳感器，在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的2/3位置設(shè)置有低液位傳感器，在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)部設(shè)置有管式超濾膜組件7，管式超濾膜組件的出口通過(guò)管道與設(shè)置在培養(yǎng)富集器本體外的泵8連接，培養(yǎng)富集器本體的底部設(shè)置有濃菌液收集口9，高位水箱的底部通過(guò)管道與培養(yǎng)富集器本體的底部的切向進(jìn)入口連接；高位水箱的底部與培養(yǎng)富集器本體頂部之間的高度差＝2米；高液位傳感器、低液位傳感器、營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12和泵8分別通過(guò)導(dǎo)線與自動(dòng)控制系統(tǒng)連接；

2)用無(wú)菌水作溶劑配制含胰蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液,加入到高位水箱1中；營(yíng)養(yǎng)液中胰蛋白胨的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L；

3)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)12打開(kāi)，高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速3m/s，以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中，使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌；將銅綠假單胞菌從菌種加入口11加入到培養(yǎng)富集器本體內(nèi)，使所述菌株與營(yíng)養(yǎng)液混合并增殖，當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉，控制泵8以膜通量＝20L/m²·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后，經(jīng)泵排出，當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí)，泵停止；

4)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)打開(kāi)；高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液以流速3m/s，以重力流方式切向進(jìn)入培養(yǎng)富集器本體5中，使?fàn)I養(yǎng)液形成水力旋流攪拌；當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到高液位時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)液閥門(mén)關(guān)閉，控制泵8以膜通量＝20L/m²·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物和廢棄的營(yíng)養(yǎng)液一起經(jīng)管式超濾膜組件后，經(jīng)泵排出，當(dāng)培養(yǎng)富集器本體內(nèi)液位達(dá)到低液位時(shí)，泵停止；

5)重復(fù)步驟4)，菌株培養(yǎng)時(shí)間40小時(shí)；

6)培養(yǎng)富集后的銅綠假單胞菌被截留在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)并沉積在培養(yǎng)富集器本體漏斗狀部，經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集。

實(shí)施例2

一種銅綠假單胞菌的高效培養(yǎng)富集方法，包括如下步驟：

1)使用連續(xù)培養(yǎng)富集裝置，除圓筒狀部分的徑深比為1:4；在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的9/10的位置設(shè)置有高液位傳感器，在培養(yǎng)富集器本體圓筒狀部分高的3/5位置設(shè)置有低液位傳感器，高位水箱的底部與培養(yǎng)富集器本體頂部之間的高度差＝2.5米，其它部分同實(shí)施例1的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置；

2)用無(wú)菌水作溶劑配制含胰蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液,加入到高位水箱1中；營(yíng)養(yǎng)液中胰蛋白胨的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L；

3)除高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液的流速2m/s，泵8的膜通量＝15L/m²·h的抽吸流速外，其它同實(shí)施例1的步驟3)；

4)除高位水箱中的營(yíng)養(yǎng)液的流速2m/s，泵8的膜通量＝15L/m²·h的抽吸流速外，其它同實(shí)施例1的步驟4)；

5)重復(fù)步驟4)，菌株培養(yǎng)時(shí)間50小時(shí)；

6)培養(yǎng)富集后的銅綠假單胞菌被截留在培養(yǎng)富集器本體內(nèi)并沉積在培養(yǎng)富集器本體漏斗狀部，經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集。

對(duì)比

取相同菌密度的銅綠假單胞菌(CGMCC NO：1.10452)菌液各5ml，分別加入搖床震蕩培養(yǎng)瓶和實(shí)施例1步驟1)的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置，配制的營(yíng)養(yǎng)液組分濃度為：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化鈉10g/L。

搖床震蕩培養(yǎng)瓶中營(yíng)養(yǎng)液為一次性加入，兩者均培養(yǎng)40h，

培養(yǎng)期間每隔一段時(shí)間以脂磷法同時(shí)測(cè)定搖床震蕩培養(yǎng)瓶和實(shí)施例1步驟(1)中的連續(xù)培養(yǎng)富集裝置中銅綠假單胞菌總量，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

測(cè)定結(jié)果證明，本發(fā)明的培養(yǎng)方法能夠使銅綠假單胞菌在培養(yǎng)期間一直保持著指數(shù)增長(zhǎng)，而搖床震蕩培養(yǎng)由于后期營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足和代謝產(chǎn)物累積致使菌群很快從指數(shù)增長(zhǎng)轉(zhuǎn)為靜止期。

培養(yǎng)40h，以脂磷法同時(shí)測(cè)定搖床震蕩培養(yǎng)瓶中銅綠假單胞菌總量和實(shí)施例1經(jīng)濃菌液收集口9排出并收集的銅綠假單胞菌總量(見(jiàn)圖3，其中1為搖床震蕩培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌，2為實(shí)施例1方法獲得的銅綠假單胞菌)，經(jīng)測(cè)定，實(shí)施例1的方法獲得的銅綠假單胞菌總量是搖床震蕩培養(yǎng)瓶的2.8倍。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，通過(guò)本發(fā)明可以連續(xù)、方便的獲得大量高活性、高濃度的銅綠假單胞菌液。