一種產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用，所述銅綠假單胞菌于2016年03月07日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12185；所述產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的物質(zhì)，包括以下步驟：1)準(zhǔn)備液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基；2)取銅綠假單胞菌菌種和含角蛋白的物質(zhì)，添加至步驟1)中制得的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，所述銅綠假單胞菌菌種的菌齡為t，4h≤t≤24h，所述銅綠假單胞菌菌種在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的接種量為a，0.5％≤a≤5％，在轉(zhuǎn)速為150～220rpm，溫度為27～47℃的條件下發(fā)酵，使含角蛋白的物質(zhì)降解；該銅綠假單胞菌在以羽毛為唯一碳氮源的液體培養(yǎng)基中可以高效降解角蛋白。CGMCCNo.1218520160307
【專利說明】
一種產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物菌株及應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羽毛是重要的蛋白質(zhì)資源，其蛋白含量高達(dá)85-90%。但由于其主要成分角蛋白是 一種具有極強(qiáng)抗性、難生物降解的硬蛋白，難以直接利用，而傳統(tǒng)的物理和化學(xué)加工方法： 高溫高壓、酸堿處理等不僅消耗大量能源還引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。目前我國養(yǎng)殖業(yè)中 每年產(chǎn)生的羽毛廢棄物達(dá)到百萬余噸，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，這數(shù)量還在持續(xù)增長， 實(shí)現(xiàn)廢棄資源的高值轉(zhuǎn)化和循環(huán)利用已是必然選擇。研究角蛋白資源的轉(zhuǎn)化及應(yīng)用，對(duì)含 有羽毛、毛發(fā)等角蛋白成分的養(yǎng)殖業(yè)廢棄物的無害轉(zhuǎn)化以及對(duì)和角蛋白有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì) 的轉(zhuǎn)化均具有重要理論價(jià)值和創(chuàng)新意義。其中，角蛋白酶(keratinase)是一種主要由真菌、 放線菌、細(xì)菌等微生物產(chǎn)生，可特異降解角蛋白的蛋白酶。利用自然界中微生物分泌的角蛋 白酶特異性地消化羽毛等角蛋白，將角蛋白直接轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)或復(fù)合氨基酸，以作為一種 飼科蛋白質(zhì)應(yīng)用于畜禽的飼養(yǎng)，從而變廢為寶，既能保護(hù)環(huán)境又利用資源，這也將具有十分 顯著的經(jīng)濟(jì)效益和深遠(yuǎn)的社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa，該銅綠假單胞菌在以羽毛為唯一碳氮源的液體培養(yǎng)基中可以 高效降解角蛋白。
[0004] 實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:所述銅綠假單胞菌，分類命名為銅綠假 單胞菌Pseudomonas aeruginosa，于2016年03月07日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心(簡稱中國普通微生物菌種保藏管理中心），保藏單位的地址為北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 12185,所述銅綠假單胞菌的菌體細(xì)胞為短 桿狀，有鞭毛，無芽孢，無莢膜，革蘭氏染色為陰性;菌體在牛奶平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，菌 落形狀不規(guī)則，表面粗糙，邊緣模糊，產(chǎn)生透明降解圈，產(chǎn)生綠色熒光色素。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，將該菌接種于 改進(jìn)的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵并產(chǎn)生角蛋白酶，提高了菌株降解含角蛋白的物質(zhì)的效 率。
[0006] 實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:利用所述產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌 降解含角蛋白的物質(zhì)。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的 物質(zhì)，包括以下步驟：
[0008] 1)準(zhǔn)備液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基；
[0009] 2)取銅綠假單胞菌菌種和含角蛋白的物質(zhì)，添加至步驟1)中制得的液體無機(jī)鹽培 養(yǎng)基中，所述銅綠假單胞菌菌種的菌齡為t，4h<t<24h，所述銅綠假單胞菌菌種在液體無 機(jī)鹽培養(yǎng)基中的接種量為a，0.5%彡a彡5%，在轉(zhuǎn)速為150~220rpm，溫度為27~47°C的條 件下發(fā)酵12~120h，使含角蛋白的物質(zhì)降解；
[0010] 當(dāng)銅綠假單胞菌菌種的菌齡在4~24h，可以保證菌株具有較強(qiáng)的活性，有利于產(chǎn) 生角蛋白酶。
[0011] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案：步驟1)中，所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基按濃度計(jì)包括 以下組分： K2HPO4 lg/L, Mg2SCV 7H20 〇.5g/L;
[0012] Had ().5g/L; FeSO4 ·7Η20 0.01g/L; 羽毛 丨Og/L;
[0013] 其中，所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH為4~11。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH= 11。
[0015] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述銅綠假單胞菌菌種的菌齡為t，t = 12h;當(dāng)菌 種的菌齡為12h時(shí)，銅綠假單胞菌菌株的活性好，接種于液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中使得角蛋白的 降解率最高，其次是菌齡為16h時(shí)。
[0016] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述銅綠假單胞菌菌種在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的 接種量為a，a = 2%。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:步驟2)中，所述發(fā)酵的溫度為37°C。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 1、本發(fā)明利用銅綠假單胞菌降解多種含角蛋白的廢棄物，提供了更靈活更環(huán)保的 生物降解角蛋白廢棄物的方式；
[0020] 2、本發(fā)明的銅綠假單胞菌在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵后，對(duì)角蛋白的降解率高， 可直接應(yīng)用于降解整根羽毛，無需對(duì)羽毛進(jìn)行預(yù)處理；
[0021] 3、本發(fā)明的銅綠假單胞菌對(duì)于含角蛋白的物質(zhì)的降解條件簡單，可以以羽毛為唯 一碳、氮源進(jìn)行發(fā)酵，無需添加葡萄糖和酵母粉等有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，所產(chǎn)角蛋白酶活性高，穩(wěn) 定性好。
【附圖說明】：
[0022]本發(fā)明涉及的銅綠假單胞菌，分類命名為銅綠假單胞菌Pseudo monas aeruginosa，于2016年03月07日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (簡稱中國普通微生物菌種保藏管理中心），保藏編號(hào)為CGMCC No. 12185; 圖1為實(shí)施例1菌株的電鏡圖；
[0023]圖2為實(shí)施例1菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0024]圖3為實(shí)施例2不同pH對(duì)羽毛的降解率的曲線圖；
[0025] 圖4為實(shí)施例2不同溫度對(duì)羽毛的降解率的曲線圖；
[0026] 圖5為實(shí)施例3不同菌齡對(duì)羽毛的降解率的曲線圖；
[0027] 圖6為實(shí)施例4不同接種量對(duì)羽毛的降解率的曲線圖；
[0028] 圖7為實(shí)施例5不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)羽毛的降解率及發(fā)酵上清液角蛋白酶活性的曲線 圖；
[0029] 圖8為實(shí)施例6中對(duì)照組(CK)的羽毛降解狀態(tài)圖；
[0030] 圖9為經(jīng)實(shí)施例6處理的羽毛降解狀態(tài)圖；
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0032] 所述產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的物質(zhì)，包括以下步驟：
[0033] 1)準(zhǔn)備液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基；
[0034] 所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基按濃度計(jì)包括以下組分： K2HPO4 lg/L; Mg2SO4WH2O 0.5g/L;
[0035] NaCl 0.5g/L; FeSO4* TH2O 0.01g/L; 羽毛 lOg/L;
[0036] 其中，所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH為4~11。
[0037] 2)取銅綠假單胞菌菌種和含角蛋白的物質(zhì)，添加至步驟1)中制得的液體無機(jī)鹽培 養(yǎng)基中，所述銅綠假單胞菌菌種的菌齡為t，4h<t<24h，所述銅綠假單胞菌菌種在液體無 機(jī)鹽培養(yǎng)基中的接種量為a，0.5%彡a彡5%，在轉(zhuǎn)速為150~220rpm，溫度為27~47°C的條 件下發(fā)酵12~120h，使含角蛋白的物質(zhì)降解；
[0038] 3)在步驟2)進(jìn)行24h后取液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液，對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行角 蛋白酶酶活測(cè)定，以每mL發(fā)酵上清液在規(guī)定條件下反應(yīng)15min后OD值增加0.01為1個(gè)酶活單 位，測(cè)定包括以下步驟：
[0039] I)配制W/V為1/160的偶氮蛋白的磷酸緩沖液，磷酸緩沖液pH=7.4;
[0040] Π )取3.2mL偶氮蛋白的磷酸緩沖液，置于37°C水浴中預(yù)熱2min;
[0041] ΙΠ )取發(fā)酵上清液0.8mL，加入步驟Π )中的偶氮蛋白的磷酸緩沖液中，然后37°C水 浴中反應(yīng)15min，獲得混合液；
[0042] IV)在步驟ΙΠ )得到的混合液中加入0.8mL 10 %的三氯乙酸，終止酶反應(yīng)，獲得反 應(yīng)液；
[0043] V )將步驟IV)中獲得的反應(yīng)液于轉(zhuǎn)速為1000 Orpm的條件下離心6min，并在450nm 下測(cè)定吸光值；
[0044] VI)制備空白對(duì)照:在通過步驟Π )獲得的磷酸緩沖液中，先加入0.8mL10%的三氯 乙酸，再加入發(fā)酵上清液〇. SmL，得到空白對(duì)照。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 實(shí)施例1用于說明菌種的篩選及鑒定過程：
[0047] 一、產(chǎn)角蛋白酶的菌種篩選方法：
[0048] 1) 土壤樣品采自廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司某雞場(chǎng)；
[0049] 2)將采集的樣品置于無菌蒸餾水中混勻，靜置后取上清液，按10-6、10- 7、10-8進(jìn)行 梯度稀釋后，分別涂布于含牛奶的瓊脂平板培養(yǎng)基上；然后置于37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng) 24h；
[0050] 3)在瓊脂平板培養(yǎng)基上挑選能產(chǎn)生透明降解圈的單個(gè)菌落，接種于含羽毛的液體 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度37°C，180rpm的條件下震蕩培養(yǎng)72h，獲得菌株培養(yǎng)液;最后挑選羽 毛降解明顯的菌株培養(yǎng)液，接種至新的含羽毛的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩培養(yǎng)；
[0051] 4)將復(fù)篩得到的菌株接種于含有一根完整羽毛和50mL無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)液的錐形 瓶中，在溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)48h，觀察羽毛的降解情況，篩選出羽毛降 解能力較強(qiáng)的菌株，保種備用；
[0052]其中牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基包括以下組分:氯化鈉 10g，瓊脂粉20g，脫脂奶粉5g，雙 蒸水1L。
[0053]二、產(chǎn)角蛋白酶的菌株形態(tài)及生理生化鑒定：
[0054] 1)將菌種分離純化，然后劃線接種瓊脂平板培養(yǎng)基，溫度為37°C的條件下培養(yǎng) 24h;通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體的形態(tài)，電鏡下的菌體形態(tài)如圖1所不:短 桿狀，有鞭毛，無芽孢，無莢膜，革蘭氏染色為陰性；
[0055] 2)將菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定，其生理生化特征見表1:
[0056] 表1菌株的生理生化特征
[0059] 注:+ :陽性;陰性
[0060] 目的菌株能夠水解牛奶、明膠，具有角蛋白酶活性;能利用檸檬酸鹽;硝酸還原測(cè) 定為陰性。
[0061 ] 三、菌株16S rDNA鑒定：
[0062] 設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA序列，并送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序； [0063] PCR反應(yīng)的擴(kuò)增引物：
[0065] 反應(yīng)體系： LUUO/」
[0068] 反應(yīng)條件：
[0070] 獲得的菌株的16S rDNA序列如下所示：
[0071] TGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTG GTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACC TCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTG GTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG GACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGG GAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTG GATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAAT TTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGAC ACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCC GTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC TGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACG AGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCG GGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACG GCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACC GATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCAC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTA ACCGCAA；
[0072] 該序列記錄在序列表SEQ No. 1中。
[0073]四、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：
[0074] 經(jīng)GenBank核酸數(shù)據(jù)庫與已知菌群的16S rDNA基因序列比對(duì)分析，調(diào)出與其序列 同源性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列，計(jì)算目的菌株的核苷酸序列及其同源序列的遺傳 距離，用鄰接法(Neighbo r-joining)推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示；
[0075] 五、通過菌體的形態(tài)特征觀察、菌株生理生化測(cè)定、16S rDNA擴(kuò)增序列和構(gòu)建系統(tǒng) 發(fā)育樹，鑒定菌株為銅綠假單胞菌。
[0076] 實(shí)施例2
[0077] 實(shí)施例2用于說明產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌對(duì)角蛋白的降解條件：
[0078] 1)按梯度配制pH為4~11的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基各50mL;
[0079] 2)在步驟1)中制得的每一個(gè)液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加銅綠假單胞菌菌種0.5mL和 羽毛〇.5g，在轉(zhuǎn)速為220rpm，溫度為37°C的條件下發(fā)酵24h后，通過失重法檢測(cè)羽毛的降解 率；
[0080] 3)不同pH對(duì)羽毛的降解率如圖3所示：結(jié)果顯示，當(dāng)液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的PH=Il 時(shí)，羽毛的降解率最尚；
[0081] 4)取銅綠假單胞菌菌種，添加至PH=Il的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為220rpm， 分別在27 °C、32 °C、37 °C、42 °C和47 °C的溫度條件下發(fā)酵24h，然后通過失重法檢測(cè)羽毛的降 解率；
[0082] 5)不同溫度對(duì)羽毛的降解率如圖4所示：結(jié)果顯示，溫度為37°C時(shí)，羽毛的降解率 最尚。
[0083] 實(shí)施例3
[0084] 實(shí)施例3用于說明銅綠假單胞菌菌齡對(duì)角蛋白降解率的影響：
[0085]分別將菌齡為處、811、1211、1611、2011和2411的銅綠假單胞菌菌種接入液體無機(jī)鹽培 養(yǎng)基，菌種的接種量為1%，在羽毛濃度為10g/L，pH=ll，溫度為37°C的條件下發(fā)酵24h;羽 毛的降解率如圖5所示：當(dāng)菌齡為12h時(shí)，羽毛的降解率最高，其次是菌齡為16h時(shí)；12h之前， 隨著菌齡的增加，銅綠假單胞菌菌株的活性逐漸提高，羽毛的降解率亦隨之升高；16h之后， 羽毛的降解率隨著菌齡的增加而迅速下降。
[0086] 實(shí)施例4
[0087] 實(shí)施例4用于說明液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的接種量對(duì)角蛋白降解率的影響：
[0088]配制接種量分別為0.5%、1%、2%、5%的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在羽毛濃度為IOg/ UpH=Il，溫度為37°C的條件下發(fā)酵24h;羽毛的降解率如圖6所示：當(dāng)接種量為2%時(shí)，羽毛 的降解率最高；當(dāng)接種量< 2 %時(shí)，羽毛的降解率隨接種量的增加而增加；當(dāng)接種量> 2 % 時(shí)，羽毛的降解率反而降低；即使在不同接種量的條件下發(fā)酵24h，羽毛的降解率均能達(dá)到 50%以上。
[0089] 實(shí)施例5
[0090] 實(shí)施例5用于說明發(fā)酵時(shí)間對(duì)角蛋白降解率和發(fā)酵上清液中角蛋白酶活性的影 響：
[0091] 配制接種量為2%、羽毛濃度為10g/L的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在?!1=11，溫度為371€ 的條件下發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間為12h、24h、48h、72h、96h、120h時(shí)羽毛的降解率及發(fā)酵上清液 中角蛋白酶的活性，結(jié)果如圖7所示：在48h之前，羽毛的降解率隨著時(shí)間的增加而迅速增 加;48h時(shí)羽毛的降解率達(dá)到85.7 % ; 48h之后，羽毛的降解率趨于平緩；120h時(shí)，羽毛的降解 率達(dá)到93.5 % ;而發(fā)酵上清液中角蛋白酶的活性，在24h內(nèi)迅速升高，24~48h內(nèi)緩慢升高， 48h時(shí)酶活達(dá)到60.3U/mL，48h后開始下降。由此可見，該菌產(chǎn)酶和降解羽毛的最佳時(shí)間為 48h〇
[0092] 實(shí)施例6
[0093] 實(shí)施例6用于說明利用產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的物質(zhì)的過程：
[0094] 所述產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的物質(zhì)，包括以下步驟：
[0095] 1)準(zhǔn)備液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基；
[0096] 所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基按濃度計(jì)包括以下組分：
[0097] K2HPO4 lg/L; Mg2SO4eTH2O 0.5g/L; NaCl 0.5g/L,;
[0098] FeSO4 *7H?0 O.Olg/L; 羽毛 10g/L·
[0099]其中，所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH= 11;
[0100] 2)取銅綠假單胞菌菌種0.5mL和羽毛0.5g，添加至步驟1)中制得的液體無機(jī)鹽培 養(yǎng)基50mL中，在轉(zhuǎn)速為220rpm，溫度為37°C的條件下發(fā)酵48h，使羽毛降解；
[0101] 3)對(duì)照組(CK)為將羽毛0.5g置于液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，不添加菌種震蕩48h:
[0102] 4)通過觀察羽毛的降解情況，對(duì)照組（CK)的羽毛降解狀態(tài)如圖8所示：羽毛仍完 好，液體仍為無色透明澄清;經(jīng)過實(shí)施例6處理的羽毛降解狀態(tài)如圖9所示:完整羽毛已經(jīng)完 全脫落降解，降解液體為灰黑色渾濁液；
[0103] 5)通過步驟2)發(fā)酵48h后取液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液，對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行 角蛋白酶酶活測(cè)定，得到角蛋白酶活力為60.3U/mL。
[0104] 對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各 種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌，其特征在于：所述銅綠假單胞菌于2016年03月07 日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 12185。2. 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于:利用所述產(chǎn)角 蛋白酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的物質(zhì)。3. 如權(quán)利要求2所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于:所述產(chǎn)角蛋白 酶的銅綠假單胞菌降解含角蛋白的物質(zhì)，包括以下步驟： 1) 準(zhǔn)備液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基； 2) 取銅綠假單胞菌菌種和含角蛋白的物質(zhì)，添加至步驟1)中制得的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基 中，所述銅綠假單胞菌菌種的菌齡為t，4h<t<24h，所述銅綠假單胞菌菌種在液體無機(jī)鹽 培養(yǎng)基中的接種量為a，0.5%彡a彡5%，在轉(zhuǎn)速為150~220rpm，溫度為27~47°C的條件下 發(fā)酵12~120h，使含角蛋白的物質(zhì)降解。4. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于：步驟1)中，所 述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基按濃度計(jì)包括以下組分： K2HP〇4 lg/L; Mg2S04*7H20 0.5g/L; NaCl 0.5g/L; FeS04*7H20 O.Olg/L; 羽毛 lOg/L; 其中，所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH為4~11。5. 如權(quán)利要求4所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于:所述液體無機(jī) 鹽培養(yǎng)基的pH=ll。6. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于:所述銅綠假單 胞菌菌種的菌齡為t，t = 12h。7. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于:所述銅綠假單 胞菌菌種在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的接種量為a，a = 2 %。8. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)角蛋白酶的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于：步驟2)中，所 述發(fā)酵的溫度為37°C。
【文檔編號(hào)】C12R1/385GK105861373SQ201610272854
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】黃妙容, 鐘楚紅, 任廣彩, 劉傳高, 陳瑞愛, 葉俊賢
【申請(qǐng)人】廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司