本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種利用多肽和小分子調(diào)控水稻或小麥中蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
背景技術(shù)：
：植物基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)經(jīng)過多年研究已開發(fā)出多種形式，如細(xì)菌來源的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物來源的糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)系統(tǒng)、酵母來源的銅離子誘導(dǎo)系統(tǒng)、以及乙醇誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)等。由于化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)可控性強(qiáng)，因此，在植物生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。令人遺憾的是,上述化學(xué)調(diào)控系統(tǒng)中用作誘導(dǎo)物的甲基脫氫皮質(zhì)醇、雌二醇、四環(huán)素和重金屬都對(duì)生態(tài)環(huán)境有害,不宜用于生產(chǎn)實(shí)踐。此外，化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)還存在其它諸多問題，譬如表達(dá)泄漏、大田中可控性差(如乙醇誘導(dǎo)的調(diào)控系統(tǒng))等。因此，轉(zhuǎn)基因時(shí)空表達(dá)調(diào)控的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)雖已被廣泛應(yīng)用于植物生物學(xué)研究，但在植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的使用卻非常有限，特別是目前適合于大田應(yīng)用的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)少之又少。因此，迫切需要發(fā)展和建立新型的轉(zhuǎn)基因時(shí)空表達(dá)調(diào)控化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)，為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展及轉(zhuǎn)基因分子育種提供重要的工具。絕大多數(shù)基因需要通過其編碼的蛋白完成其生物學(xué)功能。目前植物基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)還集中在從轉(zhuǎn)錄水平上控制基因的表達(dá)以調(diào)控其蛋白產(chǎn)物的功能。這些方法的主要局限性是它們對(duì)蛋白的控制是間接的，需要相對(duì)長的時(shí)間去起作用而引發(fā)相應(yīng)的表型；此外，蛋白質(zhì)本身的穩(wěn)定性以及翻譯后修飾也會(huì)影響這些方法的實(shí)際效果。因此，植物生物學(xué)家迫切需要直接調(diào)控蛋白質(zhì)水平的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)。隨著化學(xué)生物學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)的興起，小分子化合物在蛋白質(zhì)功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。小分子對(duì)于蛋白質(zhì)的作用幾乎是實(shí)時(shí)的、通常也是可逆的和劑量依賴的，使得調(diào)控效果更加精確，調(diào)節(jié)方式也更加靈活。已有通過小分子控制蛋白質(zhì)共定位，蛋白質(zhì)激酶活性，以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等的成功的報(bào)道。但是這些小分子通常是使用靶蛋白對(duì)小分子庫進(jìn)行大規(guī)模篩選得到的，其作用效果只針對(duì)特異的靶蛋白，不適用于其他蛋白質(zhì)，而且不同蛋白質(zhì)功能差異巨大，很難通過一種機(jī)制調(diào)節(jié)。與直接調(diào)控蛋白質(zhì)活性相比，一種適用性更廣泛的策略是通過小分子調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而控制靶蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的積累水平。最近，在哺乳動(dòng)物中建立了一個(gè)利用小分子Shield1精細(xì)調(diào)控目的蛋白質(zhì)積累水平的高效技術(shù)體系。Shield1是FK506的衍生物，具有更好的細(xì)胞通透性并且自身不具有任何生理活性。Shield1可以和一種穩(wěn)定性改變的FKBP12突變形式DD(DestabilizedDomain)高效結(jié)合。DD在沒有Shield1時(shí)是不穩(wěn)定的，在細(xì)胞中的本底積累水平很低；而DD與Shield1結(jié)合后趨于穩(wěn)定，得以在細(xì)胞內(nèi)積累。重要的是，可以通過改變Shield1的濃度來快速、可逆地精細(xì)控制DD的累積水平。目前，這一系統(tǒng)已經(jīng)在哺乳動(dòng)物，果蠅，酵母，以及原生動(dòng)物等多個(gè)物種中得到應(yīng)用。目前已有改進(jìn)的Shield1-RDDK系統(tǒng)在雙子葉模式植物擬南芥中進(jìn)行了驗(yàn)證(圖1)，這是第一種在植物中利用小分子直接調(diào)控蛋白質(zhì)累積水平的方法，但在重要糧食作物水稻、小麥等中還沒有相關(guān)的研究報(bào)道。EGFP是一種被廣泛應(yīng)用的報(bào)告蛋白，可在特定波長的光激發(fā)下發(fā)出熒光。GUS基因來自于大腸桿菌，編碼β-葡萄糖醛酸糖苷酶，可催化多種β-葡萄糖苷酯類底物分解，產(chǎn)生深藍(lán)色不溶性沉淀，是植物分子生物學(xué)研究中常用的報(bào)告基因之一。Bar基因來自于綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)，編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PhosphinothricinN-acetyltransferase,PAT)，可將草銨膦乙?；Щ畈蒌@膦。Pid3基因是從水稻秈稻品種地谷中克隆的稻瘟菌抗性基因,編碼一個(gè)CC-NB-LRR蛋白。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明一個(gè)目的是提供多肽相關(guān)生物材料和shield1的用途。本發(fā)明提供了多肽相關(guān)生物材料和shield1在培育具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的應(yīng)用：所述多肽相關(guān)生物材料為如下任一種:多肽RDDK或RDDKHA、多肽RDDK編碼基因或多肽RDDKHA編碼基因、含有所述多肽RDDK編碼基因的表達(dá)載體或含有所述多肽RDDKHA編碼基因的表達(dá)載體、由所述多肽RDDK編碼基因或所述多肽RDDKHA編碼基因與功能蛋白基因融合得到的融合蛋白和融合蛋白編碼基因；所述多肽RDDK的氨基酸序列為序列表中的序列2自N末端第77-185位氨基酸。所述RDDKHA多肽的氨基酸序列為序列表中的序列2自N末端第77-217位氨基酸。上述應(yīng)用中，RDDK多肽的編碼基因RDDK為序列表中的序列1自5’末端第229-555位核苷酸，UbRDDK多肽的編碼基因UbRDDK的核苷酸序列為序列表中的序列1自5’末端第1-555位核苷酸。其中1-228為泛素編碼基因Ub。RDDKHA多肽的編碼基因RDDKHA為序列表中的序列1自5’末端第229-651位核苷酸，UbRDDKHA多肽的編碼基因UbRDDKHA的核苷酸序列為序列表中的序列1。上述應(yīng)用中，所述具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的功能是通過shield1誘導(dǎo)所述融合蛋白表達(dá)得到的；或所述農(nóng)作物為小麥或水稻。上述應(yīng)用中，所述功能蛋白基因?yàn)榭共』蚧驁?bào)告基因；或所述功能蛋白基因?yàn)锽ar蛋白編碼基因或抗稻瘟菌基因Pid3或GUS基因或EGFP基因。上述應(yīng)用中，所述融合蛋白由多肽RDDK和EGFP蛋白融合組成RDDK-EGFP，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由EGFP表達(dá)帶來的熒光信號(hào)功能的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；或所述融合蛋白由多肽RDDKHA和Bar蛋白融合組成RDDKHA-Bar，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由Bar表達(dá)帶來抗草甘膦功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；或所述融合蛋白由多肽RDDKHA和Pid3蛋白融合組成RDDKHA-Pid3，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由Pid3表達(dá)帶來抗稻瘟菌功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；或所述融合蛋白由多肽RDDKHA和GUS蛋白融合組成RDDKHA-GUS，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由GUS表達(dá)帶來報(bào)告功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種培育具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：1)將上述融合蛋白編碼基因?qū)朕r(nóng)作物中，得到表達(dá)所述融合蛋白的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；2)shield1或shield1水溶液誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，得到shield1誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，即為具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；所述shield1或shield1水溶液誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的功能蛋白的表達(dá)量大于所述誘導(dǎo)前的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。上述方法中，所述具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的功能是通過shield1誘導(dǎo)所述融合蛋白表達(dá)得到的；或所述農(nóng)作物為小麥或水稻。上述方法中，所述shield1水溶液的濃度為3-10μM。上述方法中，所述融合蛋白由多肽RDDK和EGFP蛋白融合組成RDDK-EGFP，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由EGFP表達(dá)帶來的熒光信號(hào)功能的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其對(duì)應(yīng)的功能蛋白為EGFP；或所述融合蛋白由多肽RDDKHA和Bar蛋白融合組成RDDKHA-Bar，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由Bar表達(dá)帶來抗草甘膦功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其對(duì)應(yīng)的功能蛋白為Bar；或所述融合蛋白由多肽RDDKHA和Pid3蛋白融合組成RDDKHA-Pid3，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由Pid3表達(dá)帶來抗稻瘟菌功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其對(duì)應(yīng)的功能蛋白為Pid3；或所述融合蛋白由多肽RDDKHA和GUS蛋白融合組成RDDKHA-GUS，其對(duì)應(yīng)的具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為具有由GUS表達(dá)帶來報(bào)告功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其對(duì)應(yīng)的功能蛋白為GUS。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種用于培育具有功能轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的體系。本發(fā)明提供的體系，包括上述多肽相關(guān)生物材料和shield1。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明首次在水稻、小麥中建立轉(zhuǎn)基因蛋白表達(dá)水平的時(shí)空高效控制的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)，最終為作物功能基因的挖掘和轉(zhuǎn)基因分子育種提供有力的技術(shù)支撐。附圖說明圖1為shield1在水稻中直接調(diào)控RDDK融合蛋白的積累。圖2為shield1對(duì)RDDK融合蛋白的誘導(dǎo)積累是時(shí)空特異的。圖3為shield1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因水稻除草劑抗性。圖4為shield1誘導(dǎo)RDDK-Pid3轉(zhuǎn)基因水稻稻瘟菌抗性。圖5為shield1直接操控轉(zhuǎn)基因小麥中目的蛋白水平。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、用于培育功能性轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的體系用于培育抗性農(nóng)作物的體系包括多肽相關(guān)生物材料和小分子shield1。多肽及相關(guān)生物材料為如下：多肽RDDK或RDDKHA、多肽UbRDDK或UbRDDKHA、多肽編碼基因UbRDDK或UbRDDKHA、含有多肽編碼基因的表達(dá)載體、由多肽編碼基因和功能蛋白基因融合得到的融合蛋白和融合蛋白編碼基因中任一種。RDDK多肽的氨基酸序列為序列表中的序列2自N末端第77-185位氨基酸，RDDK多肽的編碼基因RDDK為序列表中的序列1自5’末端第229-555位核苷酸，UbRDDK多肽的氨基酸序列為序列表中的序列2自N末端第1-185位氨基酸，該多肽的編碼基因UbRDDK的核苷酸序列為序列表中的序列1自5’末端第1-555位核苷酸。RDDKHA多肽的氨基酸序列為序列表中的序列2自N末端第77-217位氨基酸，RDDKHA多肽的編碼基因RDDKHA為序列表中的序列1自5’末端第229-651位核苷酸，UbRDDKHA多肽的氨基酸序列為序列表中的序列2，該多肽的編碼基因UbRDDKHA的核苷酸序列為序列表中的序列1。小分子shield1(Clontech，貨號(hào)632189，MW748.91，(C42H56N2O10)，其化學(xué)式如下式1所示：實(shí)施例2、用于培育功能性轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的應(yīng)用一、多肽RDDKHA/RDDK融合功能性蛋白表達(dá)1、重組載體pCambia2300-Ubi載體為將序列3所示的玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子插入經(jīng)過EcoRI酶切的pCambia2300(來自http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)載體中得到的重組載體，命名為pCambia2300-Ubi。pCambia2300Ubi-UbRDDK中間載體：將序列1第1-555位所示的UbRDDK基因片段替換pCambia2300-Ubi載體骨架SacI和KpnI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，得到中間載體pCambia2300Ubi-UbRDDK。pCambia2300Ubi-UbRDDKHA中間載體：將序列1所示的UbRDDKHA基因片段替換pCambia2300-Ubi載體骨架SacI和KpnI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，得到中間載體pCambia2300Ubi-UbRDDKHA。pCambia2300Ubi-UbRDDK-EGFP載體：為將序列4所示的EGFP編碼基因替換pCambia2300Ubi-UbRDDK載體骨架BamHI和NotI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，形成ubiquitin-RDDK-EGFP同框融合片段，得到重組載體pCambia2300Ubi-UbRDDK-EGFP，表達(dá)融合蛋白R(shí)DDK-EGFP(氨基酸序列由多肽RDDK氨基酸序列和EGFP蛋白氨基酸序列組成，多肽RDDK氨基酸序列的最后一位與EGFP蛋白氨基酸序列的第一位緊鄰；其中，EGFP蛋白氨基酸序列為序列8；多肽RDDK氨基酸序列為序列2第77-185位)。在細(xì)胞內(nèi)，UbRDDK-EGFP蛋白一旦產(chǎn)生，其Ub會(huì)首先被切掉，從而留下RDDK-EGFP，下面蛋白相同均剪切掉Ub。pCambia2300Ubi-UbRDDKHA-Bar載體：將序列5所示的Bar編碼基因(見序列5)替換中間載體pCambia2300Ubi-UbRDDKHA骨架KpnI和BamHI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，形成ubiquitin-RDDKHA-Bar同框融合片段，得到重組載體pCambia2300Ubi-UbRDDKHA-Bar，表達(dá)融合蛋白R(shí)DDKHA-Bar(氨基酸序列由多肽RDDKHA氨基酸序列和Bar蛋白氨基酸序列組成，多肽RDDKHA氨基酸序列的最后一位與Bar蛋白氨基酸序列的第一位緊鄰；其中，Bar蛋白氨基酸序列為序列9；多肽RDDKHA氨基酸序列為序列2第77-217位)。pCambia2300Ubi-UbRDDKHA-Pid3載體：將序列6所示的水稻抗稻瘟菌基因Pid3替換中間載體pCambia2300Ubi-UbRDDKHA中的SpeI和KpnI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，形成UbRDDKHA-Pid3同框融合片段，得到重組載體pCambia2300Ubi-UbRDDKHA-Pid3，表達(dá)融合蛋白R(shí)DDKHA-Pid3(氨基酸序列由多肽RDDKHA氨基酸序列和Pid3蛋白氨基酸序列組成，多肽RDDKHA氨基酸序列的最后一位與Pid3蛋白氨基酸序列的第一位緊鄰；其中，Pid3蛋白氨基酸序列為序列10；多肽RDDKHA氨基酸序列為序列2第77-217位)。pJIT163Ubi載體：將序列3所示的玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子替換pJIT163(相關(guān)參考文獻(xiàn)Guerineau,F.,Lucy,A.&Mullineaux,P.Effectoftwoconsensussequencesprece-dingthetranslationinitiatorcodonongeneexpressioninplantprotoplasts.PlantMolecularBiology18,815-818<1992>，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得)中的HindⅢ和kpnI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，得到中間載體pJIT163-Ubi。pJIT163Ubi-UbRDDKHA中間載體：將序列1所示的UbRDDKHA基因片段替換pJIT163Ubi載體骨架SacI和KpnI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，得到中間載體pJIT163Ubi-UbRDDKHA。pJIT163Ubi-UbRDDKHA-GUS重組載體為將序列7所示的GUS基因替換載體pJIT163Ubi-UbRDDKHA中的BamHI和NotI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，形成ubiquitin-RDDKHA-GUS同框融合片段，得到pJIT163Ubi-UbRDDKHA-GUS載體，表達(dá)融合蛋白R(shí)DDKHA-GUS(氨基酸序列由多肽RDDKHA氨基酸序列和GUS蛋白氨基酸序列組成，多肽RDDKHA氨基酸序列的最后一位與GUS蛋白氨基酸序列的第一位緊鄰；其中，GUS蛋白氨基酸序列為序列11；多肽RDDKHA氨基酸序列為序列2第77-217位)。pJIT163Ubi-UbRDDKHA-Bar重組載體為將序列5所示的bar片段替換載體pJIT163Ubi-UbRDDKHA中的BamHI和EcoRI雙酶切位點(diǎn)間DNA片段，形成ubiquitin-RDDKHA-Bar同框融合片段，得到pJIT163Ubi-UbRDDKHA-Bar載體，表達(dá)融合蛋白R(shí)DDKHA-Bar(氨基酸序列由多肽RDDKHA氨基酸序列和Bar蛋白氨基酸序列組成，多肽RDDKHA氨基酸序列的最后一位與Bar蛋白氨基酸序列的第一位緊鄰；其中，Bar蛋白氨基酸序列為序列9；多肽RDDKHA氨基酸序列為序列2第77-217位)。2、轉(zhuǎn)功能性基因植物的制備A、轉(zhuǎn)基因水稻1)功能性基因轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻將上述1制備的重組載體pCambia2300Ubi-UbRDDK-EGFP和pCambia2300Ubi-UbRDDKHA-Bar通過農(nóng)桿菌侵染分別轉(zhuǎn)化至水稻中花11(OryzasativaL.subsp.japonicacv.ZhonghuaNo.11，參考文獻(xiàn)Ling-TaoPeng,Zheng-YingShi,LinLi(2007)EctopicexpressionofOsLFL1inricerepressesEhd1bybindingonitspromoter.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications360251–256)的成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，得到T0代轉(zhuǎn)EGFP水稻和T0代轉(zhuǎn)Bar水稻；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法參考了HamidRashid,ShuujiYokoi,KinyaToriyamaPlantCellReports(1996)15:727-730TransgenicplantproductionmediatedbyAgrobacteriuminlndicarice所公開的方法。將上述1制備的重組載體pCambia2300-UbRDDKHA-Pid3通過農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化至水稻日本晴(OryzasativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare，記載在如下文獻(xiàn)：StephenA.Goffetal.ADraftSequenceoftheRiceGenome(OryzasativaL.ssp.japonica).Science.2002，(296)：92，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得。)的成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，得到T0代轉(zhuǎn)Pid3水稻。2)鑒定轉(zhuǎn)基因水稻(1)RT-PCR檢測分別提取T0代轉(zhuǎn)EGFP水稻、T0代轉(zhuǎn)Bar水稻和T0代轉(zhuǎn)Pid3水稻的幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，分別用下面各自基因?qū)?yīng)的引物進(jìn)行RT-PCR：鑒定EGFP基因特異引物：DD-83-for：ACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGEGFP-718-rev：CCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTC鑒定Bar基因特異引物：Bar-74-forGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGBar-499-revCCAGCTGCCAGAAACCCACGTC鑒定Pid3基因特異引物：Pid3-FORATGGCGGAGGGTGTTGTGGGCTCPid3-REVTCCTCCCTCTTGAAGAGTACAGAGTCAG內(nèi)參基因?yàn)閍ctin，引物如下OsActin-for：GGGCGATCTAGGAAAGCTTCTCOsActin-rev：CAGTCCAAGAGGGGTATCTTGACPCR反應(yīng)條件如下：94度變性3分鐘；94度變性30秒，65度退火30秒，72度延伸60秒，循環(huán)30次；72度延伸5分鐘。結(jié)果如下：T0代轉(zhuǎn)EGFP水稻得到961bp為PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植物；T0代轉(zhuǎn)Bar水稻得到425bp為PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植物；T0代轉(zhuǎn)Pid3水稻得到515bp為PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植物。(2)蛋白質(zhì)免疫印跡將上述(1)PCR鑒定為陽性的T0代轉(zhuǎn)EGFP水稻、T0代轉(zhuǎn)Bar水稻和T0代轉(zhuǎn)Pid3水稻幼苗分別提取總蛋白。提取液配方如下：50mMTris/HCl,pH7.5,100mMNaCl,2mMEDTA,0.5％SDS，5％甘油,2.5mMDTT，Complete蛋白酶抑制劑(Roche)。上述各株系總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后經(jīng)半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，使用鼠源GFP抗體(Roche,1:2500稀釋)檢測GFP，使用鼠源HA抗體(Roche,1:2500稀釋)檢測HA，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠第二抗體(Sigma，1:20000稀釋)，使用Pro-lightHRP發(fā)光液顯色(Tiangen)。結(jié)果得到目的蛋白的為陽性T0代轉(zhuǎn)RDDK-EGFP水稻(目的蛋白R(shí)DDK-EGFP蛋白大小為44kd左右)、陽性T0代轉(zhuǎn)Bar水稻(目的蛋白Bar大小為RDDKHA-Bar大小為40kd左右)。陽性T0代轉(zhuǎn)Pid3水稻表達(dá)目的蛋白R(shí)DDKHA-Pid3，能看到熒光，且能檢測到其發(fā)揮了生理功能。B、轉(zhuǎn)基因小麥1)功能性基因轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因小麥將上述1制備的重組載體pJIT163Ubi-UbRDDKHA-GUS和pJIT163Ubi-UbRDDKHA-Bar基因槍法分別轉(zhuǎn)入小麥科農(nóng)199(基因槍轉(zhuǎn)化方法參考了KangZhang,JinxingLiu,YiZhangJournalofGeneticsandGenomics42(2015)39-42BiolisticGeneticTransformationofaWideRangeofChineseEliteWheat(TriticumaestivumL.)Varieties所公開的方法?？妻r(nóng)199是中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所育成的小麥新品種，審定編號(hào)：國審麥2006017)，得到T0代轉(zhuǎn)GUS小麥和T0代轉(zhuǎn)Bar小麥。2)鑒定轉(zhuǎn)基因小麥(1)RT-PCR檢測分別提取T0代轉(zhuǎn)GUS小麥和T0代轉(zhuǎn)Bar小麥的幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，分別用下面各自基因?qū)?yīng)的引物進(jìn)行RT-PCR：鑒定GUS基因特異引物：GUS-444-for:gattaccgacgaaaacggcaagGUS-867-rev:aggaactgttcgcccttcactg鑒定Bar基因特異引物：Bar-74-for:GCACCATCGTCAACCACTACATCGAGBar-499-rev:CCAGCTGCCAGAAACCCACGTC內(nèi)參基因?yàn)閍ctin，引物如下TaActin-for：GGGCGATCTAGGAAAGCTTCTCTaActin-rev：CAGTCCAAGAGGGGTATCTTGACPCR反應(yīng)條件如下：94度變性3分鐘；94度變性30秒，65度退火30秒，72度延伸60秒，循環(huán)30次；72度延伸5分鐘。結(jié)果如下：T0代轉(zhuǎn)GUS小麥得到422bp為PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植物；T0代轉(zhuǎn)Bar小麥得到425bp為PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植物。(2)蛋白質(zhì)免疫印跡將上述(1)PCR鑒定為陽性的T0代轉(zhuǎn)GUS小麥和T0代轉(zhuǎn)Bar小麥幼苗分別提取總蛋白。提取液配方如下：50mMTris/HCl,pH7.5,100mMNaCl,2mMEDTA,0.5％SDS，5％甘油,2.5mMDTT，Complete蛋白酶抑制劑(Roche)。上述各株系總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后經(jīng)半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，使用鼠源GFP抗體(Roche,1:2500稀釋)檢測GFP，若多肽有HA，則使用鼠源HA抗體(Roche,1:2500稀釋)檢測HA；使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠第二抗體(Sigma，1:20000稀釋)，使用Pro-lightHRP發(fā)光液顯色(Tiangen)。結(jié)果得到目的蛋白的為陽性T0代轉(zhuǎn)GUS小麥(目的蛋白R(shí)DDKHA-GUS大小為80Kd左右)、陽性T0代轉(zhuǎn)Bar小麥(目的蛋白R(shí)DDKHA-Bar,大小為40Kd左右)。將上述陽性T0代小麥和陽性T0代水稻播種傳代，得到T2代轉(zhuǎn)GUS小麥、T2代轉(zhuǎn)Bar小麥、T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻、T2代轉(zhuǎn)Bar水稻和T2代轉(zhuǎn)Pid3水稻。二、Shield1調(diào)控RDDKHA/RDDK融合功能蛋白的累積Shield1水溶液：將不同量的Shield1溶于水中，得到Shield1水溶液，使Shield1溶液的終濃度為0μM、0.3μM、1μM、3μM和10μM。Shield1處理(浸泡處理)：將T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻、T2代轉(zhuǎn)Bar水稻和T2代轉(zhuǎn)Pid3水稻的無菌苗直接浸入不同濃度的Shield1水溶液中處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)株系3株。1、shield1在水稻中直接調(diào)控RDDK-EGFP融合蛋白的積累1)RT-PCR采集0μM、3μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻進(jìn)行RT-PCR檢測RDDK-EGFP表達(dá)量，RT-PCR檢測方法同上述一，以3μMShield1水溶液處理8h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖1a所示，可以看出，從RNA水平上，與不加Shield1處理的T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻相比，加入3μMShield1處理的T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻的RDDK-EGFP的RNA水平并無明顯差異；2)westernblot水平檢測RDDK-EGFP融合蛋白的積累采集0μM、3μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻W(wǎng)B檢測，WB檢測方法同上述一，以3μMShield1水溶液處理8h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖1b所示，可以看出，不加Shield1處理的T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻的RDDK-EGFP不表達(dá)，加入3μMShield1處理的T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻的RDDK-EGFP積累表達(dá)，表明，Shield1促進(jìn)融合蛋白R(shí)DDK-EGFP的表達(dá)。3)RDDK-EGFP融合蛋白受誘導(dǎo)積累水平依賴于shield1的濃度采集0μM、0.3μM、1μM、3μM、10μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻W(wǎng)B檢測，WB檢測方法同上述一，以3μMShield1水溶液處理8h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖1c所示，可以看出，隨著Shield1濃度增加，T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻的RDDK-EGFP表達(dá)量增加，表明，目的蛋白R(shí)DDK-EGFP受誘導(dǎo)積累水平依賴于shield1的濃度。4)Shield1處理水稻葉鞘后內(nèi)表皮細(xì)胞表達(dá)RDDK-EGFP融合蛋白的檢測采集在0μM、1μM、3μM、10μMShield1水溶液浸泡8h后T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻，取水稻葉鞘內(nèi)表皮細(xì)胞用共聚焦顯微鏡(由LeicaTCSSP8Ⅱ拍攝)進(jìn)行檢測，以3μMShield1水溶液處理8h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖1d所示，可以看出，Shield1能夠在水稻中誘導(dǎo)RDDK-EGFP融合蛋白的積累，且融合蛋白的功能不受影響，能被激發(fā)出熒光。5)Shield1處理水稻葉鞘后內(nèi)表皮細(xì)胞表達(dá)RDDK-EGFP融合蛋白的定量檢測采集在0μM、1μM、3μM、10μMShield1水溶液浸泡8h后T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻，取水稻葉鞘內(nèi)表皮細(xì)胞用共聚焦顯微鏡(由LeicaTCSSP8Ⅱ拍攝)進(jìn)行檢測，激光共聚焦圖像由LeicaTCSSP5Ⅱ拍攝。EGFP綠色熒光由488nm激發(fā)光激發(fā)，515/530nm波長處收集發(fā)射熒光。使用ImageJ軟件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)進(jìn)行熒光強(qiáng)度測量。以10μMShield1水溶液處理8h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖1e所示，可以看出，Shield1誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度隨著其濃度升高而增強(qiáng)，說明RDDK-EGFP融合蛋白積累水平對(duì)Shield1具有劑量依賴效應(yīng)。2、shield1對(duì)RDDK-EGFP融合蛋白的誘導(dǎo)積累是時(shí)空特異的1)shield1誘導(dǎo)融合蛋白積累水平隨時(shí)間變化的關(guān)系3μMShield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻3h，在不同時(shí)間采樣進(jìn)行WB檢測，WB檢測方法同上述一，以3μMShield1水溶液處理3h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖2a所示，可以看出，在shield1誘導(dǎo)3小時(shí)后，RDDK-EGPF融合蛋白有微弱地積累，6到12h積累達(dá)到頂峰，至24h時(shí)積累減弱至無法檢測的水平，這說明RDDK-Shield1系統(tǒng)可以迅速調(diào)節(jié)目的蛋白的水平，并且這個(gè)調(diào)節(jié)是可逆的。2)shield1誘導(dǎo)地域性對(duì)同一株T2代轉(zhuǎn)EGFP水稻的不同葉片分別用3μMShield1水溶液和水(mock)進(jìn)行處理3h，采樣進(jìn)行WB檢測，WB檢測方法同上述一，以3μMShield1水溶液處理3h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖2b和圖2c所示，可以看出，只有經(jīng)shield1處理的部位才有目的蛋白R(shí)DDK-EGFP的積累。3、shield1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)Bar水稻除草劑抗性1)圖3b為氯酚紅試演原理示意圖。除草劑草銨膦(PPT)能抑制植物中谷氨酰胺合成酶(GS)的活性,使植物中N代謝受到阻礙，致使細(xì)胞中游離氨含量升高，pH升高，殺死植物，并能使pH指示劑氯酚紅變成紅色；當(dāng)抗除草劑基因Bar表達(dá)PAT蛋白(乙?；D(zhuǎn)移酶)，使PPT失活，則GS能夠利用游離氨，使植物體內(nèi)pH下降，從而使氯酚紅成黃色。于是可以通過觀察氯酚紅顏色的變化就能判斷植物是否具有除草劑抗性。2)westernblot水平檢測RDDKHA-Bar融合蛋白的積累3μMShield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)Bar水稻8h，采樣進(jìn)行WB檢測，WB檢測方法同上述一，抗體為α-HA抗體，以3μMShield1水溶液處理3h中花11野生型水稻為對(duì)照；結(jié)果如圖3a所示，可以看出，Shield1處理后，融合蛋白UbRDDKHA-Bar有明顯的表達(dá)。3)氯酚紅試驗(yàn)3μMShield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)Bar水稻8h，氯酚紅法檢驗(yàn)shield誘導(dǎo)的除草劑抗性。以3μMShield1水溶液處理3h中花11野生型水稻為對(duì)照。氯酚紅培養(yǎng)基為向二分之一MS液體培養(yǎng)基中加入8g/l瓊脂、8mg/l除草劑雙丙氨膦和25mg/l氯酚紅，ph調(diào)至6.0。所有的試劑都是同時(shí)加入培養(yǎng)基的，水稻葉片表面經(jīng)過了簡單的消毒處理(70％酒精擦拭))。多孔板放在光照培養(yǎng)箱中(24℃，16h光照/8h黑暗)。結(jié)果如圖3c所示，T2代轉(zhuǎn)Bar水稻葉片在8mg/l除草劑雙丙氨膦作用下36h使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色,而加有10μMshield1的培養(yǎng)基中未出現(xiàn)明顯顏色變化。4)shield1處理過的轉(zhuǎn)Bar水稻表現(xiàn)出除草劑抗性幼苗期T2代轉(zhuǎn)Bar水稻用5μMShield1水溶液處理8h，之后用1g/L草銨膦水溶液噴施，10天后拍攝。以5μMShield1水溶液處理3h野生型水稻為對(duì)照.結(jié)果如圖3d所示，可以看出，只有經(jīng)shield1處理過的T2代轉(zhuǎn)Bar水稻表現(xiàn)出除草劑抗性。5)轉(zhuǎn)Bar水稻的shield1處理過的位置表現(xiàn)出除草劑抗性幼苗期T2代轉(zhuǎn)Bar水稻的一片葉子用5μMShield1水溶液shield1誘導(dǎo)8h，另一片mock處理(水處理)8h，隨后用1g/L除草劑草銨膦處理，10天后拍攝。以5μMShield1水溶液處理8h野生型水稻為對(duì)照。結(jié)果如圖3e所示，可以看出，只有經(jīng)shield1處理過的T2代轉(zhuǎn)Bar水稻葉片表現(xiàn)出除草劑抗性。4、shield1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)Pid3水稻稻瘟菌抗性1)臺(tái)盼藍(lán)浸染接菌葉鞘將150μl到200μl之間接種處理液分別注射進(jìn)入T2代轉(zhuǎn)Pid3水稻和野生型日本晴水稻的葉鞘(將水稻葉鞘注滿)，接種培養(yǎng)48小時(shí)后用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色。接種處理液由2×105個(gè)/ml97-27-2稻瘟菌(QimingLv,XiaoXu,JunjunShang.(2007)FunctionalAnalysisofPid3-A4,anOrthologofRiceBlastResistanceGenePid3RevealedbyAlleleMininginCommonWildRice.Phytopathology,594-599(2013))孢子懸液、10μMshield1水溶液和水組成；以對(duì)照接種處理液為對(duì)照(mock)。對(duì)照接種處理液為不加shield1的接種處理液。結(jié)果如圖4所示，可以看出，日本晴野生型水稻和未經(jīng)Shield1處理的RDDK-Pid3轉(zhuǎn)基因水稻葉鞘細(xì)胞被稻瘟菌97-27-2菌絲侵入，而經(jīng)Shield1誘導(dǎo)的水稻并沒有被菌絲侵入，而是引發(fā)了細(xì)胞死亡現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)稻瘟菌97-27-2接種不同水稻葉鞘時(shí)菌絲侵入的細(xì)胞數(shù)量和發(fā)生過敏性死亡的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如表1所示，WT為野生型日本晴水稻，RDDK-Pid3為T2代轉(zhuǎn)Pid3水稻，“+”表示接種處理液(10μMshield1)，“-”表示對(duì)照接種處理液?？梢钥闯?，Shield1能夠誘導(dǎo)RDDK-Pid3轉(zhuǎn)基因水稻的稻瘟菌抗性，這說明Shield1能在轉(zhuǎn)基因水稻中操控水稻內(nèi)源性目的蛋白的積累，并發(fā)揮其生理功能。表1WT+RDDK-Pid3-RDDK-Pid3+侵入71(86.6％)73(78％)14(11.3％)細(xì)胞死亡11(13.4％)18(22％)110(88.7％)5、shield1直接操控轉(zhuǎn)基因小麥中目的蛋白水平1)10μMshield1處理轉(zhuǎn)GUS小麥采集10μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)GUS小麥進(jìn)行WB檢測，WB檢測方法同上述一，抗體用鼠源a-HA抗體(Roche,1:2500稀釋)。以10μMShield1水溶液處理8h小麥科農(nóng)199為對(duì)照；以不加入Shield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)GUS小麥和以野生型小麥科農(nóng)199為對(duì)照。結(jié)果如圖5a所示，可以看出，加入10μMShield1處理的T2代轉(zhuǎn)GUS小麥的RDDKHA-GUS積累表達(dá)，表明，Shield1促進(jìn)融合蛋白R(shí)DDKHA-GUS的表達(dá)。2)對(duì)經(jīng)shield1處理過的RDDKHA-GUS轉(zhuǎn)基因小進(jìn)行GUS染色；采集10μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)GUS小麥葉片進(jìn)行GUS染色，以10μMShield1水溶液處理8h以野生型小麥科農(nóng)199得到的轉(zhuǎn)空載體小麥為對(duì)照(WT)；以不加入Shield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)GUS小麥為對(duì)照。結(jié)果如圖5b所示，可以看出，Shield1誘導(dǎo)了RDDK-HA-GUS融合蛋白的積累，并且GUS的功能并不受影響，葉片能被染色。3)shield1直接誘導(dǎo)RDDKHA-Bar外源抗除草劑蛋白的積累；采集10μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)Bar小麥進(jìn)行WB檢測，WB檢測方法同上述一，抗體用鼠源a-HA抗體(Roche,1:2500稀釋)。以10μMShield1水溶液處理8h小麥科農(nóng)199為對(duì)照；以不加入Shield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)Bar小麥和野生型小麥為對(duì)照。結(jié)果如圖5c所示，只有經(jīng)Shield1誘導(dǎo)處理過的轉(zhuǎn)基因小麥才檢測到了RDDK-Bar融合蛋白的積累，可以看出，Shield1能在小麥中直接誘導(dǎo)RDDK-Bar蛋白的積累。4)shield1誘導(dǎo)RDDKHA-Bar轉(zhuǎn)基因小麥除草劑抗性采集10μMShield1水溶液處理8h后T2代轉(zhuǎn)Bar小麥進(jìn)行WB檢測，WB檢測方法同上述一，抗體用鼠源a-HA抗體(Roche,1:2500稀釋)。以10μMShield1水溶液處理8h野生型小麥科農(nóng)199小麥為對(duì)照(WT)；以不加入Shield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)Bar小麥為對(duì)照。結(jié)果如圖5d所示，可以看出，10μMShield1水溶液處理T2代轉(zhuǎn)Bar小麥8h，氯酚紅法檢驗(yàn)shield誘導(dǎo)的除草劑抗性。以10μMShield1水溶液處理3h轉(zhuǎn)空載小麥為對(duì)照。氯酚紅培養(yǎng)基為向二分之一MS液體培養(yǎng)基中加入8g/l瓊脂和25mg/l氯酚紅，ph調(diào)至6.0。多孔板放在光照培養(yǎng)箱中(24℃，16h光照/8h黑暗)。結(jié)果如圖2c所示，T2代轉(zhuǎn)Bar小麥葉片在8mg/l除草劑雙丙氨膦作用下36h使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色,而加有10μMshield1的培養(yǎng)基中未出現(xiàn)明顯顏色變化。當(dāng)前第1頁1 2 3