本發(fā)明屬于分子探針技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞自噬是細(xì)胞依靠溶酶體將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過(guò)程。正常生理情況下，細(xì)胞自噬利于細(xì)胞保持自穩(wěn)狀態(tài)；在發(fā)生應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞自噬防止有毒或致癌的損傷蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積，抑制細(xì)胞癌變，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和代謝平衡。細(xì)胞自吞噬在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境應(yīng)激的應(yīng)答方面極為關(guān)鍵，它參與了細(xì)胞生存、死亡、病原體清除、抗原呈遞等過(guò)程，并與癌癥、感染、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病相關(guān)。因此，研究其作用機(jī)制不僅可以進(jìn)一步了解生命的奧秘，同時(shí)也為一些疾病的治療提供新的思路。

對(duì)于細(xì)胞自噬研究所使用的檢測(cè)手段，如TEM,LC3免疫沉淀法，GFP-LC3熒光檢測(cè)等方法卻不能提供實(shí)時(shí)的、定量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，并且這些方法不能應(yīng)用于組織活體水平。因此，開(kāi)發(fā)一種新型材料用于細(xì)胞自噬的體內(nèi)體外檢測(cè)對(duì)于進(jìn)行細(xì)胞自噬的基礎(chǔ)機(jī)理研究以及組織活體水平自噬相關(guān)疾病的診斷和治療具有重大意義。

目前已有研究的是基于FRET效應(yīng)的納米探針，但由于其標(biāo)記的熒光分子靈敏性不佳特異性不強(qiáng)并且納米顆粒影響細(xì)胞的自噬過(guò)程，影響了其廣泛應(yīng)用。CN 103275697 A公開(kāi)了一種雙芘兩親型熒光探針，該探針能檢測(cè)金屬離子，響應(yīng)速度快、靈敏度高、響應(yīng)范圍寬，但其無(wú)法應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)。

聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象(Aggregation-induced emission,AIE)克服了傳統(tǒng)熒光材料在聚集狀態(tài)時(shí)熒光淬滅的缺點(diǎn)，顯著提高了生物探針的靈敏性,在生物成像等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但用于體內(nèi)細(xì)胞自噬成像的具有特異性響應(yīng)的分子探針還鮮有報(bào)道，因而基于熒光分子的AIE特征，研發(fā)生物安全性能高、靈敏且特異性強(qiáng)的分子探針作為體內(nèi)體外細(xì)胞自噬的診斷成像劑，將為實(shí)現(xiàn)自噬相關(guān)疾病的診斷和治療提供了可能。

光聲成像技術(shù)是一種非入侵式的新型生物醫(yī)學(xué)成像方法。當(dāng)脈沖激光照射到生物組織時(shí)，組織的光吸收區(qū)域?qū)a(chǎn)生超聲信號(hào)，通過(guò)探測(cè)光聲信號(hào)能重建出組織中的光吸收分布圖像。光聲成像結(jié)合了純光學(xué)組織成像中高選擇性和純超聲組織成像中深穿透特性的優(yōu)點(diǎn)，可得到高分辨率和高對(duì)比度的組織圖像。因此，基于光聲成像技術(shù)，研發(fā)生物安全性高、靈敏且特異性好的光聲造影劑作為體內(nèi)組織部位細(xì)胞自噬水平檢測(cè)的成像劑，將為癌癥的診斷及治療提供有效的解決方案，具有重要的臨床意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種分子探針及其制備方法和應(yīng)用。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種分子探針，其特征在于，所述分子探針包括水溶性載體分子、響應(yīng)性多肽和信號(hào)分子；其中，所述響應(yīng)性多肽的序列為(Xaa)_m(Thr-Phe-Gly-Phe)(Xaa)_nLys(Xaa)_i，其中Xaa表示為任意氨基酸，i,n和m獨(dú)立地為0-4；所述水溶性載體分子和信號(hào)分子以酰胺鍵與響應(yīng)性多肽相連。

其中，所述Xaa可以為Ala,Arg,Asp,Cys,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Ser,Thr,Trp,Try,Pro,或Met。

其中，所述i可以為0、1、2、3或4；n可以為0、1、2、3或4；所述m可以為0、1、2、3或4。

本發(fā)明中，所述響應(yīng)性多肽是對(duì)細(xì)胞自噬標(biāo)志酶ATG4特異響應(yīng)的，正常環(huán)境中，分子探針保持無(wú)熒光或低光聲信號(hào)的單分子狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞自噬激活時(shí)，分子探針中多肽被切割并釋放出信號(hào)分子，信號(hào)分子的聚集特征賦予探針熒光或光聲信號(hào)增強(qiáng)的特性。

本發(fā)明中，所述響應(yīng)性多肽被切割的位置為保守序列中(Thr-Phe-Gly-Phe)甘氨酸羧基。

優(yōu)選地，所述響應(yīng)性多肽的長(zhǎng)度為5-17個(gè)氨基酸，例如可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17，優(yōu)選為6-12個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選為7個(gè)氨基酸。

優(yōu)選地，所述信號(hào)分子為具有聚集誘導(dǎo)效應(yīng)(AIE)的熒光信號(hào)分子和/或具有聚集導(dǎo)致光聲信號(hào)增強(qiáng)的脂溶性信號(hào)分子。

優(yōu)選地，所述具有聚集誘導(dǎo)效應(yīng)(AIE)的熒光信號(hào)分子為雙芘類衍生物和/或四苯乙烯類化合物，優(yōu)選為雙芘。

所述雙芘類化合物結(jié)構(gòu)式如下：

所述四苯乙烯類化合物結(jié)構(gòu)式如下：

優(yōu)選地，所述具有聚集導(dǎo)致光聲信號(hào)增強(qiáng)的脂溶性信號(hào)分子為共軛環(huán)狀結(jié)構(gòu)的卟啉類衍生物，優(yōu)選為紫紅素-18。

所述紫紅素-18結(jié)構(gòu)式如下：

優(yōu)選地，所述水溶性載體分子為樹(shù)枝狀類超分子和/或超支化類分子，優(yōu)選為四代樹(shù)枝狀分子。

優(yōu)選地，所述分子探針具有如下式I所示結(jié)構(gòu)：

第二方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的分子探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)利用Fmoc固相合成方法在不溶于水的樹(shù)脂上合成所述響應(yīng)性多肽；

(2)將響應(yīng)性多肽與所述信號(hào)分子和水溶性載體分子相連。

優(yōu)選地，步驟(1)所述的不溶于水的樹(shù)脂為Wang樹(shù)脂。

優(yōu)選地，所述Wang樹(shù)脂的修飾密度為0.3-0.4mM，例如可以是0.3mM、0.31mM、0.32mM、0.35mM、0.36mM、0.38mM或0.4mM，優(yōu)選為0.35mM。

優(yōu)選地，步驟(1)的具體步驟包括：

(a)將第一個(gè)氨基酸的氨基端用Fmoc保護(hù)，羧基端固定于樹(shù)脂上；

(b)用六氫吡啶的DMF溶液脫去氨基端的Fmoc保護(hù)，下一個(gè)賴氨酸使用側(cè)鏈氨基為Dde保護(hù)的氨基酸，羧基用4-甲基嗎啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液進(jìn)行活化，與脫保護(hù)的第一個(gè)氨基酸進(jìn)行縮合反應(yīng)；

(c)剩余氨基酸的氨基端用Fmoc保護(hù)，重復(fù)步驟(b)，直到完成所有氨基酸的縮合。

優(yōu)選地，所述步驟(2)具體包括：將所述信號(hào)分子羧基活化，并連接在響應(yīng)性多肽的氨基端；將響應(yīng)性多肽中賴氨酸支鏈氨基活化，并連接在所述的載體分子羧基端，再?gòu)臉?shù)脂上脫除。

優(yōu)選地，所述響應(yīng)性多肽中賴氨酸支鏈氨基活化在含0.2％水合肼的DMF溶液中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述從樹(shù)脂上脫除在4-甲基嗎啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中進(jìn)行。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的分子探針用于體內(nèi)體外細(xì)胞自噬酶ATG4的檢測(cè)或用于體內(nèi)體外細(xì)胞自噬水平實(shí)時(shí)定量評(píng)估。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的分子探針具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，可以自由擴(kuò)散及胞吞形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并通過(guò)信號(hào)改變強(qiáng)度反映胞內(nèi)自噬標(biāo)志酶的活性，進(jìn)而對(duì)體內(nèi)體外細(xì)胞自噬水平進(jìn)行定量評(píng)估。因此本發(fā)明的分子探針，不僅具備良好的特異性及信號(hào)穩(wěn)定性，而且豐富了細(xì)胞自噬檢測(cè)手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中所述分子的核磁圖譜(1H NMR)；

圖2是實(shí)施例1中所述分子單體和聚集體的熒光光譜；

圖3是實(shí)施例1中所述分子在不同濃度的分子探針在細(xì)胞自噬標(biāo)志酶ATG4作用下的熒光光譜；

圖4是實(shí)施例1中所述分子在雷帕霉素激活細(xì)胞自噬的MCF-7細(xì)胞模型中的熒光信號(hào)；

圖5是實(shí)施例1中所述分子在雷帕霉素激活細(xì)胞自噬的MCF-7細(xì)胞模型中實(shí)時(shí)成像；

圖6是實(shí)施例1中所述分子在雷帕霉素激活細(xì)胞自噬的MCF-7細(xì)胞模型中對(duì)細(xì)胞自噬水平的定量評(píng)價(jià)；

圖7是實(shí)施例1中所述分子在MCF-7細(xì)胞自噬激活模型(雷帕霉素，饑餓兩小時(shí))和抑制模型(3甲基嘌呤，巴伐洛霉素)中的熒光成像；

圖8是實(shí)施例1中所述分子在活體水平上細(xì)胞自噬激活模型中的熒光成像；

圖9是實(shí)施例2中所述分子在活體水平上細(xì)胞自噬激活模型中的光聲成像。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

實(shí)施例1：分子探針的制備

1、以AIE效應(yīng)的雙芘分子探針為例，響應(yīng)性多肽序列為：

Gly-Lys-Gly-Ser-Phe-Gly-Phe-Thr-Gly。

多肽合成采用Fmoc固相合成法合成：(1)合成選用0.35mM修飾密度的Wang樹(shù)脂，其中第一個(gè)氨基酸(甘氨酸)C端被固定于樹(shù)脂上，N端被Fmoc保護(hù)，用20％(v/v)的六氫吡啶的DMF溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用茚三酮測(cè)試法測(cè)試去保護(hù)結(jié)果；

(2)將下一個(gè)氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基嗎啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液活化，并加入到脫去保護(hù)的樹(shù)脂中反應(yīng)2小時(shí)，其中第二個(gè)氨基酸采用側(cè)鏈氨基為Dde保護(hù)的賴氨酸，完成所有序列氨基酸的反應(yīng)后，將雙芘分子作為最后一個(gè)氨基酸重復(fù)上述步驟偶聯(lián)在多肽的N端；

(3)將0.2％水合肼脫除第二個(gè)氨基酸(賴氨酸)的側(cè)鏈氨基保護(hù)，將四代羧基樹(shù)枝狀分子偶聯(lián)在賴氨酸側(cè)鏈氨基上，再用含有2.5％水和2.5％三異丙基硅烷的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹(shù)脂上脫除，同時(shí)脫除其他氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)，將三氟乙酸用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除，然后產(chǎn)物用無(wú)水乙醚沉淀，洗滌并干燥，得到本發(fā)明所述的分子探針。

上述方法所得到的AIE效應(yīng)的雙芘分子探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

其核磁圖譜如圖1所示，從圖中可以看出虛框中的峰為合成的雙芘分子和響應(yīng)性多肽的結(jié)構(gòu)，四代樹(shù)枝狀分子結(jié)構(gòu)有箭頭標(biāo)出，說(shuō)明得到了設(shè)計(jì)的分子探針。

制備得到的分子探針的單體和聚集體的熒光光譜及在細(xì)胞自噬ATG4半胱氨酸酶作用下的熒光信號(hào)變化，其結(jié)果分別如圖2、圖3所示，由圖2和圖3可見(jiàn)，本發(fā)明的分子探針具有單體熒光淬滅和酶作用下產(chǎn)生聚集體并可見(jiàn)信號(hào)增強(qiáng)特性。

2、細(xì)胞水平細(xì)胞自噬成像實(shí)驗(yàn)：

選取MCF-7細(xì)胞為細(xì)胞自噬細(xì)胞模型。2×10⁵個(gè)細(xì)胞首先接種在專用的細(xì)胞共聚焦培養(yǎng)皿中并在含10％的PBS DMEM 37℃以及5％CO₂的條件下，孵育15個(gè)小時(shí)；再加入1μM的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，保持在37℃以及5％CO₂的條件下，孵育1個(gè)小時(shí)；將100μg/mL分子探針加入培養(yǎng)皿中，2小時(shí)后進(jìn)行共聚焦成像。成像使用Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡。激發(fā)光為405nm，收集450-600nm波段。從圖4中可以看出，在雷帕霉素處理的細(xì)胞中檢測(cè)有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說(shuō)明該細(xì)胞處于自噬激活的狀態(tài)；沒(méi)有經(jīng)過(guò)雷帕霉素處理的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，說(shuō)明該細(xì)胞處于自噬非激活的狀態(tài)。另外通過(guò)應(yīng)用細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，我們檢測(cè)了細(xì)胞自噬激活前后的實(shí)時(shí)狀態(tài)。其結(jié)果如所圖5所示，在雷帕霉素處理之前的細(xì)胞中并沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，但在雷帕霉素加入之后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明雷帕霉素激活了細(xì)胞自噬,并隨時(shí)間變化而增強(qiáng)。

我們驗(yàn)證了分子探針能否提供細(xì)胞自噬水平的定量信息。應(yīng)用雷帕霉素建立細(xì)胞自噬水平不同的細(xì)胞模型，0μM雷帕霉素處理的細(xì)胞熒光信號(hào)定為100％。其結(jié)果如所圖6所示，隨著雷帕霉素濃度的增加，檢測(cè)得到的熒光信號(hào)強(qiáng)度從100％(0μM)增強(qiáng)到154％(0.1μM)、268％(0.5μM)、350％(1.0μM)，說(shuō)明分子探針能夠提供細(xì)胞自噬水平的定量信息。

3、分子探針特異性成像

選取EBSS緩沖液(饑餓)、雷帕霉素為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，選取3甲基嘌呤、巴伐洛霉素為細(xì)胞自噬抑制劑分別與MCF-7細(xì)胞孵育建立細(xì)胞自噬激活及抑制模型。100μg/mL分子探針加入培養(yǎng)皿中，2小時(shí)后進(jìn)行共聚焦成像。成像使用Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡。激發(fā)光為405nm，收集450-600nm波段。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察分子探針對(duì)細(xì)胞自噬激活和非激活狀態(tài)的響應(yīng)。

結(jié)果如圖7所示，在雷帕霉素和饑餓處理兩個(gè)小時(shí)的細(xì)胞自噬激活模型中檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)；在3甲基嘌呤、巴伐洛霉素處理的細(xì)胞自噬抑制模型中，沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。結(jié)果說(shuō)明分子探針對(duì)細(xì)胞自噬激活狀態(tài)有特異性響應(yīng)。

4、活體水平細(xì)胞自噬成像實(shí)驗(yàn)

選取2dpf斑馬魚(yú)胚胎為活體模型。首先2dpf斑馬魚(yú)胚胎在含1μM的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素的養(yǎng)魚(yú)水中孵育24小時(shí)，將100μg/mL分子探針加入養(yǎng)魚(yú)水中，4小時(shí)后進(jìn)行共聚焦成像，確定分子探針可以用于活體水平細(xì)胞自噬的成像。

結(jié)果如圖8所示，在生理鹽水處理的細(xì)胞自噬抑制斑馬魚(yú)模型中，沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，但在雷帕霉素處理的細(xì)胞自噬激活模型中檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說(shuō)明分子探針可用于活體水平細(xì)胞自噬成像實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：活體水平細(xì)胞自噬光聲成像實(shí)驗(yàn)

以具有聚集產(chǎn)生增強(qiáng)光聲信號(hào)特性的紫紅素18分子探針在小鼠腫瘤模型中檢測(cè)細(xì)胞自噬成像為例。其分子探針化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

選取6-7周BALB/c裸鼠，在后腿部肌肉注射1×10⁷個(gè)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞建立小鼠后腿部腫瘤模型。通過(guò)尾靜脈注入1μM的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素100μL細(xì)胞自噬激活腫瘤模型，之后通過(guò)尾靜脈注入濃度為100μg/mL分子探針200μL，選取0.25、0.5、1、2、4、6、7、9、12和24小時(shí)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，觀察在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)腫瘤部位細(xì)胞自噬水平的成像。

結(jié)果如圖9所示，生理鹽水處理的小鼠腫瘤部位，任何時(shí)間段都沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，說(shuō)明生理鹽水處理的小鼠腫瘤部位細(xì)胞自噬水平很低；在雷帕霉素處理的小鼠腫瘤部位，0.25小時(shí)時(shí)檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。7小時(shí)時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大，但之后隨著時(shí)間變化熒光信號(hào)強(qiáng)度隨之變?nèi)酢Ｕf(shuō)明雷帕霉素處理的小鼠腫瘤部位細(xì)胞處于自噬激活的狀態(tài)，分子探針注入7小時(shí)時(shí)檢測(cè)效果最好，之后腫瘤部位的分子探針可能被逐漸清除。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的基于雙芘的酶響應(yīng)自組裝的多肽納米材料及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。