檢測酶活性可廣泛用于生物樣品或化學(xué)樣品的分析。整個生物體、細(xì)胞或細(xì)胞提取物、生物液體或化學(xué)混合物是其中可以檢測酶活性的生物樣品或化學(xué)樣品的實(shí)例。多種疾病的許多生物標(biāo)志由酶構(gòu)成。它們還參與許多細(xì)胞過程，因此已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)家進(jìn)行許多研究的焦點(diǎn)。因此，例如，它們的檢測能夠提供關(guān)于特定代謝或發(fā)病狀況的信息。出于這一原因，能夠檢測酶活性的探針是非常有用的，并且已經(jīng)成為很多研究的焦點(diǎn)。

具體而言，可以提到本專利申請的發(fā)明人之一的工作，其對應(yīng)于涉及肽酶底物的申請WO 2013/045854和涉及糖苷酶底物的申請WO 2014/020285，兩者均使用將關(guān)注的酶的底物鍵合到芳基的自降解連接體，在底物裂解之后，連接體環(huán)化并釋放激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)熒光團(tuán)。

然而，響應(yīng)酶活性的分子探針的良好水溶性是保證它們提供可靠結(jié)果的基本標(biāo)準(zhǔn)之一。具體而言，加入有機(jī)共溶劑以溶解疏水分子一般而言大幅度降低了酶的活性。此外，雖然一些體外測試可以接受使用低濃度的溶液，但向細(xì)胞孵育或體內(nèi)全身性注射的轉(zhuǎn)變則需要使用濃度高很多的溶液，因?yàn)樗鼈冊谧⑸浜笤诤艽蟪潭壬媳幌♂?。此外，體內(nèi)不能夠使用共溶劑。最后，疏水性太強(qiáng)的分子具有在脂肪組織而非靶組織中積累的風(fēng)險。

因此，化學(xué)家們已經(jīng)關(guān)注溶解度的問題很長時間，并且已開發(fā)出許多解決方案。首先是摻入具有鹽特征的基團(tuán)作為酶底物。該方案在例如遇到磷酸酶探針(Haugland et al.Anal.Biochem.1992,207,32)或caspase-3探針(Liu et al.J.Am.Chem.Soc.2012,134,17972)時非常好地起作用，但是其限制了設(shè)想的酶的選擇，因?yàn)椴荒軌虬邢蜃R別非極性底物的酶。此外，帶負(fù)電荷的分子通過細(xì)胞膜存在困難，因此該應(yīng)用被限于靶向胞外酶。第二方案是將水溶性基團(tuán)接枝到所使用的信號團(tuán)(signalophore)上，通常是磺酸酯基(Tung et al.Tetrahedron 2006,62,578；Shabat et al.J.Am.Chem.Soc.2011,133,10960)。這里再次說明，通過這些基序提供的水溶作用是優(yōu)異的，但是這一措施不太具有吸引力，因?yàn)槠湟坏┰诿富钚院笫剐盘枅F(tuán)從初始探針釋放則就有降低信號團(tuán)性能的風(fēng)險。此外，當(dāng)將要使用固態(tài)信號團(tuán)時，不能夠簡單地展望該類型的方案。因此，這兩種可能性不能夠推廣到大量的響應(yīng)酶活性的分子探針。

目前，僅有非常少的幾種系統(tǒng)能夠提供水溶性物質(zhì)與酶底物以釋放旋光性分子為目的的通用締合。這些通常是基于取代的消除連接體(Shabat et al.J.Am.Chem.Soc.2008,130,5434)或基于環(huán)化連接體與消除連接體的組合(Shabat et al.Bioorg.Med.Chem.2007,15,7318)。問題是已知取代的消除連接體產(chǎn)生高毒性的反應(yīng)中間體(Rokita,Quinone Methides,1^st ed.2009,John Wiley and Sons Inc.；Bolton et al.Chem.Res.Toxicol.1995,8,323；Thatcher et al.J.Org.Chem.1997,62,1820)。另外，環(huán)化/消除組合是遠(yuǎn)非理想的，因?yàn)槠涓訌?fù)雜(必須連續(xù)使用兩種連接體)，同時證明了降解動力學(xué)是遠(yuǎn)非令人滿意的(Wu et al.Bioorg.Med.Chem.2012,20,3465)，或者在面對不可忽略的自發(fā)水解時是不穩(wěn)定的(Romieu et al Org.Lett.2008,10,1517)。某些構(gòu)建體在數(shù)十小時內(nèi)遞送它們的活性分子(Shabat et al.Bioconjugate Chem.2006,17,1432)，使得它們難以在快速檢測給定樣品中是否存在某些分析物中使用。

因此，期望開發(fā)新一代的環(huán)化連接體，其能夠用于以通用的且滿足溶解度要求的方式并入任何酶底物，無論該酶底物是極性的或是非極性的。然而，這一連接體必須保留快速的降解動力學(xué)，并且必須允許有效的酶識別。

在本發(fā)明的上下文中，發(fā)明人提出了新一代的探針，由于存在哌嗪基團(tuán)，其中一個氮原子能夠攜帶多種水溶性基團(tuán)，該探針能夠提供令人滿意的水溶性，并且還易于合成和修飾。發(fā)明人選擇提出的方案是在探針的第三組件上(即在連接信號團(tuán)和底物的連接體中)并入水溶性部分，這意味著可以選擇任何期望的酶底物和任何期望的報道分子。

根據(jù)本發(fā)明的探針具有式(I)：

其中

-X₁＝NH、O或S；

-X₂＝O或S；

-SE是不穩(wěn)定基團(tuán)，特別是酶底物；

-A是芳香基，其在水溶液中在C(X₂)-O鍵裂解后釋放發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)；

-R表示氫原子或-(L)n-GP，且n等于0或1；

-L是連接臂；且

-GP是水溶性基團(tuán)；

以及它們的生理學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。

本發(fā)明可以用于通過檢測具有下式的哌嗪基型連接體環(huán)化之后釋放的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，進(jìn)而檢測能夠裂解X₁-SE鍵的化學(xué)或酶分析物：

根據(jù)本發(fā)明的底物用作能夠揭示刺激(如酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性(特別是pH的改變))存在的分子探針。當(dāng)探針通過所述刺激化學(xué)修飾時，其通過級聯(lián)反應(yīng)的方式形成碎片以釋放可檢測的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。也可能是當(dāng)基團(tuán)A連接到式(I)的探針中分子的剩余部分時，基團(tuán)A充當(dāng)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。關(guān)于“比率型(ratiometric)”探針，它們的光譜性質(zhì)，特別是吸光度和/或熒光性質(zhì)不同于在刺激(如酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性)的作用下釋放的實(shí)體。有利地但不是必須地，可以以使得式(I)的探針在遇到刺激(特別是酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性的形式)之前不能通過光的吸收或發(fā)射檢測的(即探針被稱為“隱秘的(furtive)”)方式選擇基團(tuán)A。

不穩(wěn)定基團(tuán)SE是如下基團(tuán)：其例如由酶途徑或在純化學(xué)作用(如pH變化或存在還原劑)下連續(xù)的消除通過自降解連接體的分子內(nèi)重排確保了熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)的釋放，特別是以A-OH或A-O^-，或A'＝O的形式(A'＝O是在A-OH重排之后獲得的形式，A-OH的互變異構(gòu)形式或聚合形式)。SE-X₁鍵的裂解通過以下方案1所示的連接體的環(huán)化觸發(fā)了熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)的釋放，特別為A-OH或A-O^-，或A'＝O(A'＝O是在A-OH或A-O^-重排之后獲得的形式，A-OH的互變異構(gòu)形式或聚合形式)：

方案1

探針由四個分子組件組成：i)在一端攜帶的智能連接體，ii)不穩(wěn)定基團(tuán)SE，以及在另一端的iii)經(jīng)由連接體的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯基團(tuán)鍵合的有機(jī)基團(tuán)A-O，當(dāng)其通過使連接體-A-O偶聯(lián)物形成碎片來釋放以提供相應(yīng)的烯醇或烯醇化物化合物時，其導(dǎo)致可檢測的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的形成，以及iv)水溶性基團(tuán)。

在本發(fā)明的上下文中，攜帶基團(tuán)R的氮原子的存在意味著探針的性質(zhì)能夠被修飾，并且在不穩(wěn)定基團(tuán)SE和基團(tuán)A側(cè)能夠引入第三官能團(tuán)，在基團(tuán)SE釋放和連接體環(huán)化之后釋放可檢測的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。

事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明的式(I)的探針包括能夠用于并入多種選擇的酶底物的可多官能化的哌嗪型連接體，以及伴隨的基團(tuán)R，該伴隨的基團(tuán)R依據(jù)其性質(zhì)能夠用于賦予分子更高的水溶性。氮原子的存在意味著從相同的合成中間體開始，能夠產(chǎn)生多種水溶性官能團(tuán)R。

此外，根據(jù)本發(fā)明的探針與申請WO 2013/045854和WO 2014/020285中示例的包含哌啶基型連接體的其同系物相比，以及與根本不包含連接體的市售試劑相比，其溶解度提高，所述市售試劑如4-甲基-7-(苯乙酰氨基)香豆素或4-甲基傘形酮基乙酸酯(4-methylumbelliferyl acetate)，例如：

此外，對于申請WO 2013/045854和WO 2014/020285，探針包括在SE-X₁鍵裂解之后對環(huán)化已經(jīng)進(jìn)行預(yù)組織的連接體，其加速了連接體的自降解過程，同時保證了良好的酶識別。然而，其根本不清楚，在本發(fā)明的上下文中進(jìn)行的連接體的修飾，其中引入基團(tuán)以增加水溶性，對于探針的報道活性沒有影響。然而，在本發(fā)明的上下文中已經(jīng)證明，在基團(tuán)R并且因此在接近刺激(即酶、化學(xué)化合物、或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性，取決于基團(tuán)SE的性質(zhì))作用位點(diǎn)的位置引入電荷或增加位阻沒有改變在相應(yīng)刺激的作用下獲得的反應(yīng)。

因此，本發(fā)明提供了式(I)的化合物，不論其在本專利申請中描述的變化為何，用于在人或動物中體內(nèi)檢測或者體外、活細(xì)胞(in cellulo)或離體檢測刺激，如酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性，所述刺激的存在引起了SE-X₁鍵的裂解。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了借助于根據(jù)本發(fā)明的式(I)的探針檢測刺激如酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性的存在的體外方法，該刺激的存在引起了SE-X₁鍵的裂解。更精確地說，本發(fā)明提供了檢測刺激如酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性的存在的方法，該刺激的存在引起了SE-X₁鍵的裂解，該方法包括以下步驟：

-使懷疑含有所述化學(xué)化合物或所述酶或具有所述物理化學(xué)特性的樣品與根據(jù)本發(fā)明的式(I)的探針接觸；

-施加適當(dāng)條件以允許X₁和SE之間的共價鍵在所述刺激的作用下裂解，隨后在式(I)的探針中存在的連接體環(huán)化之后使攜帶原子(X₂)的碳原子與攜帶基團(tuán)A的氧原子之間的C-O鍵裂解；以及

-定量或定性分析釋放的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。

樣品可以是任何合適的生物樣品。具體地，其可以是生物流體樣品，特別是以下樣品：全血、血清、血漿、尿、組織樣品或分離的細(xì)胞，且特別是從細(xì)胞培養(yǎng)基分離的。該樣品可以原樣使用，或其可以在與探針接觸前經(jīng)受本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的富集或培養(yǎng)類型的預(yù)備工作。

有利地，式(I)的化合物作為探針以開/關(guān)模式起作用，即探針在用刺激(即酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性的變化，取決于基團(tuán)SE的性質(zhì))裂解之前是“不可見的”。還可能以例如獲得i)攜帶原子(X₂)的碳原子與攜帶基團(tuán)A的氧原子之間的C-O鍵裂解之后釋放的基團(tuán)和ii)式(I)的探針之間不同的光譜性質(zhì)的方式選擇基團(tuán)A。

具體地，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法可以在生理學(xué)條件下，特別是在緩沖到pH 4-9，并且特別是緩沖到pH約7.4的水性介質(zhì)中進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，熒光團(tuán)被釋放，并且其分析包括以下步驟：

-將熒光團(tuán)暴露于能夠產(chǎn)生該熒光團(tuán)的吸收波長的光的光源；并且

-檢測所得的熒光。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，發(fā)色團(tuán)被釋放，并且其分析包括以下步驟：

-將發(fā)色團(tuán)暴露于能夠產(chǎn)生該發(fā)色團(tuán)的吸收波長的光的光源；并且

-檢測被發(fā)色團(tuán)吸收的光。

當(dāng)發(fā)色團(tuán)被釋放時，在刺激(即酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性的變化，取決于基團(tuán)SE的性質(zhì))的作用后檢測顏色變化。

優(yōu)選地但不是必須地，釋放的熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)，特別是A-OH或A-O^-、或A'＝O形式(A'＝O是在A-OH或A-O^-重排之后獲得的形式，A-OH的互變異構(gòu)形式或聚合形式)在水溶液中形成沉淀。

下文將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。

不穩(wěn)定基團(tuán)(labilegroup)SE的定義

SE是在水溶液中能夠在刺激作用下被消除的不穩(wěn)定基團(tuán)，該刺激具體可以是存在酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性。SE具體可以在水性介質(zhì)中被消除?？商峒暗奈锢砘瘜W(xué)特性的實(shí)例為pH的改變或改變氧化還原電位，后者裂解存在的二硫橋，特別是在其中X₁＝S的情況下。優(yōu)選地，特別是當(dāng)X₁＝NH或O時，不穩(wěn)定基團(tuán)SE對化學(xué)化合物(靶試劑)或酶敏感。酶被定義為催化化學(xué)反應(yīng)的天然蛋白。

優(yōu)選地，不穩(wěn)定基團(tuán)SE確保識別靶(化學(xué)或酶化合物、介質(zhì)的物理化學(xué)參數(shù))，特別是酶，其選擇性地位于組織或靶細(xì)胞類型中。

SE基團(tuán)具有能夠在刺激作用下從分子的剩余部分裂解的特征，該刺激具體可以是存在酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)的物理化學(xué)特性。當(dāng)SE是酶底物時，則酶用作SE與鍵合到SE的原子X₁之間裂解的催化劑。這一類型的切割是在水性介質(zhì)中水解的結(jié)果，其中酶用作催化劑。雖然，這里的切割同樣涉及水解，術(shù)語“裂解”用于對水解反應(yīng)具有催化活性的酶作用。

X₁的選擇應(yīng)該隨著SE基團(tuán)的變化而調(diào)整，并且特別隨著所選的酶底物的變化而調(diào)整，以諸如獲得所期望的裂解的方式。具體地，當(dāng)SE是酯酶、糖苷酶、磷酸酶、硫酸酯酶或葡糖醛酸酶底物時，X₁應(yīng)該是氧，當(dāng)SE是蛋白酶底物，特別是酰胺酶或轉(zhuǎn)移酶時，X₁應(yīng)該是NH，并且當(dāng)X₁-SE是通過還原劑裂解的二硫鍵時，X₁應(yīng)該是硫。

具體地，取決于設(shè)想的根據(jù)本發(fā)明的探針的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇選自以下的至少一種酶的底物：酯酶，如羧酸酯酶，或脂酶；堿性磷酸酶；葡糖醛酸酶，如β-葡糖醛酸酶；糖苷酶；蛋白酶，如金屬蛋白酶；肽酶和酰胺酶。

SE基團(tuán)優(yōu)選地以諸如對關(guān)注的酶具有特異性的方式選擇。相反，某些酶具有裂解不同組的SE基團(tuán)的能力；其中可以提及氨基己糖苷酶和酯酶。

這一類型的酶具體地應(yīng)選自：糖基，該糖基經(jīng)由其異頭碳鍵合到分子的剩余部分；脂肪酸，該脂肪酸經(jīng)由其酰基官能團(tuán)鍵合到分子的剩余部分；肽基，該肽基經(jīng)由其末端碳或側(cè)鏈攜帶的?；倌軋F(tuán)鍵合到分子的剩余部分；或與X₁形成磺酰胺的磺酰基，X₁表示NH。

具體地，SE可以是糖苷酶底物，特別是半乳糖苷酶，并且對應(yīng)于糖基，該糖基經(jīng)由其異頭碳結(jié)合到分子的剩余部分。

術(shù)語“糖苷酶”是指糖苷水解酶，其具有以諸如釋放至少一個糖苷(osidic)化合物的方式催化糖苷鍵水解的能力。

術(shù)語“糖基”基團(tuán)是指任何糖、單糖或多糖，其經(jīng)由糖苷鍵(即經(jīng)由其異頭碳)鍵合到分子的剩余部分。異頭碳可采用α或β構(gòu)型?？商峒暗腟E基團(tuán)的實(shí)例是單糖基(即通過單個糖單元形成的)或多糖基(即通過幾個相同或不同的糖單元形成的)。例如，糖單元可具體為己糖或戊糖型，并且選自半乳糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、阿洛糖、阿卓糖、艾杜糖、塔羅糖、巖藻糖、果糖、阿拉伯糖、來蘇糖、核糖和木糖。糖單元可具有L或D立體化學(xué)。構(gòu)成糖苷酶底物的所有可能的糖基可用作SE。糖基單元可任選地被官能化，特別是用乙?；虬被-乙?；被禾鞘翘腔膶?shí)例。通常，SE基團(tuán)包括1至50個糖單元。對于多糖基，其可以是具有無規(guī)結(jié)構(gòu)、交替結(jié)構(gòu)或嵌段結(jié)構(gòu)的均聚物或共聚物。

充當(dāng)糖苷酶底物的這一類型的SE基團(tuán)的實(shí)例如下：單糖基化基團(tuán)，選自半乳糖基、葡萄糖基、甘露糖基、古洛糖基、阿洛糖基、阿卓糖基、艾杜糖基、塔羅糖基、巖藻糖基、果糖基、阿拉伯糖基、來蘇糖基、核糖基、木糖基、葡糖醛酸基和N-乙酰基-氨基己糖基；和多糖基化基團(tuán)，其由多個(特別是2至20個，優(yōu)選3至10個，更特別是4至6個)相同或不同的這些單糖基化基團(tuán)組成。

可提及的可被根據(jù)本發(fā)明的探針靶向的糖苷酶的實(shí)例是N-乙?；?β-氨基半乳糖苷酶；N-乙?；?β-氨基葡糖苷酶；α-淀粉酶；α-阿拉伯呋喃糖苷酶；α-阿拉伯糖苷酶；β-纖維二糖苷酶；β-殼二糖苷酶；α-半乳糖苷酶；β-半乳糖苷酶；α-葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；β-葡糖醛酸酶；α-麥芽糖苷酶；α-甘露糖苷酶；β-甘露糖苷酶；β-木糖苷酶；β-D-巖藻糖苷酶；α-L-巖藻糖苷酶；β-L-巖藻糖苷酶；L-艾杜糖醛酸酶；或纖維素酶(Orenga,S.,James,A.L.,Manafi,M.,Perry,J.D.,&Pincus,D.H.(2009).Enzymatic substrates in microbiology.Journal of Microbiological Methods,79(2),139-155)。

SE還可以是半乳糖苷酶(特別是β-半乳糖苷酶)、艾杜糖醛酸酶(induronidase)、葡糖苷酶、N-乙?；?D-氨基葡糖苷酶、N-乙?；?D-氨基半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、巖藻糖苷酶或葡糖醛酸酶(更特別是β-葡糖醛酸酶)的底物。

充當(dāng)半乳糖苷酶底物的這一類型的SE基團(tuán)的實(shí)例如下：單糖基化基團(tuán)，選自D-葡糖醛酸基、L-艾杜糖醛酸基、D-吡喃葡萄糖基、D-半乳吡喃糖基、N-乙?；?D-氨基葡萄糖基、N-乙?；?D-氨基半乳糖基、D-吡喃甘露糖基、L-吡喃巖藻糖基；和多糖基化基團(tuán)，其由多個(特別是2至20個，優(yōu)選3至10個，更特別是4至6個)可以相同或不同的這些單糖基化基團(tuán)組成。

SE還可以是酯酶底物，特別是脂酶。在這樣的情況下，SE是?；浣?jīng)由其C(O)官能團(tuán)鍵合至分子的剩余部分。具體地，SE可以是-C(O)Ri，其中Ri表示例如優(yōu)選地含有1至20個碳原子的烷基、優(yōu)選地含有1至20個碳原子的烯基，或芐基、芳基或雜芳基。

SE還可以是蛋白酶或肽酶的底物，特別是組織蛋白酶或金屬蛋白酶的底物，特別是前列腺特異性膜抗原(PSMA)。

在這種情況下，SE是肽基或氨基酸基團(tuán)，其經(jīng)由其末端碳或側(cè)鏈攜帶的酰基官能團(tuán)鍵合到分子的剩余部分。

術(shù)語“肽基”基團(tuán)是指經(jīng)由肽鍵鍵合在一起的至少兩個氨基酸的串聯(lián)。在本發(fā)明的上下文中，SE中存在的一個或多個氨基酸可以是天然氨基酸或其他氨基酸，但應(yīng)優(yōu)選地選自20種天然氨基酸(＝蛋白原的)，其任選地以鹽的形式或以受保護(hù)的形式。末端氨基酸的N-末端官能團(tuán)可以任選地以鹽的形式或以官能化的形式。可提及的鹽形式的實(shí)例是鹽酸鹽、甲苯磺酸鹽或三氟乙酸鹽形式。

構(gòu)成肽酶底物的任何可能的肽基或氨基酸基團(tuán)可用作SE基團(tuán)。氨基酸可以任選地被官能化，特別是在SE的N-末端上。在具體的實(shí)施方式中，肽基殘基SE具有至多10個氨基酸，它們可以是相同或不同的。肽基殘基SE的氨基酸優(yōu)選地選自天然氨基酸。然而，氨基酸或肽基的N-末端可以用?；?COR₀官能化，R₀是(C₁-C₆)烷基或-O-(C₁-C₆)烷基。具有酰基(R₀CO-)的給定探針的N-末端的可能官能化源自以下事實(shí)：某些內(nèi)切蛋白酶不與在其末端具有游離氨基的底物相互作用。此外，當(dāng)SE表示肽基時，優(yōu)選該N-末端官能化，而當(dāng)SE表示氨基酸時，其N-末端官能團(tuán)可以是游離的，或優(yōu)選地是以鹽形式，如銨化合物。使用氨基甲酸酯保護(hù)基(其在本上下文中也構(gòu)成“?；被鶊F(tuán))的固相肽合成(SPPS)通?？捎糜谠谠揘-末端具有氨基甲酸酯的探針的更簡單的合成。對于氨基-肽酶，優(yōu)選使用表示氨基酸的SE基團(tuán)，而對于內(nèi)切肽酶，優(yōu)選使用表示肽基的SE基團(tuán)。

舉例來說可以提及以下肽基：Leu(對于亮氨酸氨基肽酶)、Ser-Gln-Asn-Tyr(HIV-1的肽酶的優(yōu)選裂解序列的N-末端部分)、Asp-Glu-Val-Asp-(對于caspase 3)、His-Ser-Ser-Lys-Leu-Gln(對于前列腺特異性抗原，“PSA”)，其中N-末端可以是游離的，或被?；?COR₀取代，R₀是(C₁-C₆)烷基或-O-(C₁-C₆)烷基(例如-COMe基團(tuán))。

肽基或氨基酸基團(tuán)依據(jù)其與識別它的靶肽酶的已知序列選擇性的相容性來選擇。肽基或氨基酸基團(tuán)可依據(jù)某些疾病所涉及的肽酶對其的優(yōu)選作用來選擇，具體如表1所示。

表1：成像期間可作為生物學(xué)現(xiàn)象或疾病的生物標(biāo)志的肽酶的實(shí)例

SE也可以是酰胺酶底物，其催化非肽酰胺鍵特別是青霉素酰胺酶、脂肪酸酰胺水解酶或丙二酰胺酶的底物的水解。

SE還可以是催化官能團(tuán)從一個底物轉(zhuǎn)移到另一個底物的轉(zhuǎn)移酶底物，特別是轉(zhuǎn)氨酶底物，或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶底物或γ-谷氨酰基/轉(zhuǎn)移酶底物。在這種情況下，SE對應(yīng)于經(jīng)由其末端碳或側(cè)鏈攜帶的?；倌軋F(tuán)鍵合的肽基或氨基酸基團(tuán)，或形成磺酰胺的磺酰基，其中X₁表示NH。

蛋白酶底物是公知的，并且特別描述在“Handbook of proteolytic enzymes(蛋白水解酶手冊)”(Ralings and Salvesen,2013,3rd edition,Elsevier Ltd)以及在線MEROPS數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml,Bateman et al.Nucleic acid res.2014,42,D503)，參考上述文獻(xiàn)獲取更多信息。

SE還可以是與化學(xué)化合物反應(yīng)的底物，特別是與X₁(其是硫原子)形成二硫橋的基團(tuán)，其被還原劑(特別是二硫蘇糖醇)或被待分析的樣品中存在的半胱氨酸還原/裂解，或通過在被分析樣品的酸化過程中在酸性介質(zhì)中裂解不穩(wěn)定鍵反應(yīng)的底物，特別是與為氧原子的X₁形成縮醛鍵的基團(tuán)，如SE基團(tuán)對應(yīng)于甲氧基甲基(-CH₂-O-CH₃)、甲氧基乙基(-CH₂-O-CH₂CH₃)、甲氧基苯基(-CH₂-O-PH)、甲氧基烯丙基(-CH₂-O-烯丙基)。

基團(tuán)A的定義

A是在CX₂-O鍵裂解后允許形成發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的芳香基團(tuán)。該發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)可直接對應(yīng)于釋放的化合物A-OH或其在水溶液中形成的A-O^-形式，或?qū)?yīng)于釋放的化合物A-OH或A-O^-的裂解后反應(yīng)(如二聚化)所得的化合物，或?qū)?yīng)于化合物A-OH或A-O^-的裂解后重排(例如以產(chǎn)生互變異構(gòu)形式)所形成的化合物。這一類型的化合物被表示為A'＝O。

術(shù)語“芳香基團(tuán)”是指包含一個或多個可以任選地被取代的芳香環(huán)的基團(tuán)，所述環(huán)可能包含一個或多個選自氮、氧或硫原子的雜原子和/或一個或多個羰基C＝O形式的碳原子。例如且優(yōu)選地，A包含4至40個碳原子和0至10個選自氮、氧或硫原子的雜原子。具體地，芳香基團(tuán)A可以是單環(huán)碳環(huán)、雙環(huán)碳環(huán)或具有多于兩個環(huán)的多環(huán)碳環(huán)，并且優(yōu)選地含有5至40個鍵，優(yōu)選地6至15個鍵，并且包含至少一個芳香環(huán)，所述碳環(huán)任選地包含整合到碳環(huán)中的至少一個選自氧、氮或硫原子的雜原子和/或以羰基C＝O形式形成碳環(huán)的一個或多個碳原子，這一類型的碳環(huán)可能是未取代的，或攜帶一個或多個取代基。芳香基團(tuán)具體包括芳基和雜芳基，其可以是取代的或未取代的。可提及的未取代形式的這一類型的碳環(huán)的實(shí)例是苯基、萘基、2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃甲?；?、2-或3-噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、唑基、異唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、噻二唑基、二唑基、三唑基、噠嗪基、吲哚基和吡喃酮基。

發(fā)色團(tuán)是能夠吸收一部分可見光光譜的分子?？商峒暗陌l(fā)色團(tuán)的實(shí)例是對硝基苯酚及其衍生物、在水性有氧介質(zhì)中形成沉淀的對應(yīng)烯醇衍生物(因此對應(yīng)于A'＝O)二聚之后獲得的靛類染料，或者是在某些金屬存在下形成有色沉淀的化合物，如環(huán)己烯并七葉內(nèi)酯(CHE)、茜素或羥基黃酮：

羥基吲哚可以被一個或多個X₃取代，X₃可以相同或不同，選自氯、溴、碘或氟原子，并且位于苯環(huán)的任何位置上。

熒光團(tuán)是在其經(jīng)受合適波長的光激發(fā)時能夠產(chǎn)生熒光的分子?！盁晒狻笔怯媒o定波長的光激發(fā)時發(fā)射更長波長的光的分子的性質(zhì)。熒光是熒光團(tuán)與入射光子相互作用而產(chǎn)生的現(xiàn)象。該過程被稱為激發(fā)。光子的吸收使熒光團(tuán)中的電子從其基態(tài)遷移到更高的能級中。隨后，電子通過發(fā)射光子回到其最初的能級。該過程被稱為熒光發(fā)射。然后，熒光團(tuán)在比吸收的光子的波長更高的波長下發(fā)射光。這簡單地是因?yàn)橐韵率聦?shí)：由于其激發(fā)態(tài)過程中能量消散，發(fā)射光子的能量低于吸收光子的能量。這一定義在專利申請WO 2004/058787中給出。

能夠釋放這一類型的熒光團(tuán)的-OA基團(tuán)的實(shí)例如下：

可提及的允許在釋放的分子A-OH或A-O^-重排之后釋放熒光團(tuán)的-OA基團(tuán)的實(shí)例是以下熒光團(tuán)(第二個被描述在：Shabat et al.J.Am.Chem.Soc.2012,134,20412)：

根據(jù)具體實(shí)施方式，-OA基團(tuán)以以下方式選擇：例如以在式(I)的化合物中攜帶原子(X₂)的碳原子和攜帶基團(tuán)A的氧原子之間的C-O鍵裂解之后獲得對應(yīng)于ESIPT熒光團(tuán)的化合物AOH，其可以任選地在水溶液中沉淀出來。ESIPT熒光團(tuán)是包含至少一個參與質(zhì)子的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移的羥基的化合物，其允許熒光團(tuán)分子的互變異構(gòu)化和熒光的發(fā)射。這一類型的-OA基團(tuán)的實(shí)例具有式(AA)：

其中：

·X₅是氧原子，且X₄是-NH₂、-OH、-SH、烷基、芳基、-O-烷基、-O-苯基、-NH-烷基、-NH-苯基、-S-烷基或-S-芳基，所述烷基和苯基可能是取代的或未取代的；或

·X₅表示氮原子，并且與X₄鍵合以形成取代的或未取代的雜芳基，X₄表示CH、O、S、N或NH，所述取代的或未取代的雜芳基優(yōu)選地選自喹唑(quinazole)、咪唑、苯并咪唑、噻唑、苯并噻唑、唑、苯并唑、吡啶和喹啉；并且

表示芳基或雜芳基，其可以是取代的或未取代的，例如選自苯基和萘基，和：

所述基團(tuán)可能是取代的或未取代的；

其中X₆表示S、O或NR"，并且R"表示氫原子或(C₁-C₄)烷基。

當(dāng)基團(tuán)-OA(其AOH形式表示ESIPT熒光團(tuán))包括幾個羥基，則-OA基團(tuán)的氧原子是參與分子內(nèi)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移的羥基的氧原子。將這一羥基并入到式(I)的化合物的氨基甲酸酯基團(tuán)防止內(nèi)部氫鍵的形成和熒光團(tuán)的互變異構(gòu)化。

ESIPT熒光團(tuán)顯示出超過100納米(nm)并且經(jīng)常達(dá)到200nm的斯托克斯位移。如果ESIPT熒光團(tuán)的酚型OH基團(tuán)被烷基化、?；蛞粤硪环绞焦倌芑@防止輻射激發(fā)期間氫原子轉(zhuǎn)移到式(AA)給出的示例中的雜原子X₅，并因此防止質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程的熒光發(fā)射特性，則所有的ESIPT熒光團(tuán)喪失了這一熒光發(fā)射，對應(yīng)于超過100nm的斯托克斯位移。

在這種情況下，基團(tuán)A通常對應(yīng)于未取代或取代的和/或與一個或多個任選地包含雜原子(如氮)的不飽和碳環(huán)稠合的苯基。苯氧基形式的這一基團(tuán)-OA當(dāng)不與底物鍵合時，其質(zhì)子化形式對應(yīng)于苯酚化合物HO-A，其屬于ESIPT熒光團(tuán)類。

例如，苯氧基類型的-OA基團(tuán)對應(yīng)于以下優(yōu)選的結(jié)構(gòu)(BB)或(CC)：

*

其中

·T是-NH-C(O)-、-S-、-O-、-NH、N-烷基或N-芳基；

·Ra是氫或吸電子含碳取代基，如-CN或-COORd，且Rd表示(C₁-C₄)烷基，或者Ra是-CONReRf，且Re和Rf可以是相同或不同的，表示氫或(C₁-C₄)烷基，或者Ra是-CF₃或2-唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基；

·Rb是氫、氯、溴、碘或氟原子、-OH、-NH₂、-NRgRh、-NHRg或-ORg，其中Rg和Rh各自獨(dú)立地表示(C₁-C₄)烷基；

·或者Ra和Rb鍵合在一起以形成含有4或5個鍵的烴鏈，其可以是飽和或不飽和的、取代的或未取代的，任選地被一個或多個選自N、S和O的雜原子中斷；

·Rc是氫、Br、Cl、I或F；

其中：

·T'是NH₂、OH、芳基、(C₁-C₄)烷基、SH、NHR'c、OR'c、NR'cR'd或SR'c，其中R'c和R'd可以相同或不同，表示(C₁-C₄)烷基或芳基；

·R'a是氫或吸電子含碳取代基，如-CN或-COOR'e，其中R'e表示(C₁-C₄)烷基，或R'a是-CONR'fR'g，其中R'f和R'g可以相同或不同，表示氫或(C₁-C₄)烷基，或者R'a是-CF₃或2-唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基；

·R'b是氫、氯、溴、碘或氟原子、-OH、-NH₂、-NR'hR'i或-OR'h，其中R'h和R'i可以相同或不同，表示(C₁-C₄)烷基；

·或者R'a和R'b鍵合在一起以形成含有4或5個鍵的烴鏈，其可以是飽和的或不飽和的、取代的或未取代的，任選地被一個或多個選自N、S和O的雜原子中斷。

對于更多細(xì)節(jié)，可具體參照申請WO 2013/045854和WO 2014/020285A，其提供了這一類型的ESIPT熒光團(tuán)的實(shí)例。

可提及的對應(yīng)ESIPT型熒光團(tuán)的OA基團(tuán)的更具體的實(shí)例如下：

在右側(cè)所示的HPQ(羥基苯基喹唑啉酮)或HPQ的任何類似物的這一類型的熒光團(tuán)的非常大的斯托克斯位移(約170nm)貢獻(xiàn)了探針的優(yōu)異的靈敏度，并且使得釋放的熒光團(tuán)可容易地區(qū)分于可能源自將要進(jìn)行分析的生物樣品的本體熒光。

基團(tuán)R的定義

R可以表示氫原子或-(L)n-GP，其中n等于0或1。

非常常見地，出于合成原因，n＝1，且L是連接臂，并且特別是-(L1)m1-(L2)m2-(L'1)m'1-臂(方向是哌嗪->基團(tuán)GP)，其中：

·L1和L'1可以相同或不同，選自-O-、-NH-、-N(C_1-6)烷基-、-N(苯基)-、-N(芳基)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-O-、-NHC(O)-O-、-OC(O)-NH-、-NHC(O)-NH-、-S-、-SO₂-、-N＝N-、-NHC(O)-和-CONH-；

·L2選自以下二價基團(tuán)：(C_1-20)烷基、(C_1-20)烯基、(C_1-20)炔基、(C_6-24)芳基、(C_7-44)烷基芳基、(C_7-44)烯基芳基、(C_7-44)炔基芳基、(C_7-44)烷基環(huán)烷基、(C_7-44)烯基環(huán)烷基、(C_7-44)炔基環(huán)烷基、(C_7-44)烷基雜環(huán)烷基、(C_7-44)烯基雜環(huán)烷基、(C_7-44)炔基雜環(huán)烷基；所述基團(tuán)可能被三唑基團(tuán)中斷，或以三唑基團(tuán)作為末端，并且可能是未取代的或取代的，特別是被一個或多個選自以下的取代基取代：(C_1-10)烷氧基、(C_1-10)烷基、(C_6-10)芳基、酰氨基、亞氨基、次膦基(phosphido)、次氨基、(C_1-10)烯基、(C_1-10)炔基和-OH；且

·m1、m'1和m2可以相同或不同，且等于0或1。

當(dāng)臂L存在時，為了間隔GP基團(tuán)與哌嗪或出于合成原因來選擇臂L。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方式，L表示-(L1)m1-(L2)m2-(L'1)m'1，其中L1＝-C(O)-，m1＝m2＝1，m'1＝1或0，且L2和L'1如上文所定義的，并且特別地，L表示-C(O)-(CH₂)p-L3-，其中p等于1、2、3或4，且L3是三唑基團(tuán)，并且特別是1H-1,2,3-三唑基團(tuán)。

GP是水溶性基團(tuán)。

術(shù)語“水溶性基團(tuán)(hydrosolubilizing group)”是指親水基團(tuán)，其能夠用于改善探針的溶解度，特別是相對于區(qū)別僅為用CH₂代替攜帶L-GP的氮原子以獲得如申請WO 2013/045854和WO 2014/020285所描述的哌啶的探針。可提及的水溶性基團(tuán)的實(shí)例是能夠在水溶液中形成帶電物質(zhì)的基團(tuán)?？商峒暗乃苄曰鶊F(tuán)GP的實(shí)例是官能團(tuán)F₁，其選自胺(伯胺、仲胺或叔胺)、脒、胍或四唑；官能團(tuán)F₂，其選自羧酸酯、磺酸酯或磷酸酯型陰離子官能團(tuán)；包含這些官能團(tuán)F₁和/或F₂中的一個或多個的基團(tuán)；聚乙二醇；糖或多糖，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖；肽基團(tuán)，如聚賴氨酸、聚精氨酸、TAT肽等。可提及的胺官能團(tuán)的實(shí)例是-NH₂、-NH(C_1-4)烷基和二烷基胺，其中烷基是相同或不同的，并且包含1至4個碳原子。術(shù)語“包含這些官能團(tuán)F₁和/或F₂中的一個或多個的基團(tuán)”是指烷基(如(C_3-6)烷基)、芳基(如含有6個碳原子的芳基)、雜芳基(如含有6個碳原子的雜芳基)，其中這些基團(tuán)的一個或多個氫原子已經(jīng)被一個或多個官能團(tuán)F₁或被一個或多個官能團(tuán)F₂取代，或者至少一個氫原子已經(jīng)被官能團(tuán)F₁取代，并且另一個氫原子已經(jīng)被官能團(tuán)F₂取代。

探針的定義中使用的術(shù)語的定義

術(shù)語“?；倌軋F(tuán)”是指官能團(tuán)：

除非另外指明，否則術(shù)語“烷基”基團(tuán)是指飽和的直鏈或支鏈烴鏈。優(yōu)選含有1至6個碳原子的烷基?？商峒暗暮?至6個碳原子的烷基(表示為C_1-6烷基或(C₁-C₆)烷基)的具體實(shí)例是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基和正己基。

術(shù)語“芳基”基團(tuán)是指含有至少一個芳香基團(tuán)的單環(huán)、雙環(huán)或多環(huán)碳環(huán)，例如苯基、肉桂基或萘基。優(yōu)選含有6至12個碳原子的芳基。苯基是特別優(yōu)選的芳基。

當(dāng)指出“取代的”基團(tuán)時，這是指其被一個或多個取代基取代，所述取代基具體選自氯、溴、碘或氟原子、氰基、烷基、氟烷基、三氟甲基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基、烷氧基、芳氧基、-COOH和硝基、?；⒎枷慊鶊F(tuán)(特別是芳基和雜芳基)；所述烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基、?；头枷慊鶊F(tuán)本身可以是未取代的或取代的。用于這些取代基的定義的術(shù)語是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知曉的那些。

如常規(guī)的，術(shù)語“烯基”是指含有至少一個雙鍵，并且優(yōu)選地含有2至20個碳原子，且優(yōu)選地2至6個碳原子的烴鏈，其可以為直鏈或支鏈的；術(shù)語“炔基”是指含有至少一個三鍵且優(yōu)選地含有2至12個碳原子，更優(yōu)選地2至6個碳原子的直鏈或支鏈的烴鏈；術(shù)語“氟烷基”是指其中至少一個氫原子已經(jīng)被氟原子替代的且優(yōu)選地含有2至12個碳原子、優(yōu)選地2至6個碳原子的烴鏈，其可以是飽和的、直鏈或支鏈的；術(shù)語“烷氧基”和“芳氧基”分別是指O-烷基和O-芳基。

術(shù)語“環(huán)烷基”是指由至少一個環(huán)構(gòu)成的飽和烴基，所述環(huán)可以是橋接的。優(yōu)選含有3至12個碳原子的烷基。可提及的實(shí)例是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和金剛烷基。

術(shù)語“雜環(huán)烷基”是指其中至少一個碳原子已經(jīng)被選自O(shè)、S或N的雜原子代替的如上定義的環(huán)烷基?？商峒暗碾s環(huán)烷基的實(shí)例是哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、四氫吡喃基等基團(tuán)。

術(shù)語“雜芳基”基團(tuán)是指優(yōu)選地含有6至12個鍵，并且含有至少一個芳香基團(tuán)和被整合到碳環(huán)中的至少一個選自氧、氮或硫原子的雜原子的單環(huán)、雙環(huán)或多環(huán)碳環(huán)?？商峒暗碾s芳基的實(shí)例是2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃甲?；?-或3-噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、唑基、異唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、噻二唑基、二唑基、三唑基、噠嗪基和吲哚基。雜芳基還含有以下類型的基團(tuán)，其中碳環(huán)的一個或多個碳原子是以羰基官能團(tuán)C＝O的形式。

術(shù)語“?；笔侵附?jīng)由酰基官能團(tuán)C＝O的碳鍵合的基團(tuán)，并且特別是-CONH₂、-COOH、-CO芳基、-CO(C_1-4)烷基、-COSH、-CONH"_a、-CONR"_aR"_b或-COSR"_a基團(tuán)，其中R"_a和R"_b可以相同或不同，表示(C₁-C₄)烷基或芳基。

術(shù)語“(C_7-44)烷基芳基”、“(C_7-44)烯基芳基”、“(C_7-44)炔基芳基”分別是指從芳基開始、被芳基中斷或以芳基作為末端的烷基、烯基或炔基鏈。優(yōu)選含有7至22個、優(yōu)選7至16個碳原子的烷基芳基、烯基芳基和炔基芳基。

根據(jù)本發(fā)明的探針的制備

在本發(fā)明的上下文中使用的化合物根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備。它們特別可以使用與實(shí)施例中使用的方法類似的方法獲得。

根據(jù)本發(fā)明的化合物可以根據(jù)以下方案2獲得，其中A、X₁、X₂和SE如對式(I)的探針?biāo)x的，并且P₁和P₂是胺官能團(tuán)的臨時保護(hù)基，特別是在所用的反應(yīng)條件下，Y是Cl、對硝基苯酚、咪唑或N-甲基咪唑鎓或N-羥基琥珀酰亞胺類型的離去基團(tuán)，且Rp表示R或胺官能團(tuán)的臨時保護(hù)基，特別是在所用的反應(yīng)條件下，或Rp是基團(tuán)R的前體基團(tuán)。

方案2

術(shù)語“胺的保護(hù)基”是指保護(hù)基，如在Protective Groups in Organic Synthesis,Greene T.W.and Wuts P.G.M.,ed John Wiley and Sons,2006和Protecting Groups,Kocienski P.J.,1994,Georg Thieme Verlag中描述的那些?？商峒暗倪@一類型的基團(tuán)的實(shí)例是芐基(Bn)；-C(O)OR'₁基團(tuán)，其中R'₁表示含有1至12個碳原子的烷基或烯基；或-(CH₂)_m3R"₁基團(tuán)，其中R"₁表示芳基、環(huán)烷基或芴基，且m3等于0、1、2或3，并且特別是芐氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)基團(tuán)。

化合物(V)特別可由市售哌嗪獲得。通過遵循與Org.Lett.2010,12,4176中描述的程序類似但修改過的程序，可能通過鄰位鋰化反應(yīng)，隨后與多聚甲醛反應(yīng)以形成其中X₁＝O的化合物(V)，從而由雙保護(hù)的哌嗪(其中基團(tuán)之一是丁氧羰基(Boc)基團(tuán))形成化合物(V)。然后例如可通過Gabrielle合成的方式獲得其中X₁＝NH的胺衍生物(V)，而其中X₁＝S的化合物(V)可通過親核取代獲得。

優(yōu)選地，還可能使用方案3和4所示的方法，當(dāng)X₁＝O或NH時，其需要更少的步驟以制備式(VII)的化合物。在方案3和4中，A、X₁、X₂和SE如對式(I)的探針?biāo)x的，并且R₂是含有1至4個碳原子的烷基，且R₃是胺官能團(tuán)的臨時保護(hù)基，特別是在所用的反應(yīng)條件下，且Y是Cl或?qū)ο趸椒?、咪唑或N-甲基咪唑鎓或N-羥基琥珀酰亞胺類型的離去基團(tuán)，且Rp表示R或胺官能團(tuán)的臨時保護(hù)基，特別是在所用的反應(yīng)條件下，或Rp是基團(tuán)R的前體基團(tuán)。

方案3：

方案4：

在方案3中所描述的程序中，哌嗪環(huán)經(jīng)由乙二胺(X)類型的化合物對類型(XI)的市售起始產(chǎn)品的衍生物的雙親和取代獲得。

在方案4中所描述的程序中，哌嗪環(huán)經(jīng)由哌嗪酮環(huán)(XIII)的還原獲得，哌嗪酮環(huán)(XIII)由溴丙二酸酯(XIV)和乙二胺(X)類型的化合物合成。

不是H且對應(yīng)于基團(tuán)L-GP的基團(tuán)R可通過親核型取代、還原氨化或酰胺鍵形成型反應(yīng)被引入?；鶊F(tuán)L和GP之間的鍵可根據(jù)連接臂L上存在的化學(xué)官能團(tuán)，使用許多合成途徑獲得。可提及的實(shí)例是鋰化反應(yīng)(如親核取代)、肽鏈接、環(huán)加成(如Huisgen或Diels-Alder環(huán)加成)或鈀催化的偶聯(lián)(如Sonogashira或Heck偶聯(lián))。

可能在中間形成式(I')的中間體化合物，其中Rp是基團(tuán)R的前體基團(tuán)，或Rp是胺的臨時保護(hù)基。具體地，具有下式的中間體以及它們的鹽、溶劑化物或水合物構(gòu)成本發(fā)明的整體部分：

其中：

·A、X₁、X₂、SE、L1、L'1、L2、m1、m'1和m2如對(I)所定義；

·Z表示C≡CH、N3、N-氧基琥珀酰亞胺或馬來酰亞胺官能團(tuán)；且

·R'p表示胺官能團(tuán)的保護(hù)基，優(yōu)選地選自芐基；-C(O)OR'₁基團(tuán)，其中R'₁表示含有1至12個碳原子的烷基或烯基；或-(CH₂)_m3R"₁基團(tuán)，其中R"₁表示芳基、環(huán)烷基或芴基，且m3等于0、1、2或3?？商峒暗膬?yōu)選基團(tuán)R'p的實(shí)例是芐氧羰基、叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基和烯丙氧羰基。

此外，在一些情況中，式(I)的化合物可作為制備另一式(I)的化合物的中間體。特別是其中GP＝-COOH或-NH₂的式(I)的化合物就是這種情況，其特別可用于形成其中L'1＝-CONH-或-NHCO-且m'1＝1的化合物。

起始試劑是市售的或容易得到的。因此，式(I)的分子相對容易地以化學(xué)方法得到，并且可以以所討論的技術(shù)領(lǐng)域中相對低的制備成本獲得。

根據(jù)本發(fā)明的化合物的鹽是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備的。根據(jù)本發(fā)明的式(I)的化合物的鹽包括與酸或堿形成的鹽，這取決于存在的取代基。這些酸或堿可選自無機(jī)和有機(jī)的酸和堿，其可用于使式(I)的化合物以及生理學(xué)上可接受的鹽(即與體內(nèi)或體外應(yīng)用相容的鹽)適當(dāng)?shù)胤蛛x或結(jié)晶。可提及的合適的酸包括：草酸或旋光性酸，例如酒石酸、二苯甲酰酒石酸、扁桃酸或樟腦磺酸，和形成生理學(xué)上可接受的鹽的那些酸，所述生理學(xué)上可接受的鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、二氫磷酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、2-萘磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽或異硫代硫酸鹽。可提及的合適的堿的實(shí)例包括：賴氨酸、精氨酸、葡甲胺、苯乙芐胺、芐星(benzathine)和形成生理學(xué)上可接受的鹽(如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽)的那些堿。

可提及的水合形式的化合物的實(shí)例包括半水合物、一水合物和多水合物。

術(shù)語“溶劑化物”是指化合物與一個或多個溶劑分子締合而不以任何方式溶解在其中的形式，該溶劑特別是在所述溶劑化物的合成期間或在其純化期間使用的溶劑。

除非另外指明，根據(jù)本發(fā)明的多種式(I)的化合物可以是任何可能的光學(xué)異構(gòu)形式，任選地以任何比例混合。根據(jù)一個具體的實(shí)施方式，包含不對稱碳的根據(jù)本發(fā)明的化合物是以消旋形式，R和S形式是基本上等比例的。根據(jù)另一個實(shí)施方式，本發(fā)明的式(I)的化合物可以是以一種非對映體或?qū)τ丑w富集的形式，且超過80％，或甚至超過95％的非對映體或?qū)τ丑w過量，或甚至是以純異構(gòu)體形式，即超過99％的非對映體或?qū)τ丑w過量。

可以使用常規(guī)分離技術(shù)以非對映體或?qū)τ丑w富集的形式分離化合物(I)：例如，可能根據(jù)公知原理使用與旋光性酸或堿形成的消旋鹽的分級重結(jié)晶，或者更常見地，使用常規(guī)手性或非手性相色譜技術(shù)。

在本發(fā)明的上下文中，所有對于A、R、X₁、X₂和SE的定義和優(yōu)選實(shí)施方式可以組合。

具體地，根據(jù)本發(fā)明的探針具有以下特征中的一個或另一個，或甚至所有以下特征：

-X₂＝O；

-X₁＝O，且SE是糖苷酶底物或葡糖醛酸酶底物，并且對應(yīng)于經(jīng)其異頭碳鍵合到分子的剩余部分的糖基，或SE是酯酶底物，并且對應(yīng)于-C(O)Ri基團(tuán)，其中Ri例如表示優(yōu)選地含有1至20個碳原子的烷基、優(yōu)選地含有1至20個碳原子的烯基、芐基、芳基或雜芳基，或者X₁＝NH，且SE是蛋白酶或肽酶底物，并且對應(yīng)于經(jīng)由通過其末端碳或通過側(cè)鏈攜帶的?；倌軋F(tuán)鍵合的肽基；

-R表示-L-GP，其中：

оL優(yōu)選地表示-(L1)m1-(L2)m2-(L'1)m'1，其中L1＝-C(O)-，m1＝m2＝1，m'1＝1或0，且L2和L'1如上文所定義，并且特別地L表示-C(O)-(CH₂)p-L3-，其中p等于1、2、3或4，且L3是三唑基團(tuán)，并且特別是1H-1,2,3-三唑基團(tuán)；且

оGP優(yōu)選地是官能團(tuán)F₁，選自官能團(tuán)銨、羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯，并且選自聚乙二醇；

-A是本專利申請中已經(jīng)具體描述的基團(tuán)之一。

根據(jù)本發(fā)明的探針對于生命科學(xué)中的許多高靈敏度應(yīng)用是有吸引力的，并且特別是：(1)通過凝膠板上細(xì)菌菌落表達(dá)的活性(特別是酶活性)的高收率篩選(菌落分析)；(2)體外檢測活性，特別是生物液體中的酶活性(血液學(xué)等)；(3)通過流式細(xì)胞術(shù)在單細(xì)胞中檢測活性，特別是酶活性；(4)培養(yǎng)下的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)活性(特別是酶活性)的可視化(熒光顯微術(shù)和共焦顯微術(shù))；(5)酶的組織化學(xué)檢測(組織級別)；以及(6)體內(nèi)分子成像。

因此，根據(jù)本發(fā)明的探針具有許多潛在應(yīng)用。這一類型的應(yīng)用的實(shí)例包括設(shè)計對細(xì)菌菌落的分析。這些目前在凝膠板(陪替氏培養(yǎng)皿)上進(jìn)行，其中能夠分辨至多3000個菌落，而不需要主動將它們分離在不同的區(qū)室(如多孔板中所含的孔)中。例如，可能設(shè)計對臨床樣品的測試，其可用于從一系列細(xì)菌株系(bacterial line)中識別出關(guān)注的致病株系。

根據(jù)本發(fā)明的探針還可用于宏觀熒光成像，即以整個微生物級別。在這種情況下，探針滲入到細(xì)胞壁中，以到達(dá)所關(guān)注的活性(刺激，如酶、化學(xué)化合物或探針?biāo)诮橘|(zhì)中的物理化學(xué)特性)。

以下實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明，但在本質(zhì)上不以任何方式限制。

使用的縮寫

DCM：二氯甲烷 TFA：三氟乙酸

Boc：叔丁氧羰基 Me：甲基

Ac：乙?；? HOBt：1-羥基苯并三唑

sBu：仲丁基 HATU：1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽

Et：乙基 AT：環(huán)境溫度

DIAD：偶氮二甲酸二異丙酯 AMC：7-氨基-4-甲基香豆素

THF：四氫呋喃 DCC：二環(huán)己基碳二亞胺

DMF：N,N-二甲基甲酰胺 iPr：異丙基

δ：化學(xué)位移(ppm) RFU：任意熒光單位

UA：任意吸光度單位 λ_ex：激發(fā)波長(nm)

λ_em：發(fā)射波長(nm) NMR：核磁共振

LC：液相色譜 MS：質(zhì)譜

ESI：電噴霧電離 R_f：保留因子

J：H-H偶合常數(shù)(Hz) s：單峰

d：雙峰 t：三重峰

dd：雙二重峰 td：三二重峰

m：多重峰 br：寬信號

v：體積

用于表征的設(shè)備

使用Bruker AVANCE 300譜儀(¹H和¹³C分別為300MHz&75MHz)或Bruker AVANCE 500譜儀(¹H和¹³C分別為500MHz&125MHz)在297K下獲得NMR譜。

使用與液相色譜偶聯(lián)的安捷倫1100SL質(zhì)譜儀獲得低分辨率質(zhì)量測量結(jié)果。

鋪置在鋁上的60埃硅膠板(Aldrich)上進(jìn)行薄層色譜分析(TLC)。

使用Bruker MicrOTOFQ II質(zhì)譜儀獲得高分辨率質(zhì)量測量結(jié)果。

使用來自Perkin-Elmer的EnSpire板熒光計獲得熒光或吸光度測量結(jié)果。

A–合成：

I-中間體8：三氟乙酸鹽形式的N-((4-芐基哌嗪-2-基)甲基)-2-苯基乙酰胺的制備

a)化合物2:N-Boc-哌嗪的制備

將Boc₂O(8.07克(g)，50毫摩爾(mmol)，1.0當(dāng)量(eq))的DCM(150毫升(mL))溶液在環(huán)境溫度(AT)下經(jīng)3小時(h)滴加到哌嗪1(10.0g，100mmol，2.0eq)的DCM(300mL)溶液中。添加結(jié)束后，反應(yīng)混合物在AT下攪拌18h。然后，混合物通過蒸發(fā)濃縮，以獲得約100mL的最終體積。然后，該溶液用NaHCO₃飽和水溶液(2×100mL)洗滌，并用鹽水(100mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，獲得緩慢結(jié)晶的無色油狀物形式的化合物2(7.57g，40mmol，收率：81％)。

¹H-NMR(300兆赫(MHz),CDCl₃):δ＝百萬分之3.33(t,J＝5Hz,4H),2.75(t,J＝5Hz,4H),1.67(s,1H),1.41(s,9H)(ppm)。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃):δ＝154.9,79.5,56.3,46.0,44.8,30.4,28.5ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值187.3，計算值187.3

b)化合物3：N-Boc-N'-芐基-哌嗪的制備

將NaBH(OAc)₃(17.6g，80.6mmol，1.5eq)分幾份加入到冷卻到0℃的化合物2(10.0g，5.7mmol，1.0eq)、苯甲醛(5.5mL，53.7mmol，1.0eq)和分子篩的DCM(200mL)溶液中。反應(yīng)介質(zhì)在0℃下攪拌1h，然后在AT下攪拌2h。在反應(yīng)結(jié)束時，將混合物過濾，并且濾液用NaHCO₃飽和水溶液(3×150mL)洗滌三次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(洗脫液：最初為純DCM，然后DCM:MeOH/95:5/v:v)純化，獲得緩慢結(jié)晶的無色油狀物形式的化合物3(12.8g，46mmol，收率：86％)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ＝7.29(m,5H),3.52(s,2H),3.45(t,J＝5Hz,4H),2.40(t,J＝5Hz),1.48(s,9H)ppm。

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝154.90,137.98,129.25,128.38,127.26,79.63,63.18,52.98,43.61,28.54ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值277.3，計算值277.3

R_f＝0.32(石油醚:乙酸乙酯/8:2/v:v)

c)化合物4：4-芐基-2-(羥基甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

在預(yù)干燥滾筒(pre-dried drum)中，將化合物3(1.0g，3.6mmol，1.0eq)溶解在無水THF(20mL)中，并放置在氬氣惰性氣氛下。將這一溶液冷卻到-30℃，并滴加sBuLi(1.3摩爾(M)于環(huán)己烷中，4.2mL，1.5eq)。將反應(yīng)混合物在-30℃下攪拌6分鐘(min)，然后一次性迅速加入多聚甲醛(350毫克(mg)，11.6mmol，3.2eq)。該懸浮液在-30℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌1h30，然后在NH₄Cl飽和水溶液(20mL)的幫助下猝滅。分離出有機(jī)相，并將水相用Et₂O(2×20mL)洗滌兩次。將有機(jī)相合并，用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(洗脫液：石油醚:乙酸乙酯/7:3/v:v)純化，獲得黃色油狀物形式的化合物4(625mg，2.0mmol，收率：57％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.32(m,5H),4.12(br s,1H),3.92(m,3H),3.54(s,2H),3.40(br s,1H),3.04(d,J＝11.6Hz,1H),2.86(d,J＝8.7Hz,1H),2.33(dd,J＝11.6Hz,3.9Hz,1H),2.13(td,J＝11.6Hz,3.9Hz,1H),1.49(s,9H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):δ＝155.3,137.3,129.0,128.6,127.5,80.0,66.5,63.1,55.1,52.6,51.4,41.7,28.5ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值307.2，計算值307.2

R_f＝0.28(石油醚:乙酸乙酯/7:3/v:v)

d)化合物5：4-芐基-2-((1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

將DIAD(845μL，4.03mmol，1,2eq)滴加到冷卻到0℃的化合物4(1.03g，3.36mmol，1.0eq)、三苯基膦(1.07g，4.03mmol，1.2eq)和苯鄰二甲酰亞胺(600mg，4.03mmol，1.2eq)的無水THF(20mL)溶液中。反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌18h。蒸發(fā)掉揮發(fā)性化合物，并且所得油狀物使用硅膠柱色譜(洗脫液：石油醚:乙酸乙酯/8:2/v:v)純化，獲得白色固體形式的化合物5(1.20g，2.76mmol，收率：82％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.79(m,4H),7.30(m,5H),4.55(m,1.5H),4.45(m,0.5H),3.98(d,J＝13Hz,0.6H),3.75(d,J＝12Hz,0.4H),3.48(m,4H),2.28(m,2H),2.18(m,1H),2.05(m,1H),1.08+1.03(2xs,9H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):δ＝168.5,168.2,167.9,155.1,154.4,138.2,134.5,134.1,133.7,132.8,132.4,129.0,128.7,128.5,127.4,123.7,123.4,123.3,79.7,62.9,54.5,53.3,50.3,48.8,40.1,38.6,37.8,28.4,27.9ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值436.3，計算值436.2

R_f＝0.32(石油醚:乙酸乙酯/8:2/v:v)

e)化合物6：2-(氨基甲基)-4-芐基哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

將一水合肼(620mg，12mmol，4.0eq)加入到化合物5(1.20g，2.76mmol，1.0eq)的EtOH(30mL)溶液中，并將反應(yīng)混合物加熱回流18h。在反應(yīng)結(jié)束時，將懸浮液冷卻到AT，并過濾。在減壓下蒸發(fā)掉濾液，提供固體，將其再懸浮于DCM(50mL)中，再次過濾，并將濾液用NaHCO₃飽和水溶液(2×50mL)洗滌兩次，并用鹽水(50mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，獲得油狀物形式的化合物6(610mg)。該產(chǎn)物不經(jīng)任何進(jìn)一步純化而在下一步中使用。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.35(m,5H),3.97(br s,2H),3.57(d,J＝13.2Hz,1H),3.43(d,J＝13.2Hz,1H),3.07(dd,J＝13.1,7.0Hz,1H),2.94(dd,J＝13.1,7.0Hz,1H),2.81(m,2H),2.10(m,2H),1.50(s,9H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):δ＝155.33,138.36,128.76,128.49,128.35,128.13,127.19,79.74,62.82,53.55,53.30,53.13,48.55,41.64,28.48,21.99ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值306.3，計算值306.2

f)化合物7：4-芐基-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

將苯乙酰氯(318μL，2.35mmol，1.2eq)的無水DCM(5mL)溶液滴加到冷卻到0℃的化合物6(600mg，1.96mmol，1.0eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)(530μL，3.0mmol，1.5eq)的無水DCM(15mL)溶液。反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌1h30。在反應(yīng)結(jié)束時，混合物用NaHCO₃飽和水溶液(3×20mL)洗滌三次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(洗脫液：石油醚:乙酸乙酯/55:45/v:v)純化，獲得粘稠固體形式的化合物7(500mg，1.16mmol，兩階段收率：46％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.27-7.06(m,10H),6.12(s,1H),4.08(s,1H),3.43-3.36(m,3H),3.21(d,J＝13.0Hz,1H),2.61(d,J＝11.6Hz,1H),2.57(d,J＝11.6Hz,1H),1.99(dd,J＝11.6,3.8Hz,1H),1.92(td,J＝11.6,3.8Hz,1H),1.36(s,9H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):δ＝171.0,137.8,135.1,129.4,128.9,128.9,128.8,128.4,127.3,127.2,80.1,62.8,54.2,53.0,49.7,43.9,41.0,40.1,28.5ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值424.3，計算值424.3

R_f＝0.23(石油醚:乙酸乙酯/6:4/v:v)

g)化合物8：三氟乙酸鹽形式的N-((4-芐基哌嗪-2-基)甲基)-2-苯基乙酰胺的制備

將三氟乙酸(TFA)(4mL)加入到化合物7(500mg，1.18mmol，1.0eq)的DCM(4mL)溶液中，并將反應(yīng)混合物在AT下攪拌3h。在反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物在減壓下蒸發(fā)，再溶解在DCM中，并再次蒸發(fā)。將該操作再重復(fù)兩次。將所得油狀物溶解在MeOH中，并從Et₂O中沉淀出產(chǎn)物。將懸浮液過濾，并在空氣中干燥，獲得白色粉末形式的化合物8(401mg，0.92mmol，收率：78％)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.42-7.22(m,9H),3.70-3.59(m,2H),3.57(s,2H),3.53-3.46(m,1H),3.41-3.36(m,3H),3.15(td,J＝11.3,3.5Hz,1H),2.98(d,J＝11.3Hz,2H),2.44(t,J＝11.3Hz,1H),2.24(t,J＝11.3Hz,1H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ＝175.40,136.40,130.39,130.26,129.70,129.62,128.85,128.13,63.15,56.87,53.89,50.29,49.54,44.80,43.69,40.74ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值324.3，計算值324.3

II-中間體10：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基氯甲酸酯的制備

將4-乙基傘形酮9(360mg，2.0mmol)一次性加入到冷卻到0℃的三光氣(420mg，1.4mmol，0.7eq)的DCM(10mL)溶液中。將NaOH水溶液(2M，1.1mL，2.2mmol，1.1eq)滴加到該懸浮液中，并且反應(yīng)混合物在0℃下攪拌1h，然后在AT下攪拌18h。然后，將懸浮液過濾，所得固體用DCM洗滌兩次，并在空氣中干燥，以提供約預(yù)期質(zhì)量一半的化合物10(202mg，0.85mmol)。然后，濾液用水洗滌兩次，并且有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，提供另一部分的白色粉末形式的化合物10(240mg，1.0mmol)。該反應(yīng)的總收率為93％。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ＝7.69-7.62(m,1H),7.33-7.19(m,2H),6.31(s,1H),2.46(s,3H,)ppm。

R_f＝0.47(環(huán)己烷:乙酸乙酯/6:4/v:v)

III-化合物12：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯鹽酸鹽的制備

(實(shí)施例1)

a)化合物11：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基-4-芐基-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

在氬氣惰性氣氛下，將化合物8(400mg，0.91mmol，1.0eq)和DIPEA(480μL，2.73mmol，3.0eq)的無水DCM(5mL)溶液滴加到冷卻到0℃的化合物10(230mg，0.96mmol，1.05eq)的無水DCM(10mL)溶液。然后，將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌4h。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用NaHCO₃飽和水溶液(3×20mL)洗滌三次，并且有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(洗脫液：DCM:MeOH的梯度/99:1，98:2，97:3/v:v)純化，獲得無色油狀物形式的化合物11(160mg，0.31mmol，收率：33％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.46(2xd,J＝8.5Hz,1H),7.26-7.06(m,10H),7.02(d,J＝9.7Hz,1H),6.97(t,J＝7.4Hz,1H),6.25(s,0.5H),6.13(br s,1H),6.04(s,0.5H),4.33(s,0.5H),4.16(s,0.5H),4.06-3.99(m,0.5H),3.91(t,J＝13.2Hz,1H),3.70-3.61(m,0.5H),3.50-3.34(m,4H),3.28(t,J＝12.6Hz,1H),3.20-3.05(m,1H),2.72(d,J＝11.9Hz,1H),2.65(d,J＝11.8Hz,1H),2.31(d,J＝7.7Hz,3H),2.13(dd,J＝11.9,4.0Hz,1H),2.06(t,J＝11.8Hz,1H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):δ＝171.23,160.68,154.08,153.82,153.40,152.76,152.12,137.53,134.76,129.38,129.31,128.90,128.88,128.44,127.40,127.24,125.22,118.11,117.96,117.37,117.24,114.20,114.12,110.29,110.07,62.63,54.00,53.85,53.51,52.74,51.14,43.79,40.97,40.46,40.37,18.72ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值526.3，計算值526.3

R_f＝0.38(DCM:MeOH/97:3/v:v)

b)化合物12：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯鹽酸鹽的制備

含有化合物11(120mg，0.23mmol，1.0eq)和1,1,2-三氯乙烷(25μL，0.25mmol，1.1eq)的MeOH(5mL)溶液的燒瓶用H₂吹掃5min。加入Pd/C(10％，24mg)，并將燒瓶再次用H₂吹掃5min。然后，反應(yīng)混合物在AT下在H₂氣氛下攪拌18h。在反應(yīng)結(jié)束時，混合物經(jīng)過濾，并且濾液在減壓下蒸發(fā)至約2mL的體積。然后，加入Et₂O以沉淀出產(chǎn)物。將所得懸浮液過濾，并在空氣中干燥，提供白色粉末形式的化合物12(85mg，0.18mmol，收率：78％)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.35-7.07(m,7H),6.33(s,1H),4.63(2xs,1H),4.33(2xs,1H),3.78-3.66(m,1H),3.53(s,3H),3.45-3.32(m,3H),3.21(s,1H),2.49(s,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ＝175.07,162.63,155.25,155.00,136.46,130.19,129.71,128.09,127.15,119.38,119.02,114.83,111.09,50.92,50.42,44.39,44.04,43.75,38.60,38.32,37.44,37.39,18.72ppm。

HRMS:C₂₄H₂₆N₃O₅[M+H]⁺m/z實(shí)測值436.1858，計算值436.1867。

IV-中間體14：2-苯基-N-(哌啶-2-基甲基)乙酰胺的制備

將二環(huán)己基碳二亞胺(2.56g，12.3mmol，1.1eq)的DCM(10mL)溶液加入到苯乙酸(1.54g，11.2mmol，1.0eq)和HOBt(1.66g，12.3mmol，1.1eq)在DCM(30mL)中的懸浮液。將所得混合物在AT下攪拌30min，然后加入2-(氨基甲基)哌啶13(1.4mL，11.2mmol，1.0eq)。將反應(yīng)混合物在AT下攪拌2h。將所得懸浮液過濾，并且濾液用NaHCO₃飽和水溶液(2×50mL)洗滌兩次。然后，有機(jī)相用10％KH₂PO₄水溶液萃取數(shù)次，直到水相的pH穩(wěn)定在約pH 3。然后，將DCM(150mL)加入到合并的水相，并加入NaOH水溶液(2M)，直到水相的pH達(dá)到pH 12。萃取有機(jī)相，并將堿性水相用DCM(2×100mL)萃取兩次。將有機(jī)相合并，用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，提供白色固體形式的化合物14(2.07g，8.9mmol，收率：80％)。

¹H-NMR(200MHz,CDCl₃):δ＝7.83(m,5H),5.80(s,1H),3.57(s,2H),3.25(m,1H),3.04(m,2H),2.59(m,2H),1.75(m,1H),1.56(m,2H),1.32(m,4H),1.03(m,1H)ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值233.3，計算值233.3

V-化合物15：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌啶-1-羧酸酯的制備(對比例1)

在氬氣惰性氣氛下，將化合物14(25mg，0.15mmol，1.0eq)加入到冷卻到0℃的化合物10(39mg，0.16mmol，1.05eq)在無水DCM(5mL)的懸浮液中，隨后加入DIPEA(55μL，0.30mmol，2.0eq)。反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，并在AT下攪拌4h。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用NaHCO₃飽和水溶液(3×20mL)洗滌三次，并且有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(洗脫液：DCM:MeOH的梯度/99:1，98:2，97:3/v:v)純化，獲得無色油狀物形式的化合物15(35mg，0.31mmol，收率：54％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.49(s,1H),7.30-7.04(m,5H),7.04-6.88(m,2H),6.16(s,1H),5.90(s,1H),4.48-4.23(m,1H),4.03(d,J＝13.5Hz,1H),3.82(s,1H),3.64-3.27(m,3H),3.12(s,1H),2.35(s,3H),1.77-1.36(m,6H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):δ＝171.42,160.73,154.14,153.99,153.83,152.12,134.62,129.75,129.36,129.00,128.38,127.35,126.76,125.19,118.10,117.32,114.20,110.34,53.51,51.09,50.93,46.72,43.69,41.28,40.83,40.64,39.53,38.94,31.69,26.53,25.28,24.39,23.04,19.09,18.76ppm。

HRMS:C₂₅H₂₆N₂NaO₅[M+Na]⁺m/z實(shí)測值457.1734，計算值457.1734

R_f＝0.27(DCM:MeOH/98:2/v:v)

VI-中間體19：三氟乙酸鹽形式的辛酸(4-芐基哌嗪-2-基)甲酯的制備

a)化合物17：辛酰氯的制備

將亞硫酰氯(30mL，410mmol，6.0eq)滴加到辛酸16(10.0g，69mmol，1.0eq)中。然后，將該反應(yīng)混合物加熱回流2h，然后冷卻到AT，并且在減壓下蒸發(fā)掉揮發(fā)性化合物。將所得油狀物溶解在DCM中，并將溶液再蒸發(fā)一次。將該程序再進(jìn)行兩次，獲得氣味濃烈的黃色液體形式的化合物17(11.0g，66.7mmol，收率：97％)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ＝2.87(t,J＝7.3Hz,2H),1.70(q,J＝7.3Hz,2H),1.42-1.22(m,8H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝173.89,47.23,31.64,28.85,28.51,25.20,22.65,14.11ppm。

b)化合物18：4-芐基-2-((辛酰氧基)甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

將化合物17(667mg；4.1mmol，1.1eq)的無水DCM(5mL)溶液滴加到冷卻到0℃的化合物4(800mg，3.72mmol，1.0eq)和三乙胺(780μL，5.6mmol，1.5eq)的無水DCM(10mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌2h30。然后，其用DCM(35mL)稀釋，并用NaHCO₃飽和水溶液(50mL)洗滌一次，用水(50mL)洗滌一次，用HCl水溶液(1M-50mL)洗滌一次，并用鹽水(50mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(純DCM，然后DCM:乙酸乙酯/90:10)純化，獲得黃色油狀物形式的18(710mg，1.64mmol，收率：44％)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.34-7.16(m,5H),4.39-4.18(m,3H),3.88(s,1H),3.53(d,J＝13.1Hz,1H),3.37(d,J＝13.1Hz,1H),3.09(t,J＝11.3Hz,1H),2.77(d,J＝11.5Hz,2H),2.20(t,J＝7.6Hz,2H),2.14-1.95(m,2H),1.60-1.49(m,2H),1.44(s,9H),1.25(s,8H),0.87(t,J＝6.4Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ＝173.72,154.91,138.16,128.93,128.42,127.29,79.97,62.83,61.56,53.10,52.82,34.36,31.80,29.25,29.04,28.52,24.95,22.73,14.20ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值433.3，計算值433.3

c)化合物19：三氟乙酸鹽形式的辛酸(4-芐基哌嗪-2-基)甲酯的制備

所使用的程序與描述的合成化合物8的程序相同，但是使用在DCM(5mL)和TFA(5mL)中的化合物18(700mg，1.62mmol，.0eq)，提供白色粉末形式的化合物19(775mg，收率：定量)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.41-7.27(m,5H),4.30(dd,J＝12.5,3.9Hz,1H),4.22(dd,J＝12.5,6.4Hz,1H),3.70-3.63(m,1H),3.46(d,J＝13.2Hz,1H),3.28-3.12(m,3H),2.71(td,J＝12.2,12.2,2.6Hz,1H),2.61(t,J＝11.8Hz,1H),2.38(t,J＝7.5Hz,2H),1.66-1.52(m,2H),1.30(s,8H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ＝174.57,162.06,161.77,135.40,130.95,129.86,129.62,118.70,116.40,62.75,62.55,54.98,52.20,49.86,43.97,34.47,32.84,30.13,30.07,25.72,23.65,14.38ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值333.3，計算值333.2

VII-化合物21：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((辛酰氧基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯鹽酸鹽的制備

(實(shí)施例2

a)化合物20:4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基4-芐基-2-((辛酰氧基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

所使用的程序與描述的合成化合物11的程序相同，使用在無水DCM(20mL)中的化合物10(400mg，1.67mmol，1.0eq)、化合物19(750mg，1.67mmol，1.0eq)和DIPEA(880μL，5.02mmol，3.0eq)。硅膠色譜(石油醚:乙酸乙酯/7:3/v:v)之后，獲得無色固體形式的化合物20(190mg，0.36mmol，收率：22％)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.52(d,J＝8.6Hz,1H),7.24-7.16(m,1H),7.11-7.00(m,2H),6.18(s,1H),4.57-4.38(m,2H),4.27(s,1H),4.09-3.95(m,1H),3.54(d,J＝13.1Hz,1H),3.39(d,J＝13.0Hz,1H),3.23(t,J＝11.9Hz,0.5H),2.82(d,J＝11.3Hz,2H),2.36(s,3H),2.21-2.10(m,3H),1.55-1.43(m,2H),1.26-1.12(m,8H),0.87-0.75(m,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ173.46,160.56,154.10,153.82,152.88,152.00,137.65,128.76,128.35,127.29,125.17,118.11,117.90,117.29,114.14,110.25,110.05,62.57,61.57,61.28,52.75,52.62,51.16,50.57,41.02,40.21,34.13,31.58,29.03,28.86,24.76,22.54,18.65,14.03ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值535.3，計算值535.3

R_f＝0.26(石油醚:乙酸乙酯/7:3/v:v)

b)化合物21：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((辛酰氧基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯鹽酸鹽的制備

所使用的程序與描述的合成化合物12的程序相同，其中使用在MeOH(5mL)中的化合物20(180mg，0.33mmol，1.0eq)、1,1,2-三氯乙烷(37μL，0.39mmol，1.1eq)、Pd/C(38mg，20％w)，獲得白色粉末形式的化合物21(95mg，0.20mmol，收率：61％)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.82(d,J＝8.6Hz,1H),7.32-7.13(m,2H),6.34(s,1H),4.67(s,1H),4.43-4.22(m,2H),3.53(d,J＝13.4Hz,2H),3.45(d,J＝11.7Hz,3H),3.26(s,1H),2.49(s,3H),2.35(t,J＝7.5Hz,2H),1.57(s,2H),1.26(dd,J＝28.7,21.9Hz,9H),0.84(t,J＝6.8Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ＝174.84,162.51,155.27,154.96,154.90,154.05,127.20,119.25,119.06,114.87,111.01,61.14,43.94,43.50,34.83,32.80,30.17,30.07,25.89,23.63,18.67,14.36ppm。

HRMS:C₂₄H₃₃N₂O₆[M+H]⁺m/z實(shí)測值445.2318，計算值445.2333

VIII-化合物22：4-(4-(((4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)羰基)-3-((辛酰氧基)甲基)哌嗪-1-基)丁烷-1-磺酸的制備

(實(shí)施例3)

將NaHCO水溶液(1M，10mL)加入到化合物21(25mg，0.052mmol，1.0eq)在乙酸乙酯(10mL)中的懸浮液。萃取有機(jī)相，并將水相用乙酸乙酯(3×10mL)洗滌三次。合并的有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，提供無色油狀物。將該油狀物溶解在無水THF(2.5mL)中，并且加入丁磺酸內(nèi)酯(2滴)，并將反應(yīng)混合物加熱回流48h。在反應(yīng)結(jié)束時，其用THF(2.5mL)和Et₂O(5mL)稀釋，并加入水(10mL)。將水相分離出來，并凍干，提供高度吸濕性白色固體形式的化合物22(13mg，0.022mmol，收率：43％)。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ＝7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.21-7.03(m,2H),6.23(d,J＝1.1Hz,1H),4.59(s,1H),4.38-4.12(m,2H),3.62-3.24(m,4H),3.12-2.83(m,3H),2.80(t,J＝6.9Hz,2H),2.42-2.35(m,3H),2.29-2.17(m,2H),1.91-1.73(m,4H),1.47(s,2H),1.25-0.98(m,10H),0.74(t,J＝6.9Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ＝162.54,155.30,155.02,154.93,127.23,119.30,118.88,114.88,34.89,32.83,30.21,30.10,25.92,23.67,23.24,18.71,14.40ppm。

HRMS:C₂₈H₄₀N₂NaO₉S[M+Na]⁺m/z實(shí)測值603.2339，計算值603.2347

IX-化合物27：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((辛酰氧基)甲基)哌啶-1-羧酸酯的制備(對比例2)

a)化合物24：N-Boc-2-(羥基甲基)哌啶的制備

將Boc₂O(6.6g，47mmol，1.1eq)的DCM(10mL)溶液滴加到冷卻到0℃的化合物23(5g，43mmol，1.0eq)的DCM(20mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌3h。然后，其用DCM(30mL)稀釋，并用NaHCO₃飽和水溶液(3×60mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，獲得黃色固體形式的化合物24(6.02g，28mmol，收率：65％)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ＝4.36-4.22(m,1H),3.94(d,J＝12.3Hz,1H),3.88-3.75(m,1H),3.67-3.53(m,1H),2.87(t,J＝12.3Hz,1H),2.01(br s,1H),1.73-1.52(m,4H),1.52-1.38(m,11H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝156.43,79.92,61.86,52.68,40.14,28.57,25.39,25.35,19.76ppm。

b)化合物25：N-Boc-2-((辛酰氧基)甲基)哌啶的制備

將化合物24(5.0g，30.6mmol，1.1eq)的干燥DCM(20mL)溶液滴加到冷卻到0℃的化合物17(6.0g，27.8mmol，1.0eq)和三乙胺(6mL，42mmol，1.5eq)的干燥DCM(40mL)溶液。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，并在AT下攪拌3h。然后，其用DCM(40mL)稀釋，并用1M HCl(100mL)洗滌一次，用水(50mL)洗滌一次，用NaOH 1M(100mL)洗滌一次，并用鹽水(100mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)至干，提供黃色液體形式的化合物25(9.82g，定量收率)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化而使用。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ＝4.40(s,0.6H),4.26-4.11(m,0.9H),4.10-3.99(m,1.3H),3.99-3.80(m,0.8H),3.76-3.64(m,0.2H),3.59-3.47(m,0.2H),2.86-2.65(m,0.8H),2.48(s,0.2H),2.37(t,J＝7.5Hz,0.2H),2.21(t,J＝7.5Hz,2H),1.68-1.43(m,6H),1.43-1.30(m,9H),1.30-1.08(m,10H),0.80(t,J＝5.9Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝173.77,155.15,79.54,61.71,34.38,31.75,29.21,28.99,28.52,25.50,25.35,24.98,22.67,19.42,14.13ppm。

c)化合物26：三氟乙酸鹽形式的辛酸哌啶-2-基甲酯的制備

所使用的程序與描述的合成化合物8的程序相同，但是使用在DCM(3mL)和TFA(3mL)中的化合物25(700mg，1.62mmol，1.0eq)，提供白色粉末形式的化合物26(910mg，2.56mmol，收率：88％)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ＝8.93(s,1H),8.25(s,1H),4.54(d,J＝5.4Hz,0.1H),4.32(d,J＝3.4Hz,0.3H),4.28(d,J＝3.4Hz,0.6H),4.23-4.07(m,1H),3.50(d,J＝12.7Hz,1H),3.43-3.26(m,1H),3.03-2.83(m,1H),2.30(t,J＝7.6Hz,1H),2.06-1.46(m,8H),1.39-1.17(m,9H),0.87(t,J＝5.7Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝173.81,161.67,117.60,63.67,56.40,45.11,33.69,31.71,29.06,28.95,25.16,24.67,22.66,22.06,21.97,14.10ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值241.2，計算值241.2

d)化合物27:4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基2-((辛酰氧基)甲基)哌啶-1-羧酸酯的制備

所使用的程序與描述的合成化合物11的程序相同，其中使用在無水DCM(10mL)中的化合物10(190mg，0.79mmol，1.0eq)、化合物26(285mg，0.79mmol，1.0eq)和DIPEA(700μL，3.95mmol，4.0eq)。硅膠色譜(石油醚:乙酸乙酯/75:25/v:v)之后，獲得無色油狀物形式的化合物27(150mg，0.34mol，收率43％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝7.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.16-7.05(m,2H),6.24(s,1H),4.68(s,1H),4.41(t,J＝9.9Hz,1H),4.22-4.10(m,2H),3.13(br s,0.5H),2.98(br s,0.5H),2.42(s,3H),2.28(t,J＝6.8Hz,2H),1.85-1.66(m,4H),1.65-1.50(m,4H),1.24(br s,8H),0.84(t,J＝6.6Hz,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝173.77,160.82,154.33,154.20,153.29,152.12,125.22,118.25,117.39,114.31,110.39,61.67,50.35,50.00,40.89,40.09,34.37,31.75,29.22,29.03,25.81,25.12,24.99,22.70,19.32,18.85,14.17ppm。

HRMS:C₂₅H₃₃NNaO₆[M+Na]⁺m/z實(shí)測值：466.2179，計算值466.200

R_f＝0.34(石油醚:乙酸乙酯/75:25/v:v)

X-化合物31：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基4-(3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酰基)-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

(實(shí)施例4)

a)化合物29：1-疊氮基-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷的制備

將NaN₃(2.04g，31.40mmol，5.0eq)一次性加入到化合物28(2.0g，6.28mmol，1.0eq)在DMF(15mL)和水(8mL)的混合物中的溶液中。然后，將該反應(yīng)混合物加熱到70℃，持續(xù)18h。然后，蒸發(fā)掉揮發(fā)性化合物，并且將所得固體溶解在乙酸乙酯(50mL)中。將懸浮液過濾，并將濾液用NaHCO₃飽和水溶液(2×50mL)洗滌兩次，然后用鹽水(50mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)，提供無色油狀物形式的化合物29(820mg，4.33mmol，收率：69％)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ＝3.68-3.57(m,8H),3.55-3.48(m,2H),3.38-3.32(m,5H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝71.94,70.71,70.68,70.63,70.05,59.04,50.69ppm。

R_f＝0.56(石油醚:乙酸乙酯/1:1/v:v)

b)化合物30：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基4-(戊-4-炔酰基)-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

在氬氣惰性氣氛下，將DIPEA(42μL，0.240mmol，2.2eq)加入到化合物12(50mg，0.106mmol，1.0eq)、戊炔酸(12mg，0.117mmol，1.1eq)和HATU(46mg，0.117mmol，1.1eq)在無水DCM(5mL)中的懸浮液，并將反應(yīng)混合物在AT下攪拌2h30。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用DCM(20mL)稀釋，并用NaHCO₃飽和水溶液(2x20mL)洗滌兩次，并用鹽水(20mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)通過柱色譜在中性氧化鋁上(石油醚:乙酸乙酯/1:9/v:v)純化，獲得無色油狀物形式的化合物30(60mg，收率：定量)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝7.59(dd,J＝14.8,8.6Hz,1H),7.36-7.27(m,2H),7.27-7.21(m,2H),7.21-7.02(m,2H),6.73-6.45(m,1H),6.32-6.04(m,1H),4.67-4.25(m,2H),4.17-3.69(m,3H),3.66-3.47(m,3H),3.45-3.18(m,2H),3.18-2.89(m,2H),2.81(s,3H),2.74-2.63(m,1H),2.60-2.47(m,3H),2.44(s,3H),2.20(s,1H),2.13-1.96(m,1H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝171.52,171.36,170.69,170.37,170.27,165.73,160.62,154.03,153.52,153.23,152.78,152.16,134.78,134.65,129.23,128.97,128.88,127.33,127.21,125.35,117.97,117.58,117.45,114.33,114.22,110.28,110.16,83.32,83.05,69.34,69.03,53.52,51.33,45.59,45.20,45.03,43.62,42.37,42.19,41.21,40.48,40.19,39.98,38.62,38.05,37.50,31.77,18.74,14.66,14.36ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值515.3，計算值515.2

R_f＝0.20(石油醚:乙酸乙酯/1:9/v:v)

c)化合物31：4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基4-(3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙?；?-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

將CuSO₄.5H₂O(9mg，0.04mmol，0.6eq)和抗壞血酸鈉(16mg，0.08mmol，1.2eq)一次性加入到化合物30(30mg，0.058mmol，1.0eq)和化合物28(24mg，0.128mmol，2.2eq)在DCM(1mL)和水(1mL)的混合物中的溶液。然后，該反應(yīng)混合物在AT下攪拌2h。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用DCM(10mL)和水(10mL)稀釋。萃取有機(jī)相，并將水相用DCM(3x10mL)洗滌三次。合并的有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(洗脫液：DCM:MeOH的梯度/100:0，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5/v:v)純化，提供白色粉末形式的化合物31(19mg，0.027mmol，收率：46％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝7.96(s,0.25H),7.47(m 1.5H),7.32-6.94(m,7H),6.61(s,0.2H),6.21(m,1H),5.86(s,0.2H),4.73(s,0.25H),4.55-4.17(m,3H),4.01-3.69(m,4.5H),3.65-3.61(m,1.5H),3.59-3.50(m,6.5H),3.50-3.38(m,3H),3.31(d,J＝5.4Hz,2.5H),3.26-2.55(m,6.5H),2.36(s,3H),1.74(s,1H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝172.66,171.54,170.71,160.77,154.23,153.64,152.93,152.10,135.49,134.96,134.70,129.42,129.03,128.85,127.35,127.14,125.36,122.96,118.17,117.60,114.42,110.45,72.04,70.64,69.56,67.21,59.18,51.27,50.71,50.21,45.48,45.21,44.77,44.02,43.86,42.43,42.22,41.15,40.55,40.24,40.00,39.36,38.12,37.72,37.42,32.04,31.66,29.81,28.81,21.34,20.57,18.86ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值704.5，計算值704.3

R_f＝0.30(DCM:MeOH/95:5/v:v)

XI-中間體34：三氟乙酸鹽形式的N-((4-(戊-4-炔?；?哌嗪-2-基)甲基)-2-苯基乙酰胺的制備

a)化合物32：2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯鹽酸鹽的制備

所使用的程序與描述的合成化合物12的程序相同，其中使用在MeOH(30mL)中的化合物7(605mg，1.53mmol，1.0eq)、1,1,2-三氯乙烷(161μL，1.70mmol，1.1eq)、Pd/C(121mg，20重量％)，獲得白色粉末形式的化合物32(430mg，1.16mmol，收率：76％)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ＝7.43-7.15(m,5H),6.25(s,1H),4.47-4.15(m,2H),4.00-3.57(m,2.7H),3.52(d,J＝2.9Hz,2H),3.33(m,0.7H),3.28-2.85(m,2.8H),2.68-2.29(m,4.5H),2.00(d,J＝8.4Hz,1H),1.47(s,9H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝171.53,171.33,170.51,170.26,165.70,154.91,134.84,129.22,128.92,128.78,127.26,127.09,83.36,83.06,80.81,69.19,68.90,53.49,49.97,45.37,43.60,42.10,41.32,31.77,31.69,28.29,14.55,14.29ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值333.2，計算值333.2

b)化合物33：4-(戊-4-炔?；?-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

在氬氣惰性氣氛下，將DIPEA(395μL，2.25mmol，2.2eq)加入到冷卻到0℃的化合物32(410mg，1.11mmol，1.0eq)、戊炔酸(122mg，1.22mmol，1.1eq)和HATU(473mg，1.22mmol，1.1eq)的無水DCM(30mL)懸浮液中，并且將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌15min，然后在AT下攪拌2h15。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用DCM(20mL)稀釋，并且用NaHCO₃飽和水溶液(2×50mL)洗滌兩次，并用鹽水(50mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)通過柱色譜在中性氧化鋁上(石油醚:乙酸乙酯/15:85/v:v)純化，獲得淡黃色固體形式的化合物33(552mg，收率：定量)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ＝7.43-7.15(m,5H),6.25(s,1H),4.47-4.15(m,2H),4.00-3.57(m,2.7H),3.52(d,J＝2.9Hz,2H),3.33(m,0.7H),3.28-2.85(m,2.8H),2.68-2.29(m,4.5H),2.00(d,J＝8.4Hz,1H),1.47(s,9H)ppm。

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃)δ＝171.53,171.33,170.51,170.26,165.70,154.91,134.84,129.22,128.92,128.78,127.26,127.09,83.36,83.06,80.81,69.19,68.90,53.49,49.97,45.37,43.60,42.10,41.32,31.77,31.69,28.29,14.55,14.29ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值413.3，計算值413.2

R_f＝0.29(石油醚:乙酸乙酯/2:8/v:v)

c)化合物34：三氟乙酸鹽形式的N-((4-(戊-4-炔?；?哌嗪-2-基)甲基)-2-苯基乙酰胺的制備

所使用的程序與描述的合成化合物8的程序相同，但是使用在DCM(5mL)和TFA(5mL)中的化合物33(550mg，1.33mmol，1.0eq)，提供白色粉末形式的化合物34(500mg，1.17mmol收率：88％)。

¹H-NMR(500MHz,MeOD)δ＝7.33-7.22(m,4H),7.22-7.15(m,1H),4.45(t,J＝13.4Hz,1H),3.97(t,J＝13.4Hz,1H),3.45-3.11(m,6.5H),3.06(t,J＝10.6Hz,0.5H),3.01-2.81(m,2H),2.67-2.46(m,2H),2.42(m,2H),2.24(d,J＝1.6Hz,1H),1.34-1.26(m,1H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,MeOD)δ＝175.33,172.22,172.09,163.50,163.23,162.96,162.68,136.48,136.39,130.30,130.27,130.17,129.70,129.65,128.09,128.03,83.85,70.32,70.26,56.37,56.22,55.75,54.81,46.53,44.58,44.48,43.72,43.66,43.55,43.26,42.64,40.34,40.19,40.08,39.63,39.42,32.73,32.59,18.65,15.11,13.09ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值313.2，計算值313.2

XII-化合物36：4-(3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙?；?-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸4-硝基苯酯的制備

(實(shí)施例5)

a)化合物35：4-(戊-4-炔酰基)-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸4-硝基苯酯的制備

將對硝基苯酚氯甲酸酯(28mg，0.130mmol，1.1eq)一次性全部加入到冷卻到0℃并且在氬氣惰性氣氛下的化合物34(50mg，0.117mmol，1.0eq)和DIPEA(55μL，0.30mmol，2.5eq)的無水DCM(2mL)溶液中。反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌2h。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用DCM(20mL)稀釋，用NaHCO₃飽和水溶液(2x 25mL)洗滌兩次，并用鹽水(25mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用硅膠柱色譜(石油醚:乙酸乙酯/2:8/v:v)純化，獲得無色固體形式的化合物35(60mg，收率：定量)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝8.15(t,J＝9.8Hz,2H),7.33-7.01(m,7H),6.23(s,0.4H),6.08-5.82(m,0.6H),4.60-4.36(m,1.5H),4.32-4.17(m,0.5H),4.05-3.88(m,1.4H),3.84(m,0.8H),3.77-3.62(m,0.8H),3.62-3.16(m,4.5H),3.12(t,J＝12.0Hz,0.5H),2.96-2.65(m,1.8H),2.65-2.26(m,4.2H),2.08-1.86(m,1.5H),1.29-1.13(m,0.5H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝171.59,171.35,170.80,170.40,170.28,155.85,152.84,152.40,145.05,144.94,134.69,134.48,129.35,129.25,129.08,128.96,127.50,127.33,125.17,122.27,122.13,121.85,83.28,83.03,69.37,69.10,53.54,51.50,51.25,45.58,45.23,45.03,43.68,42.43,42.09,41.20,40.59,40.18,38.70,38.10,37.48,31.86,31.75,14.71,14.40ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值478.3，計算值478.3

R_f＝0.32(石油醚:乙酸乙酯/2:8/v:v)

b)化合物36：4-(3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙?；?-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸4-硝基苯酯的制備

所使用的程序與描述的合成化合物31的程序相同，其中使用在DCM(1mL)和水(1mL)的混合物中的化合物35(30mg，0.063mmol，1.0eq)、化合物28(26mg，0.138mmol，2.2eq)、CuSO₄.5H₂O(9mg，0.04mmol，0.6eq)和抗壞血酸鈉(16mg，0.08mmol，1.2eq)。純化之后，獲得淡黃色油狀物形式的化合物36(39mg，0.058mmol，收率：93％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝8.29-8.01(m,2H),7.54-7.01(m,7H),4.56-4.24(m,5H),4.05-3.66(m,5H),3.66-3.37(m,12H),3.31(d,J＝4.7Hz,3H),3.25-2.55(m,7H),2.18-1.84(m,1H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝172.78,171.62,156.11,155.95,152.46,145.10,144.97,135.45,134.92,129.38,128.97,128.80,127.31,127.10,125.18,122.21,72.00,70.64,70.60,69.43,59.14,51.47,51.26,50.69,50.44,50.18,45.45,45.20,44.63,44.03,43.80,42.40,42.09,41.06,40.63,40.25,40.10,39.39,38.05,37.72,37.48,31.85,31.39,30.40,29.77,29.51,28.59,26.99,21.36,20.53ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值667.3，計算值667.3

R_f＝0.31(DCM:MeOH/95:5/v:v)

XIII-化合物39：4-氯-2-(6-氯-4-氧代-3,4-二氫喹唑啉-2-基)苯基4-(3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酰基)-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

(實(shí)施例6)

a)化合物38：4-氯-2-(6-氯-4-氧代-3,4-二氫喹唑啉-2-基)苯基4-(戊-4-炔?；?-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

將三光氣(130mg，0.43mmol，3.3eq)的無水DCM(2mL)溶液加入到冷卻到0℃并且在氬氣惰性氣氛下的化合物37(40mg，0.13mmol，1.1eq)的無水DCM(5mL)懸浮液，隨后加入DIPEA(80μL，0.43mmol，3.3eq)。該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，然后在AT下攪拌18h。然后，在減壓下通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性化合物，并且將所得固體溶解在無水DCM(5mL)中。將化合物34(50mg，0.117mmol，1.0eq)的無水DCM(2mL)溶液加入到這一新的懸浮液中，然后加入DIPEA(85μL，0.47mmol，4.0eq)，并將該反應(yīng)混合物在AT下攪拌18h。在反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)混合物用DCM(20mL)稀釋，用NaHCO₃飽和水溶液(2×25mL)洗滌兩次，并用鹽水(25mL)洗滌一次。有機(jī)相用Na₂SO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。未精制的反應(yīng)介質(zhì)使用兩個連續(xù)的硅膠色譜柱(石油醚:乙酸乙酯/2:8/v:v；和DCM:MeOH梯度/99:1，98:2，97:3/v:v)純化，獲得白色固體形式的化合物38(52mg，0.080mmol，收率：69％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝11.12-10.16(m,0.8H),8.14(s,0.7H),8.01-7.70(m,0.9H),7.64(s,1.5H),7.41(s,0.9H),7.30-6.88(m,5.3H),6.82-6.46(m,0.9H),6.10(s,0.3H),4.56-4.01(m,2H),4.05-2.99(m,7.1H),2.99-2.60(m,1.8H),2.60-2.15(m,3.6H),2.10-1.59(m,1.6H),1.23(m,1.3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝173.05,171.80,170.88,170.50,170.31,161.41,153.40,153.05,152.46,149.57,149.45,147.43,147.20,147.09,135.64,135.41,135.19,134.83,134.72,134.55,133.55,133.39,133.14,132.11,131.72,130.88,130.52,130.29,129.61,129.43,129.27,129.20,129.05,128.85,127.99,127.66,127.45,127.20,127.16,125.96,125.80,124.81,124.35,124.16,122.27,122.06,121.85,83.37,83.08,82.95,69.53,69.39,69.06,68.97,51.86,51.67,45.26,45.09,44.96,43.58,43.38,42.44,41.78,41.11,40.58,40.37,39.74,39.33,38.86,38.41,38.02,31.76,29.72,14.68,14.33ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值645.3，計算值645.2

R_f＝0.19(DCM:MeOH/97:3/v:v)

b)化合物39：4-氯-2-(6-氯-4-氧代-3,4-二氫喹唑啉-2-基)苯基4-(3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酰基)-2-((2-苯基乙酰氨基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制備

所使用的程序與描述的合成化合物31的程序相同，其中使用在DCM(2mL)和水(2mL)的混合物中的化合物38(50mg，0.077mmol，1.0eq)、化合物28(31mg，0.170mmol，2.2eq)、CuSO₄.5H₂O(12mg，0.05mmol，0.6eq)和抗壞血酸鈉(20mg，0.10mmol，1.2eq)。純化之后，獲得淡黃色油狀物形式的化合物39(50mg，0.060mmol，收率：78％)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝11.12(s,0.4H),10.89(s,0.2H),10.14-9.90(m,0.2H),8.33-7.94(m,2H),7.91-7.71(m,2H),7.70-7.48(m,1.5H),7.43-7.32(m,2H),7.30-7.12(m,3.5H),4.54(m,4H),3.93(m,4H),3.77-3.50(m,10H),3.45-2.72(m,10H),2.39(s,0.5H),1.66(s,3H)ppm。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ＝174.00,173.14,172.10,171.24,161.27,152.45,152.24,149.84,149.71,147.59,147.54,147.30,147.19,135.53,135.30,135.16,135.11,134.89,133.08,133.02,132.14,132.09,131.98,131.67,131.54,131.04,129.79,129.44,129.35,128.84,128.78,128.68,127.64,127.19,126.97,126.04,125.83,125.11,124.32,124.22,122.54,72.01,70.64,70.59,70.43,69.27,59.15,52.06,51.86,51.50,50.90,50.58,45.62,45.47,45.38,45.17,44.54,44.01,43.88,43.72,43.53,41.87,41.17,40.84,40.42,40.00,39.20,39.11,38.30,38.28,30.34,29.70,29.43,21.39,20.64ppm。

MS:ESI:[M+H]⁺m/z實(shí)測值834.5，計算值834.3

R_f＝0.13(DCM:MeOH/96:4/v:v)

B-化合物的水溶性的評價

作為在不同濃度下所關(guān)注的化合物的緩沖溶液中是否存在沉淀的函數(shù)來評價化合物的水溶性。這些溶液按照以下制備：

將已知量的物質(zhì)溶解在適量的DMSO中，以獲得濃度為100mM的澄清DMSO儲備溶液(除了市售AMC-亮氨酸(稱為AMC-Leu)，其在這些條件下產(chǎn)生渾濁溶液，并且DMSO儲備溶液的濃度必須降低至50mM)。然后，將這些儲備溶液在市售PBS緩沖液中稀釋，以獲得范圍為1mM至50μM的最終濃度。如果在稀釋后沉淀出現(xiàn)并保持，則化合物被宣布為不溶的。

下表2示出了這些溶解度測試的結(jié)果

表2

結(jié)論：在所有示出實(shí)例中，與沒有連接臂的市售底物相比，或與申請WO 2013/045854和WO 2014/020285中描述的并入連接臂的底物相比，根據(jù)本發(fā)明的化合物在水溶液中具有更好的溶解度。

酶活性：

測試了某些化合物，以評價根據(jù)酶活性檢測的熒光。

將PGA(來自大腸桿菌(Escherichia Coli)的青霉素G酰胺酶，Waterstone Tech.)在PBS緩沖液中的溶液或脂酶(來自皺褶假絲酵母(Candida Rugosa)的脂酶，Sigma-Aldrich)在PBS緩沖液中的溶液加入到在96孔板中的根據(jù)本發(fā)明的探針在PBS中的溶液(熒光為黑色的，或吸光度為透明的)。

探針的最終濃度：10μM至50μM

PGA的最終濃度：5U

或脂酶的最終濃度：4U

然后，在37℃下孵育板，并用酶標(biāo)儀(multi-plate reader，EnSpire，Perkin Elmer)記錄隨時間的熒光或吸光度。所得的圖來自三重復(fù)制的結(jié)果。

對于4-甲基傘形酮(化合物12、15、31、21和27)：熒光：λ_ex＝370nm，λ_em＝445nm。

對于6-氯-2-(5-氯-2-羥基苯基)喹唑啉-4(3H)-酮(化合物39)：熒光：λ_ex＝365nm，λ_em＝530nm。

對于對硝基苯酚酯(化合物36)：吸光度：λ_abs＝405nm。

結(jié)果顯示在附圖1至8中。

圖1示出了化合物12被PGA活化后熒光的變化。

圖2示出了化合物15被PGA活化后熒光的變化。

圖3示出了化合物31被PGA活化后熒光的變化。

圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的化合物12和31與作為對比使用的化合物15在它們被PGA活化后響應(yīng)速率的對比。

圖5示出了化合物36被PGA活化后吸光度的變化。

圖6示出了化合物39被PGA活化后熒光的變化。

圖7示出了化合物21被脂酶活化后熒光的變化。

圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的化合物21與作為對比使用的化合物27在它們被脂酶活化后響應(yīng)速率的對比。

結(jié)論：根據(jù)本發(fā)明的化合物通過熒光或吸光度測量的方式能夠有效用于檢測酶活性的存在。雖然并入了電荷或?qū)B接臂具有相對空間位阻的基團(tuán)，酶識別仍然是良好的。