本發(fā)明涉及防止抗生素繼發(fā)于其對(duì)胃腸菌群的作用和抗性細(xì)菌菌株的選擇的不良效應(yīng)。
背景技術(shù)：
：：肝可將很多腸胃外施用的抗生素以活性的、未經(jīng)修飾的活性形式或作為活性代謝物排泄到膽汁中。這些抗生素可在回腸內(nèi)被重吸收，并且由此通過門靜脈返回到肝以最終被排出。該循環(huán)被稱為腸肝循環(huán)。當(dāng)以未經(jīng)修飾的活性形式或作為活性代謝物排泄到消化道中時(shí)，這些抗生素可對(duì)形成腸和結(jié)腸的正常微生物菌群的細(xì)菌群施加選擇壓力。這樣的微生物選擇具有兩個(gè)主要后果：由抗生素誘發(fā)的急性腹瀉的發(fā)生以及抗性細(xì)菌菌株的選擇和播散。在用腸胃外廣譜抗生素時(shí)常常觀察到發(fā)生由抗生素引起的急性腹瀉。頻率和嚴(yán)重程度由多種因素決定，包括治療的持續(xù)時(shí)間、所使用抗生素的活性譜和劑量(aires，kohler等，1999)。因此，在以下中觀察到由抗生素誘發(fā)的急性腹瀉：接受阿莫西林抗生素治療的所有患者中的約5％至10％、阿莫西林-克拉維酸聯(lián)合的10％至25％以及第三代頭孢菌素、氟喹諾酮、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素和四環(huán)素類的2％至5％(gilbert，1994；bartlett，1996，hogenauer，hammer等，1998；wistrom，norrby等，2001)。盡管由抗生素引起的急性腹瀉中的大多數(shù)病例是良性的，但是在所有病例中有10％至20％可伴隨有嚴(yán)重的結(jié)腸炎。在大部分病例中，該結(jié)腸炎繼發(fā)于對(duì)大部分抗生素具有抗性的艱難梭菌(clostridiumdifficile)(一種形成芽孢的革蘭氏陽性厭氧菌)的選擇(gerding，1989；anand，bashey等，1994)。該細(xì)菌的致病性與毒素a和毒素b二者的產(chǎn)生有關(guān)。這些毒素誘發(fā)強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)且在固有層(laminapropria)內(nèi)募集中性粒細(xì)胞，并且在最嚴(yán)重的形式中，誘發(fā)假膜性結(jié)腸炎，之所以如此命名是由于結(jié)腸直腸黏膜的外觀(kelly，pothoulakis等，1994)。假膜性結(jié)腸炎的死亡率較高，尤其是在幼兒和年長(zhǎng)者中。在2010年，在美國(guó)這些結(jié)腸炎導(dǎo)致超過7200例的死亡(sherry，murphy等，2012)。另一些病原體也可導(dǎo)致由抗生素誘發(fā)的不同嚴(yán)重程度的急性腹瀉，例如產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、a型產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringenstypea)、金黃色葡萄球菌(straphylococcusaureus)和白念珠菌(candidaalbicans)(sparks，carman等，2001；gorkiewicz，2009)?？股貙?duì)腸微生物菌群施加的選擇壓力還導(dǎo)致抗性細(xì)菌在環(huán)境中擴(kuò)散。醫(yī)院內(nèi)由這些微生物引起的感染(還稱為醫(yī)院內(nèi)感染)中的大多數(shù)在重癥監(jiān)護(hù)室和外科手術(shù)室中是特別常見且嚴(yán)重的。特別地，其涉及導(dǎo)管感染、尿路感染、肺病和術(shù)后感染。其主要由革蘭氏陰性腸桿菌、凝固酶陽性或陰性葡萄球菌、腸球菌和白念珠菌引起(richards，edwards等，2000)。醫(yī)院內(nèi)感染是死亡的一個(gè)重要原因并且是主要的健康問題。繼發(fā)于廣泛使用抗生素治療的抗性細(xì)菌出現(xiàn)使這些醫(yī)院內(nèi)感染的治療變得復(fù)雜并且代表一項(xiàng)相當(dāng)大的社會(huì)成本。在歐洲，醫(yī)院內(nèi)感染直接導(dǎo)致每年約25,000例的死亡并且導(dǎo)致每年在醫(yī)療保健和生產(chǎn)力損失方面的額外成本估計(jì)超過15億歐元(ecdc/emeajointworkinggroup，2009)。在美國(guó)，每年約170萬例的醫(yī)院內(nèi)感染直接或間接導(dǎo)致近99,000例死亡(klevens，edwards等，2007)?？股?特別是四環(huán)素類)在獸醫(yī)學(xué)中廣泛用于治療家畜和寵物。另外，在美國(guó)允許使用這些抗生素來促進(jìn)家畜的生長(zhǎng)和增重。當(dāng)然，這一密集使用參與了抗性細(xì)菌在環(huán)境中的播散(instituteofmedicine，1988；committeeondruguseinfoodanimals，1999；georgetownuniversitycenterforfoodandnutritionpolicy，1999)。β-內(nèi)酰胺類β-內(nèi)酰胺類抑制參與形成革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的基本組分肽聚糖的轉(zhuǎn)肽酶和轉(zhuǎn)糖基酶(walsh，2000)。β-內(nèi)酰胺類具有β-內(nèi)酰胺環(huán)以及修飾其藥物動(dòng)力學(xué)特性和其抗微生物譜的效力的可變側(cè)鏈(例如，第1、2、3和4代頭孢菌素)(turner，2005)。該類別包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類。β-內(nèi)酰胺類抗生素是最常開處方的抗微生物劑。β-內(nèi)酰胺類抗生素在臨床上廣泛用于不同類型的感染(例如，耳感染、呼吸道感染和腸胃感染)。數(shù)種施用途徑均可使用，但是對(duì)于通常在醫(yī)院內(nèi)治療的嚴(yán)重膿毒癥而言優(yōu)選腸胃外途徑。對(duì)于嚴(yán)重感染，通常將β-內(nèi)酰胺類抗生素與其他種類的抗生素聯(lián)合，例如在非典型肺炎的情況下阿莫西林/克拉維酸與大環(huán)內(nèi)酯類聯(lián)合。β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用促進(jìn)細(xì)菌抗性的出現(xiàn)。主要機(jī)理是獲得β-內(nèi)酰胺酶，其是能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺核心的酶。到目前為止，存在數(shù)百種或甚至數(shù)千種不同的β-內(nèi)酰胺酶，其根據(jù)序列同源性(底物和抑制劑)可分為數(shù)個(gè)家族。通常根據(jù)這些酶的優(yōu)先底物對(duì)其進(jìn)行分類(青霉素酶、頭孢菌素酶、亞胺培南酶(imipénèmase)等)。此外，β-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)進(jìn)化變得對(duì)抑制劑具有抗性或拓寬其對(duì)最新的β-內(nèi)酰胺類的作用譜(turner，2005；drawz和bonomo，2010)。這些抑制劑(克拉維酸、舒巴坦等)通常與β-內(nèi)酰胺類同時(shí)施用，并且與細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶不可逆地結(jié)合。ambler的分類舉例說明了這些β-內(nèi)酰胺酶的巨大多樣性。β-內(nèi)酰胺酶根據(jù)其核苷酸序列分為四個(gè)家族(a、b、c和d)(ambler，1980)。a組、c組和d組具有催化性絲氨酸而b組包括鋅依賴性金屬β-內(nèi)酰胺酶。a類β-內(nèi)酰胺酶包括數(shù)個(gè)亞家族，包括tem型酶(bush和jacoby，1997)，其是對(duì)青霉素和氨基青霉素類(例如氨芐西林、阿莫西林、巴氨西林)具有抗性的祖先酶。tem-36是一種ir-tem，即抗克拉維酸的β-內(nèi)酰胺酶(zhou，bordon等，1994；henquell，chanal等，1995；chaibi，sirot等，1999)；在laheyclinic網(wǎng)站(http：//www.lahey.org/studies/temtable.asp)上的tem-36或irt-7標(biāo)識(shí)符?？死S酸在臨床上與阿莫西林聯(lián)合使用以拓寬對(duì)已經(jīng)獲得典型β-內(nèi)酰胺酶(tem-1)的病菌的抗生譜。在選擇壓力下，tem通過突變數(shù)個(gè)目前已充分表征的氨基酸而逐漸變得對(duì)抑制劑具有抗性(chaibi，sirot等，1999)。在a類β-內(nèi)酰胺酶中，我們還發(fā)現(xiàn)了頭孢噻肟酶(cefotaximase)，其是由tem進(jìn)化而來將其譜拓寬至第三代頭孢菌素的酶(salverda，devisser等，2010)。例如，ctx-m16酶(該蛋白質(zhì)的genbank標(biāo)識(shí)符：aak32961)相較于不同的青霉素類優(yōu)先水解頭孢噻肟(bonnet，dutour等，2001)。由基因blaz編碼的pc1酶(該蛋白質(zhì)的uniprotkb/swiss-prot標(biāo)識(shí)符：p00807)是具有催化性絲氨酸的a類β-內(nèi)酰胺酶(ambler，1975；knott-hunziker，waley等，1979；kemal和knowles，1981；hertzberg和moult，1987)。由凝固酶陽性金黃色葡萄球菌和抗甲氧西林枯草芽孢桿菌(methi-rbacillussubtilis)產(chǎn)生的這種酶水解甲氧西林的β-內(nèi)酰胺環(huán)(novick，1963)。氨基糖苷類氨基糖苷類(還稱為氨基苷類)是通過糖苷橋與中心氨基環(huán)醇核心連接的氨基糖。該中心核心的結(jié)構(gòu)用于區(qū)別三個(gè)組群：鏈霉素類(鏈霉素)、去氧鏈霉胺類(卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素)和福提霉素類(dactamicine)。氨基糖苷類的理論抗生素譜是非常寬的，并且包括需氧革蘭氏陰性菌(桿菌、球菌和球桿菌)、凝固酶陽性或陰性葡萄球菌和革蘭氏陽性桿菌。此外，鏈霉素對(duì)結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)具有活性，并且阿米卡星對(duì)非典型分枝桿菌(鳥-胞內(nèi)分枝桿菌(mycobacteriumaviumintracellulare)等)以及星形諾卡菌(nocardiaasteroids)具有活性。氨基糖苷類與β-內(nèi)酰胺類和萬古霉素具有協(xié)同活性。氨基糖苷類由于在消化道內(nèi)吸收很少或不吸收而通常腸胃外施用。氨基糖苷類主要通過腎小球?yàn)V過主要在尿中(85％至90％的施用劑量在24小時(shí)內(nèi)消除)并且在較低程度上在膽汁中不經(jīng)腸肝循環(huán)(根據(jù)抗生素的約0.5％至2％的施用劑量)以未改變的形式消除(leroy，humbert等，1978)。氨基糖苷類的這種胃排泄導(dǎo)致抗性細(xì)菌的選擇，從而使由艱難梭菌引起的假膜性結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)略微提高(arnand，bashey等，1994)。氨基糖苷類的殺菌效果對(duì)很多病原體較快。氨基糖苷類固定在原核生物30s核糖體亞基上，并且改變細(xì)菌翻譯的準(zhǔn)確性(poehlsgaard和douthwaite，2005)。氨基糖苷類中的大部分在譯碼位點(diǎn)(位點(diǎn)a)與16s核糖體rna(30s核糖體亞基的rna組分)結(jié)合。細(xì)菌可通過可共存于同一細(xì)胞中的三種主要機(jī)理發(fā)展對(duì)氨基糖苷類的抗性(ramirez和tolmasky，2010)。第一染色體機(jī)制通過其甲基化導(dǎo)致氨基糖苷對(duì)其核糖體靶標(biāo)(16s核糖體rna)的親和力降低(doi和arakawa，2007)。第二機(jī)理基于通過改變膜滲透性來使細(xì)胞滲透性失效(hancock，1981)或通過活性機(jī)理來使氨基糖苷外排到細(xì)胞外(aires，kohler等，1999)。最后，酶失活是最常觀察到的機(jī)理。編碼這些酶的基因由質(zhì)粒和/或轉(zhuǎn)座子攜帶。因此，抗性是可轉(zhuǎn)移的并且常常在醫(yī)院內(nèi)流行。這些酶催化氨基糖苷類與不同化學(xué)基團(tuán)的不可逆結(jié)合，并且分為三類(shaw，rather等，1993；ramirez和tolmasky，2010)。磷酸轉(zhuǎn)移酶(aph)催化atp或gtp的磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，核苷酸基轉(zhuǎn)移酶(ant)能夠轉(zhuǎn)移腺苷酰基團(tuán)并且使用atp作為底物，并且乙酰轉(zhuǎn)移酶(aac)使用乙酰-coa作為底物來轉(zhuǎn)移乙?；鶊F(tuán)。根據(jù)氨基糖苷的取代基，每個(gè)酶類別均具有不同的亞類。同種酶可使具有相同分子位點(diǎn)的數(shù)種氨基糖苷類失活。aac(6’)-lb-cr(該蛋白質(zhì)的genbank標(biāo)識(shí)符：abc17627.1)是由腸桿菌天然產(chǎn)生的來自n-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的酶。其催化6’位的-nh2基團(tuán)的乙?；?，從而賦予該酶與acc(6’)亞類中其他酶相同的抗性譜(robicsek，strahilevitz等，2006)。與acc(6’)家族中的其他酶類似，aac(6’)-lb-cr也對(duì)包括阿米卡星以及慶大霉素的c1a和c2對(duì)映異構(gòu)體在內(nèi)的廣泛范圍的氨基糖苷類具有活性，但是對(duì)慶大霉素的c1對(duì)映異構(gòu)體具有非常低的活性(robicsek，strahilevitz等，2006)。aac(6’)-lb-cr可能是由于aac(6’)-lb酶通過trp102arg和asp179tyr殘基的突變進(jìn)化。這導(dǎo)致獲得了對(duì)環(huán)丙沙星、氟喹諾酮的酶活性，這是對(duì)諾氟沙星和培氟沙星顯著更低的活性。氟喹諾酮類氟喹諾酮類(例如，諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星和培氟沙星)形成一大類由喹諾酮通過化學(xué)修飾(特別是添加氟原子)衍生的合成殺菌抗生素。氟喹諾酮類是在抗生素之間彼此不同的廣譜抗生素。氟喹諾酮類的譜包括革蘭氏陰性桿菌(沙門菌屬(salmonellaspp.)、埃希菌屬(escherichiaspp.)、志賀菌屬(shigellaspp.)、變形桿菌屬(proteusspp.)、腸桿菌屬(enterobacterspp.)、幽門螺桿菌(helicobacterpylori))、革蘭氏陽性球菌(凝固酶陽性和陰性葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌)、革蘭氏陰性球菌(淋球菌、腦膜炎球菌)和革蘭氏陽性桿菌。氟喹諾酮類的組織甚至在腦脊液、前列腺、骨和膽汁中分布優(yōu)異。因此，氟喹諾酮類廣泛地用于組織感染的病例(腦膜炎、肺炎、骨和關(guān)節(jié)感染、上尿路感染或前列腺感染等)。然而，氟喹諾酮類的血清水平通常較低，并且甚至可比某些病菌的mic(最小抑制濃度)更低，從而有利于細(xì)菌抗性的出現(xiàn)。氟喹諾酮類的排泄取決于所使用的產(chǎn)品。對(duì)于培氟沙星，排泄主要是經(jīng)肝，而對(duì)于氧氟沙星及其他氟喹諾酮類，排泄主要是經(jīng)腎。氟喹諾酮類的膽汁和消化消除導(dǎo)致由艱難梭菌(特別是由尤其強(qiáng)毒菌株bi/nap1/027)引起的假膜性結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)(vardakas，konstantelias等，2012；deshpande，pasupuleti等，2013；slimings和riley，2013)。氟喹諾酮類靶向dna促旋酶以及細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶ii和iv。氟喹諾酮類在這些酶和細(xì)菌dna之間形成不可逆的復(fù)合物，其阻止dna復(fù)制并且導(dǎo)致細(xì)菌死亡。四種喹諾酮類抗性機(jī)理已得到表征(robicsek，jacoby等，2006)：(i)外排泵的活性提高，引起抗生素的細(xì)胞內(nèi)濃度降低(morita，kodama等，1998)；(ii)產(chǎn)生與dna促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶iv結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而保護(hù)它們并且固定氟喹諾酮類(robicsek，jacoby等，2006)；(iii)通過降低氟喹諾酮類對(duì)其靶標(biāo)的親和力而導(dǎo)致高水平抗性的dna促旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶iv的修飾(robicsek，jacoby等，2006)；(iv)最后，產(chǎn)生氨基糖苷n-乙酰轉(zhuǎn)移酶aac(6’)lb-cr(該蛋白質(zhì)的genbank標(biāo)識(shí)符：abc17627.1))，其能夠分解代謝環(huán)丙沙星以及在較低程度上諾氟沙星和培氟沙星的修飾(robicsek，strahilevitz等，2006)。這些抗性機(jī)理的頻率快速增加，已經(jīng)在很多細(xì)菌物種中鑒定到，包括凝固酶陽性金黃色葡萄球菌、β-溶血性鏈球菌和腸球菌(robicsek，jacoby等，2006)。大環(huán)內(nèi)酯類大環(huán)內(nèi)酯類是代表物的數(shù)量相對(duì)有限的天然和半合成抗生素的同源家族(例如，紅霉素、螺旋霉素、交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素和泰利霉素)。大環(huán)內(nèi)酯類的活性譜相對(duì)較寬，并且包括需氧革蘭氏陽性球菌(鏈球菌、肺炎球菌、腸球菌和葡萄球菌)和厭氧革蘭氏陰性球菌、例如幽門螺桿菌的某些革蘭氏陰性桿菌以及具有嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的不同細(xì)菌，例如嗜肺軍團(tuán)菌(legionellapneumophilia)、肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)和解脲支原體(mycoplasmaurealyticum)、肺炎衣原體(clamydiaepneumoniae)和沙眼衣原體(clamydiaetrachomatis)。然而，腸桿菌由于其外細(xì)胞膜阻止例如大環(huán)內(nèi)酯類的疏水性分子通過而固有地對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類具有抗性。大環(huán)內(nèi)酯類在體內(nèi)廣泛分布，除腦脊液、腦和尿之外。消除主要是在被細(xì)胞色素p450代謝之后經(jīng)膽汁。大環(huán)內(nèi)酯類的施用與繼發(fā)于艱難梭菌選擇的假膜性結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)提高有關(guān)(gilbert，1994；bartlett，1996；hogenauer，hammer等，1998；wistrom，norrby等，2001)。大環(huán)內(nèi)酯類為在位點(diǎn)p與原核生物核糖體的50s亞基可逆結(jié)合的抑制劑。由此，大環(huán)內(nèi)酯類阻止肽基-trna復(fù)合物(轉(zhuǎn)移rna)從位點(diǎn)p向位點(diǎn)a的轉(zhuǎn)移和解離，并且從而抑制肽鏈延伸(tenson，lovmar等，2003)。大環(huán)內(nèi)酯類的三種抗性機(jī)理是已知的(roberts，sutcliffe等，1999；roberts，2008)：(i)通過形成50s核糖體rna的細(xì)菌23s核糖體rna的甲基化或突變來改變靶標(biāo)。最常遇到該抗性機(jī)理的是大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽性菌素類b(weisblum，1995)；(ii)產(chǎn)生使抗生素泄露到細(xì)胞外的細(xì)胞泵，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)濃度降低；(iii)通過酶(紅霉素酯酶、紅霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)修飾大環(huán)內(nèi)酯類使得極大地降低其對(duì)核糖體的親和力的失活。這一類型的抗性還通過可動(dòng)遺傳元件而傳遞。紅霉素酯酶通過水解大環(huán)內(nèi)酯核來使大環(huán)內(nèi)酯失活。這些酶中的大多數(shù)屬于兩個(gè)亞類：erea(ounissi和courvalin，1985)和ereb(arthur，autissier等，1986)。ereb酶(uniprotkb/swiss-prot標(biāo)識(shí)符：p05789.1)具有非常寬的譜(紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素和阿奇霉素)，但是泰利霉素對(duì)水解具有抗性(morar，pengelly等，2012)。四環(huán)素類環(huán)素類或四環(huán)素類是由四環(huán)素衍生的殺菌抗生素的家族(例如氯四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素)。這些分子的特征在于具有四個(gè)稠環(huán)，由此而命名。四環(huán)素類的活性譜延伸至很多需氧和厭氧革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。四環(huán)素類還對(duì)非常規(guī)的病原體具有活性，例如支原體屬(mycoplasmaspp.)、衣原體屬(chlamydiaspp.)、立克次氏體密螺旋體(rickettsiestréponèmes)和一些原生動(dòng)物(分歧巴貝蟲(babesiadivergens)、果氏巴貝蟲(babesiamicroti)、小泰勒蟲(theileriaparva))。分枝桿菌以及腸桿菌科變形桿菌(proteus)和假單胞菌(pseudomonas)天然具有抗性。除氯四環(huán)素之外，四環(huán)素類中的大多數(shù)均是通過腎小球?yàn)V過以活性形式消除。四環(huán)素類還在膽汁中經(jīng)肝腸循環(huán)消除。四環(huán)素類的使用還與繼發(fā)于艱難梭菌選擇的假膜性結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)提高有關(guān)(gilbert，1994；bartlett，1996；hogenauer，hammer等，1998；wistrom，norry等，2001)。來自環(huán)素家族的抗生素抑制核糖體30s亞基的位點(diǎn)a的氨?；?trna的固定，并且從而抑制翻譯(chopra和roberts，2001)。已鑒定出至少三種抗性機(jī)理：(i)外排蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)四環(huán)素的細(xì)胞內(nèi)濃度降低；(ii)分子靶標(biāo)的酶修飾，阻止四環(huán)素的結(jié)合；(iii)通過nadph依賴性四環(huán)素氧化還原酶tetx(該蛋白質(zhì)的genbank標(biāo)識(shí)符：aaa27471.1)的失活(speer，bedzyk等，1991)。該酶誘導(dǎo)針對(duì)所有四環(huán)素的細(xì)菌抗性。林可酰胺類林可酰胺類(林可霉素及其半合成衍生物克林霉素)是抑菌抗生素，其盡管化學(xué)結(jié)構(gòu)與大環(huán)內(nèi)酯類不同但是具有類似的作用模式并且與鏈陽性菌素類b分組在稱為mls(大環(huán)內(nèi)酯、林可酰胺和鏈陽性菌素)的一個(gè)家族中。林可酰胺類的活性譜覆蓋除例如糞鏈球菌(streptococcusfaecalis)的少數(shù)之外的大多數(shù)革蘭氏陽性菌(例如，蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)、白喉棒狀桿菌(corynebacteriumdiphtheria)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)、mssa和mrsa、b葡萄球菌(bstaphylococcus)、不可分組的葡萄球菌(staphylococcus)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes))；以及值得注意地除艱難梭菌之外的大量厭氧菌(例如，放線菌(actinomyce)、擬桿菌(bacteroide)、梭形桿菌(fusobacterium)、痤瘡丙酸桿菌(propionibacteriumacnes))。大部分的革蘭氏陰性菌均具有抗性，除少數(shù)罕見的例外之外(例如，百日咳鮑特菌(bordetellapertussis)、彎曲桿菌(campylobacter)、衣原體(chlamydia)、螺桿菌(helicobacter)和軍團(tuán)菌(legionella))。林可酰胺類主要通過腎消除，并且在較低程度上在膽汁中經(jīng)腸肝循環(huán)消除。林可酰胺類從胃腸道的消除及其抗菌活性解釋了由艱難梭菌選擇引起的假膜性結(jié)腸炎的高頻率。類似于大環(huán)內(nèi)酯類，林可酰胺類通過在位點(diǎn)a和p與50s核糖體亞基可逆地結(jié)合來抑制細(xì)菌翻譯(tu，blaha等，2005)。林可酰胺類獲得的三種抗性機(jī)理是已知的(roberts，sutcliffe等，1999)：(i)通過構(gòu)成50s核糖體rna的細(xì)菌23s核糖體rna的甲基化和突變來改變靶標(biāo)。這種最常遇到的抗性機(jī)理對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和b鏈陽性菌素類是常見的(weisblum，1995)；(ii)細(xì)菌表達(dá)將抗生素外排到細(xì)胞外的泵，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)濃度下降；(iii)林可酰胺類的酶失活，降低其對(duì)其分子靶標(biāo)的親和力。能夠使林可酰胺失活的酶屬于林可霉素核苷酸基轉(zhuǎn)移酶的家族：葡萄球菌中的inu(a)或lin(a)、屎腸球菌中的inu(b)或lin(b)和厭氧菌中的linb樣(leclercq，brisson-noel等，1987；bozdogan，berrezouga等，1999)。例如，inu(b)酶(該蛋白質(zhì)的uniprotkb/trembl標(biāo)識(shí)符：q9wvy4)催化腺嘌呤基殘基轉(zhuǎn)移到林可霉素和克林霉素的第3位的羥基上(bozdogan，berrezouga等，1999)。抵消這些抗生素的副作用現(xiàn)有技術(shù)熟知旨在降低之前報(bào)道的腸內(nèi)的不利反應(yīng)的抗生素抑制劑。這些抑制劑基本上靶向β-內(nèi)酰胺，并且主要由經(jīng)口施用的β-內(nèi)酰胺酶組成以使其在腸道內(nèi)播散。專利ep0671942涉及醫(yī)療應(yīng)用、醫(yī)療方法和藥物制劑。該發(fā)明可靶向腸胃外施用的β-內(nèi)酰胺的作用，并且通過單獨(dú)地或與抗生素同時(shí)經(jīng)口施用例如β-內(nèi)酰胺酶的酶由于使一部分抗生素在消化道中失活而降低不利反應(yīng)。這導(dǎo)致抗生素的分解。ep2086570申請(qǐng)以類似的方法使用a類β-內(nèi)酰胺酶(更具體地p1a酶)來降低與將β-內(nèi)酰胺和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合的抗生素治療有關(guān)的腸副作用。在臨床前和臨床上評(píng)價(jià)p1aβ-內(nèi)酰胺酶的效力。該酶水解氨基青霉素類(例如，阿莫西林)和酰脲青霉素(例如，哌拉西林)，但是對(duì)β-內(nèi)酰胺抑制劑敏感。在狗中在腸胃外施用氨芐西林的同時(shí)進(jìn)行其經(jīng)口施用以劑量依賴性方式降低在這些動(dòng)物中的空腸腔中檢測(cè)到的氨芐西林量。此外，在循環(huán)中未檢測(cè)到p1aβ-內(nèi)酰胺酶的存在，并且氨芐西林的血清濃度未顯著改變(harmoinen，vaali等，2003；harmoinen，mentula等，2004)。在接受腸胃外施用哌拉西林的小鼠中經(jīng)口施用該酶非常顯著地降低糞便中針對(duì)該抗生素的抗性微生物的數(shù)量(vre-屎腸球菌、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)和光滑念珠菌(candidaglabrata))(stiefel，pultz等，2003；mentula，harmoinen等，2004)。最后，臨床實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)口施用p1aβ-內(nèi)酰胺酶在靜脈內(nèi)施用氨芐西林之后在健康志愿者中降低對(duì)氨芐西林具有抗性的腸桿菌科分離菌的數(shù)量以及對(duì)其他種類抗生素具有抗性(特別是對(duì)四環(huán)素類具有抗性)的腸桿菌科分離菌的數(shù)量(tarkkanen，heinonen等，2009)。還已經(jīng)開發(fā)了屬于其他種類β-內(nèi)酰胺酶的重組β-內(nèi)酰胺酶。專利ep2038411描述了在接受碳青霉烯類的患者中降低腸副作用的金屬β-內(nèi)酰胺酶突變體及其合成?，F(xiàn)有技術(shù)還涵蓋靶向?qū)⑦@些酶在腸內(nèi)之遞送的劑型。專利fr2843302描述了能夠抑制大環(huán)內(nèi)酯類的酶(例如紅霉素酯酶)限于結(jié)腸遞送的用于經(jīng)口施用的多顆粒劑型?，F(xiàn)有技術(shù)中解決方案的缺點(diǎn)現(xiàn)有技術(shù)中的解決方案使用僅靶向一種類型的抗生素的酶，分解β-內(nèi)酰胺類的β-內(nèi)酰胺酶或抑制大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素酯酶。通常將不同的抗生素用于醫(yī)院患者，并且甚至在同一患者中組合。抑制單一種類的抗生素對(duì)抗性細(xì)菌菌株的出現(xiàn)僅具有適度或最小效果。作為實(shí)例，通常用第三代頭孢菌素類與氨基糖苷類的聯(lián)合來治療革蘭氏陰性桿菌的嚴(yán)重感染，而用阿莫西林-克拉維酸與大環(huán)內(nèi)酯類或四環(huán)素類的聯(lián)合來容易地治療非典型肺炎。由于現(xiàn)有技術(shù)中所述的抗生素抑制劑針對(duì)單一種類的抗生素，因此其在同時(shí)使用不同種類抗生素的環(huán)境中(特別是在醫(yī)院中)無法有效地防止抗性細(xì)菌菌株的出現(xiàn)。本發(fā)明提供的解決方案本發(fā)明在其最廣泛認(rèn)可的意義上提出通過提供包含能夠抑制至少一種抗生素的活性的至少兩種蛋白質(zhì)的雜合蛋白分子來克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，每種蛋白質(zhì)具有不同的生物化學(xué)特性，所述蛋白質(zhì)連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述能夠抑制至少一種抗生素的活性的蛋白質(zhì)共價(jià)連接在一起。根據(jù)本發(fā)明所述的雜合蛋白分子抑制至少一種抗生素的活性以降低抗生素的腸副作用，例如由抗生素引起的急性腹瀉和繼發(fā)于施用腸胃外抗生素的醫(yī)院內(nèi)感染。應(yīng)理解，與現(xiàn)有技術(shù)中的解決方案相比，本發(fā)明具有更寬的作用譜。優(yōu)選地，本發(fā)明中的雜合蛋白分子經(jīng)口施用。根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白分子可包含能夠抑制很多種類的抗生素(并且特別是臨床實(shí)踐中最常用的聯(lián)合)的蛋白質(zhì)。因此，單一雜合蛋白分子的施用可靶向數(shù)種抗生素，從而降低開處方產(chǎn)品的數(shù)量。雜合蛋白分子是指通過將兩種或更多種多肽鏈人工組合而形成的雜合蛋白。抑制抗生素活性是指導(dǎo)致所考慮抗生素的生物活性降低或受到抑制的所有過程。這包括但不限于以特異性方式(例如，使用單克隆抗體或單克隆抗體的片段)或非特異性方式(例如，通過吸附)使抗生素結(jié)合在其他分子上、通過酶促或非酶促添加化學(xué)基團(tuán)來修飾抗生素或者通過抗生素或非抗生素機(jī)理來水解抗生素。有利地，所述蛋白質(zhì)中的至少一種是能夠抑制至少一種抗生素的活性的酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每種蛋白質(zhì)均是能夠優(yōu)先地抑制至少一種抗生素的活性的酶。有利地，每種蛋白質(zhì)優(yōu)先地抑制不同抗生素的活性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合蛋白分子包含能夠抑制至少一種抗生素的活性的至少兩種蛋白質(zhì)，每種酶均具有不同的生物化學(xué)特性，所述酶共價(jià)結(jié)合在一起。應(yīng)理解，每種酶均優(yōu)先地分解兩種不同的抗生素。本發(fā)明出乎意料地證明，如上限定的雜合蛋白分子將形成它們的蛋白質(zhì)的各自功能活性組合，使得擴(kuò)大其作用譜并且增強(qiáng)其在經(jīng)受高選擇壓力的醫(yī)院環(huán)境中的效力?？墒褂檬挂环N或更多種抗生素失活的數(shù)種類型的蛋白質(zhì)來形成雜合蛋白分子，所述蛋白質(zhì)包括單克隆抗體的片段(例如，單價(jià)或二價(jià)scfv)、水解酶或催化其他類型修飾的酶。有利地，根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白分子由能夠抑制抗生素(優(yōu)選選自以下的抗生素)的活性的一種或數(shù)種蛋白質(zhì)組成：β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和/或林可酰胺類。優(yōu)選地，所述雜合蛋白分子中的每種蛋白質(zhì)抑制不同抗生素的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合蛋白分子包含能夠抑制屬于同一類別的抗生素的活性的兩種蛋白質(zhì)。有利地，所述雜合蛋白中至少一種組成蛋白的序列與seqid1至seqid7具有至少40％的蛋白質(zhì)序列同源性。該序列同源性使用clustalw2或clustalomega軟件用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算參數(shù)來確定(thompson，higgins等，1994；larkin，blackshields等，2007)。優(yōu)選地，該序列同源性為與seqid1至seqid7的至少50％，并且甚至更優(yōu)選至少60％。所述雜合蛋白分子的組成蛋白或組成酶可包含0個(gè)、1個(gè)或數(shù)個(gè)糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)或酶組合成單一單鏈蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雜合蛋白分子包含抑制至少一種抗生素的活性的結(jié)合在一起的兩種酶，所述酶中的一種為β-內(nèi)酰胺酶并且所述酶中的一種為選自以下的酶：β-內(nèi)酰胺酶、抑制氨基糖苷類的酶、抑制氟喹諾酮類的酶、抑制大環(huán)內(nèi)酯類的酶、抑制四環(huán)素類的酶或抑制林可酰胺類的酶。應(yīng)理解，所述雜合蛋白分子可包含：-結(jié)合在一起的兩種β-內(nèi)酰胺酶；或者-相互連接的選自β-內(nèi)酰胺酶和抑制氨基糖苷類的酶的酶，所述抑制氨基糖苷類的酶為磷酸轉(zhuǎn)移酶、核苷酸基轉(zhuǎn)移酶或乙酰轉(zhuǎn)移酶；或者-相互連接的選自β-內(nèi)酰胺酶和抑制氟喹諾酮類的酶的酶，所述抑制氟喹諾酮類的酶為氨基糖苷n-乙酰轉(zhuǎn)移酶；或者-相互連接的選自β-內(nèi)酰胺酶和抑制大環(huán)內(nèi)酯類的酶的酶，所述抑制大環(huán)內(nèi)酯類的酶為紅霉素酯酶或紅霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；或者-相互連接的選自β-內(nèi)酰胺酶和抑制四環(huán)素類的酶的酶，所述抑制四環(huán)素類的酶為nadph依賴性四環(huán)素氧化還原酶；或者-相互連接的選自β-內(nèi)酰胺酶和抑制林可酰胺類的酶的酶，所述抑制林可酰胺類的酶為林可霉素核苷酸基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明人出乎意料且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)所述雜合蛋白分子針對(duì)其靶抗生素的效力等于單獨(dú)的其所包含的酶。這些雜合蛋白還可作為由翻譯單個(gè)閱讀框產(chǎn)生的單條蛋白質(zhì)鏈來人工獲得，所述單個(gè)閱讀框通過將蛋白質(zhì)組分的相應(yīng)閱讀框直接融合或者通過編碼由一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸組成的銜接子的核苷酸序列來獲得。已知為惰性的并且沒有特定生物作用的該銜接子可以是柔性的、半剛性的或剛性的(chen，zaro等，2013)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述蛋白質(zhì)或酶通過交聯(lián)共價(jià)連接在一起。這些雜合蛋白還可使用化學(xué)試劑(chen，nielsen等，2013)、酶促催化(paguirigan和beebe，2007)、暴露于紫外光(fancy和kodadek，1999)或?qū)е鹿矁r(jià)鍵形成的任何其他方法通過交聯(lián)來人工獲得。或者，這樣的雜合蛋白可通過將一個(gè)或數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)亞基通過高親和力配體非共價(jià)地組裝來獲得，例如，(鏈霉)親和素/生物素復(fù)合物(schultz，lin等，2000；lin，pagel等，2006；pagel，lin等，2006)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白分子的人用或獸用藥物組合物，其用于防止腸菌群改變。有利地，本發(fā)明提供了藥物組合物，其用于防止醫(yī)院內(nèi)感染。有利地，本發(fā)明提供了藥物組合物，其用于預(yù)防與施用抗生素相關(guān)的腹瀉。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的包含雜合蛋白分子的藥物組合物是用于經(jīng)口施用的劑型。應(yīng)理解，本發(fā)明提供了包含雜合蛋白分子的藥物組合物，其用于防止正常腸菌群改變以防止抗性細(xì)菌在環(huán)境中擴(kuò)散，降低由多重抗性微生物引起的醫(yī)院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)和/或嚴(yán)重程度，并且降低由抗生素引起的腹瀉的頻率和嚴(yán)重程度。有利地，所述藥物組合物用于施用于人，包括兒科。應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可在施用一種或數(shù)種抗生素之前、同時(shí)或之后施用，優(yōu)選經(jīng)口施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于獸用以防止通過接受抗生素的寵物或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物擴(kuò)散針對(duì)抗生素的細(xì)菌抗性。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還包含任何可藥用的物質(zhì)，例如輔料、賦形劑、穩(wěn)定劑、鹽、添加劑、黏合劑、潤(rùn)滑劑、包衣劑、著色劑、矯味劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他常規(guī)用試劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以是固體或液體形式，但不限于凝膠劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、混懸劑或乳劑的形式。根據(jù)一個(gè)變體方案，所述藥物組合物包含至少一種胃保護(hù)劑。胃保護(hù)劑是指用于延遲雜合蛋白分子在腸內(nèi)(優(yōu)選在十二指腸和空腸內(nèi))釋放的對(duì)胃液具有抗性的試劑。胃保護(hù)劑還可以是包衣劑，例如但不限于聚甲基丙烯酸酯(例如，)、基于纖維素的聚合物(例如的纖維素醚，纖維素酯)、聚乙酸乙烯酯共聚物(例如，)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于包衣或包封或工藝的任何其他試劑。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涵蓋用于在活非人重組生物體中產(chǎn)生雜合蛋白分子的方法?；钪亟M生物體是指能夠遺傳改造以產(chǎn)生雜合蛋白分子的任何細(xì)胞。在沒有限制下，術(shù)語能夠遺傳修飾的細(xì)胞是指任何原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌(escherichiacoli))、酵母(例如，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica))、經(jīng)或未經(jīng)桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，cho、cho-k1、hek293、hek293t)。法明詳述根據(jù)對(duì)以下非限制性實(shí)施例的描述，將更好地理解本發(fā)明。附圖說明圖1示出了屬于ir-tem家族(ambera類)的不同β-內(nèi)酰胺酶的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。所述比對(duì)在https：//www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2網(wǎng)站上用clustalw2軟件使用默認(rèn)設(shè)置來進(jìn)行。圖1顯示：通過數(shù)條序列的比對(duì)，ir-tem酶顯示出＞90％的蛋白質(zhì)同一性。這些酶相對(duì)地保存良好且共有80％至99％的蛋白質(zhì)序列同一性，并且還得到充分表征(bonnet，2004)。圖2示出了屬于ctx-m頭孢噻肟酶家族(ambera類)的不同β-內(nèi)酰胺酶的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。所述比對(duì)在https：//www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2網(wǎng)站上使用軟件上的默認(rèn)設(shè)置來進(jìn)行。圖3提供了用于產(chǎn)生雜合蛋白的pcr技術(shù)的圖示。首先，用組成接頭的共有序列單獨(dú)地?cái)U(kuò)增(分別在3’端和5’端)兩種蛋白質(zhì)。然后，使兩個(gè)片段雜交至互補(bǔ)dna序列(接頭的互補(bǔ)dna序列)的水平，并用外部引物重新擴(kuò)增整體。圖4描述了用于在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)tem-36(seqid1)、ctxm-16(seqid2)、tem36-gggggg-ctxm16(seqid8)、ctxm16-gggggg-tem36(seqid9)和tem36-g(eaaak)2-ctxm16(seqid10)蛋白質(zhì)的所有構(gòu)建體。在xhoi/noti中進(jìn)行克隆到載體pjexpress915中，當(dāng)需要時(shí)利用適度消化以保留ctxm16的編碼dna序列的內(nèi)部noti位點(diǎn)。圖5示出了克隆到xhoi/noti中的dna片段，其編碼tem-36(seqid1)、ctxm-16(seqid2)、tem36-gggggg-ctxm16(seqid8)、ctxm16-gggggg-tem36(seqid9)和tem36-g(eaaak)2-ctxm16(seqid10)蛋白質(zhì)并且通過使用pjexpress915-seq-f和pjexpress915-seq-r引物和以下程序的pcr獲得(95℃30秒-25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒-53℃45秒-72℃1分鐘]-72℃5分鐘-4℃)。圖6示出了在12％sds-page凝膠上的雜合蛋白及其組成酶tem-36(seqid1)和ctmx-16(seqid2)，如通過在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)并純化和在通過endohf進(jìn)行去糖基化處理之后獲得的。圖7描述了用于在大腸桿菌中表達(dá)tem-36(seqid1)、ctmx-16(seqid2)和雜合蛋白tem36-ggggg-ctxm16、ctxm-16-ggggg-tem36的所有構(gòu)建體。通過ndei/hindiii來進(jìn)行克隆到pet-26(+)載體中。圖8示出了克隆到pet-26(+)中的ndei/hindiii中的dna片段，其編碼tem-36(seqid1)、ctxm-16(seqid2)、tem36-ggggg-ctxm16、ctxm16-ggggg-tem36并且通過使用t7-f和t7-r引物以及以下程序的pcr獲得(95℃30秒-25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒-55℃45秒-72℃1分鐘]-72℃5分鐘-4℃)。圖9示出了在12％sds-page凝膠上的雜合蛋白(tem36-g5-ctxm16和ctxm16-g5-tem36)及其組成酶tem-36(seqid1)和ctxm-16(seqid2)，如通過在大腸桿菌(e.coli)中表達(dá)并從周質(zhì)級(jí)分純化獲得的。圖10示出了在構(gòu)建aac-h6-ctxm16(seqid18)融合體中獲得的編碼aac-6’-lb-cr(seqid4)、ctxm-16(seqid2)和aac-h6-ctxm16的dna片段。圖11示出了在12％sds-page凝膠上的雜合蛋白aac-h6-ctxm16及其組成酶aac-6’-lb-cr(seqid4)和ctxm-16(seqid2)，如aac-6’-lb-cr和雜合蛋白在大腸桿菌中以及ctmx-16在巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)中表達(dá)并純化之后獲得的。圖12示出了在構(gòu)建ereb-h6-ctxm16(seqid20)融合體中獲得的編碼ereb(seqid5)、tem36(seqid1)和ereb-h6-tem36的dna片段。序列表說明下表1總結(jié)了序列的列表并且與每個(gè)seq-id(表中的idno.)、序列類型、其名稱、其來源、其表達(dá)生物體及其大小相匹配。表1.序列表中序列1至22的鑒定實(shí)施例1：由tem-36和ctx-m16通過柔性接頭的融合體組成的雜合蛋白分子本發(fā)明的第一實(shí)施方案描述了ir-tem(seqid1；(chaibi，sirot等，1999))與頭孢噻肟酶(seqid2；(bonnet，dutour等，2001))通過柔性多聚甘氨酸接頭(在該實(shí)施例中為6個(gè)甘氨酸殘基)的融合體，并且產(chǎn)生能夠水解甚至克拉維酸存在下的阿莫西林以及頭孢曲松的雜合蛋白(seqid8)。編碼蛋白質(zhì)tem-36(seqid1)和ctx-m16(seqid2)的核苷酸序列在巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體中通過基因合成而商購(gòu)獲得(https：//www.dna20.com/services/gene-synthesis？gclid＝cpnqip3c9r0cfaoewwodnrealg)。插入到表達(dá)載體中的tem-36的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于seqid11，并且插入到表達(dá)載體中的ctx-m16的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于seqid12。然后，通過使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)和如表2中所示的構(gòu)成蛋白質(zhì)接頭(在該實(shí)施例中為gggggg)的部分互補(bǔ)引物的pcr(95℃30秒-25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒-tm℃45秒-72℃1分鐘]-72℃5分鐘-4℃)來擴(kuò)增這些序列。使用tm為57℃的tem36-f和tem36-6g-r引物對(duì)來擴(kuò)增tem-36。使用tm為57℃的6g-ctxm16-f和ctxm16-r引物對(duì)來擴(kuò)增ctxm16。接頭gggggg的組成序列在表2中以粗體示出并且加有下劃線。表2用于構(gòu)建和測(cè)序具有剛性接頭的tem-36/ctx-m16雜合蛋白的引物的列表。將由此獲得的兩種pcr片段在55℃的tm下雜交，并使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)在沒有引物下在5個(gè)pcr循環(huán)(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)內(nèi)使其互補(bǔ)。在添加外部引物(tem36-f+ctxm16-r)之后重新擴(kuò)增編碼雜合蛋白的完整序列。通過pcr進(jìn)行融合的這一實(shí)施方案示意性地示于圖3中。用xhoi和noti限制性酶將由此產(chǎn)生的tem36-gggggg-ctxm16融合體克隆在pjexpress915載體(在巴斯德畢赤酵母中表達(dá))中(圖4)。在兩個(gè)方向上驗(yàn)證雜合構(gòu)建體的序列，并且其對(duì)應(yīng)于所描述的融合體。圖5總結(jié)了用引物pjexpress915-seq-f和pjexpress915-seq-r獲得的pcr片段。在鹽消耗的lb培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl5g/l，ph＝7.5)上通過維持25μg/ml的zeocine(invitrogen)選擇壓力來在大腸桿菌dh10b中擴(kuò)增表達(dá)tem-36、ctx-m16和融合體tem36-gggggg-ctxm16的pjexpress915載體。為了轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，通過在1500v下電擊將2μg線性化載體與swai酶電穿孔到60μl感受態(tài)細(xì)胞中。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在1ml的1m冷山梨醇中復(fù)蘇并在30℃下放入培養(yǎng)物中2小時(shí)，之后涂布(200μl)在包含100至400μg/mlzeocin和頭孢硝噻吩(20μg/ml)的ypd-瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、右旋糖20g/l、瓊脂15g/l-磷酸鹽10mmph＝6.8)上。pjexpress915載體從巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)導(dǎo)致在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的分泌。在包含頭孢硝噻吩的ypd-瓊脂板上，分泌的β-內(nèi)酰胺酶在集落周圍誘導(dǎo)代表表達(dá)水平的紅色水解暈(λ＝486nm)。在孵育48小時(shí)之后，將每種構(gòu)建體表達(dá)最佳的轉(zhuǎn)化株接種在包含5mlypd和100μg/mlzeocin的sterlin管中并在30℃和200rpm的攪拌下培養(yǎng)48小時(shí)。然后，將預(yù)培養(yǎng)物以在600nm下為0.2的初始光密度在沒有抗生素選擇壓力下接種在400ml(每個(gè)帶擋板的錐形瓶200ml)的新鮮ypd培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在以100rpm攪拌下于30℃下靜置48小時(shí)。在4℃下以10,000×g離心15分鐘之后，將培養(yǎng)基(上清液)在芐脒(1mm終濃度)存在下儲(chǔ)存在4℃下。然后，如下將培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)濃縮10倍：通過10kda膜(vivaflow10模塊，sartorius)切向過濾至40ml的體積，然后在10kda膜(centricon，millipore)上通過超濾直至10ml的體積。將10ml進(jìn)樣到尺寸排阻色譜柱(superdexg75用于tem-36和ctx-m16蛋白；superdexg200用于熔融；26＊60柱gehealthcare)上，并在10mm磷酸鈉緩沖液(ph＝7.0)中通過1ml級(jí)分且以1ml/分鐘的流量洗脫。將對(duì)頭孢硝噻吩具有最高活性(vwr)且純度最佳(sds-page)的級(jí)分合并并濃縮至約0.1mg/ml至0.5mg/ml。通過bca(pierce)、280nm下的吸光度和在sds-page凝膠上驗(yàn)證來測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)含量。圖6提供了結(jié)果。對(duì)于具有n-糖基化位點(diǎn)的ctx-m16和融合體，通過用endohf酶(newenglandbiolabs)根據(jù)生產(chǎn)商的建議切割糖來驗(yàn)證糖基化(在沒有變性劑的條件下于37℃下過夜)。通過胰蛋白酶消化和maldi-tof質(zhì)譜分析來確定產(chǎn)生并純化的蛋白質(zhì)。如圖6所示，tem-36蛋白未被糖基化，并且其大小符合28kda的預(yù)期大小，與ctx-m16蛋白和不同的融合體相對(duì)。后者在sds-page凝膠上的表觀分子量較高(ctx-m16和融合體分別為45kda相對(duì)于28kda和＞66kda相對(duì)于56kda)。endohf的切割提供了具有預(yù)期分子量的蛋白質(zhì)(ctx-m16和相應(yīng)的融合體為28kda和56kda)，從而確定這些蛋白質(zhì)被糖基化。對(duì)不同的β-內(nèi)酰胺(阿莫西林(apolloscientific)、(glaxosmithkline)和頭孢曲松(roche))測(cè)試經(jīng)純化的蛋白質(zhì)。在25ml的反應(yīng)體積中在ph-stat(titrino2.5，metrohm)下在37℃和ph＝7.0下進(jìn)行測(cè)定。在0.3mmtris緩沖液(150mmnacl)中以4g/l制備底物。β-內(nèi)酰胺核的酶水解釋放酸并且導(dǎo)致ph下降。測(cè)定的原理是通過添加0.1n氫氧化鈉來補(bǔ)償酸化以維持在ph＝7.0。在這些條件下，1單位對(duì)應(yīng)于每分鐘添加1μmole氫氧化鈉，即每分鐘水解1μmoleβ-內(nèi)酰胺。下表3列出了測(cè)量的每種蛋白質(zhì)對(duì)三種底物的比活性(6次重復(fù)的平均值)。表3.在巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生并純化的具有柔性接頭的雜合蛋白tem-36/ctx-m16及其組成酶的比活性這些結(jié)果表明，tem-36與ctx-m16之間的融合產(chǎn)生對(duì)氨基青霉素類(甚至在β-內(nèi)酰胺酶抑制劑存在下)和第三代頭孢菌素類二者均具有活性的雜合蛋白。由于文獻(xiàn)中(ripoll，baquero等，2011)將兩種活性描述為拮抗劑，因此尚沒有已知的天然酶對(duì)這兩種底物具有這樣的高催化常數(shù)。實(shí)施例2：由ctx-m16和tem-36通過柔性接頭的融合體組成的雜合蛋白分子本發(fā)明的第二實(shí)施方案描述了頭孢噻肟酶(seqid2；(bonnet，dutour等，2001))與ir-tem(seqid1；(chaibi，sirot等，1999))通過柔性接頭多聚甘氨酸(在該實(shí)施例中為6個(gè)甘氨酸殘基)的融合體，并且產(chǎn)生能夠甚至水解甚至克拉維酸存在下的阿莫西林以及頭孢曲松的雜合蛋白(seqid9)。該實(shí)施方案與實(shí)施例1中描述的相同，不同之處在于用于擴(kuò)增ctxm16和tem-36序列的pcr引物。使用tm為58℃的ctxm16-f和ctxm16-6g-r引物對(duì)來擴(kuò)增ctxm-16。使用tm為58℃的6g-tem36-f和tem36-r引物對(duì)來擴(kuò)增tem-36。接頭gggggg的組成序列在表4中以粗體示出并且加有下劃線。表4用于構(gòu)建和測(cè)序具有柔性接頭的ctx-m16/tem-36雜合蛋白的引物的列表。將由此獲得的兩種pcr片段在55℃的tm下雜交，并使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)在沒有引物下在5個(gè)pcr循環(huán)(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)內(nèi)使其互補(bǔ)。在添加外部引物(ctxm16-f+tem-36-r)之后再擴(kuò)增編碼雜合蛋白的全序列。用于表達(dá)和純化ctxm16-gggggg-tem36雜合蛋白的條件與實(shí)施例1中描述的那些嚴(yán)格相同。如圖6中所示，由此獲得的雜合蛋白也是糖基化的，并且將克拉維酸存在下的持久青霉素酶活性與頭孢噻肟酶活性組合。如實(shí)施例1中的情況，沒有天然蛋白質(zhì)對(duì)底物阿莫西林/克拉維酸和頭孢曲松二者顯示出表5中所述的比活性。表5.在巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生并純化的具有剛性接頭的雜合蛋白ctx-m16/tem-36及其組成酶的比活性實(shí)施例3：由tem-36和ctx-m16通過剛性接頭的融合物組成的雜合蛋白分子本發(fā)明的第三實(shí)施方案描述了ir-tem(seqid1；(chaibi，sirot等，1999))與頭孢噻肟酶(seqid2；(bonnet，dutour等，2001))通過剛性蛋白質(zhì)接頭(在該實(shí)施例中為基序g(eaaak)2)的融合體，并且產(chǎn)生能夠水解甚至克拉維酸存在下的阿莫西林以及頭孢曲松的雜合蛋白(seqid10)。該實(shí)施方案與實(shí)施例1中描述的相同，不同之處在于用于擴(kuò)增ctxm16和tem-36序列的pcr引物。使用tm為58℃的tem36-f和tem36-g(eaaak)2-r引物對(duì)來擴(kuò)增tem-36。使用tm為58℃的ctxm16-g(eaaak)2-f和ctxm16-r引物對(duì)來擴(kuò)增ctxm16。接頭g(eaaak)2的組成序列在表6中以粗體示出并且加有下劃線。表6.用于構(gòu)建和測(cè)序具有剛性接頭的ctx-m16和tem-36雜合蛋白的引物的列表。將由此獲得的兩種pcr片段在55℃的tm下雜交，并使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)在沒有引物下在5個(gè)pcr循環(huán)(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)內(nèi)使其互補(bǔ)。在添加外部引物(tem36-f+ctxm16-r)之后再擴(kuò)增編碼雜合蛋白的全序列。用于表達(dá)和純化tem36-g(eaaak)2-tem36雜合蛋白的條件與實(shí)施例1中描述的那些嚴(yán)格相同。由此獲得的雜合蛋白也是糖基化的(圖6)，并且將克拉維酸存在下的持久青霉素酶活性與頭孢噻肟酶活性組合。表7在巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生并純化的具有柔性接頭的ctx-m16/tem-36雜合蛋白及其組成酶的比活性如實(shí)施例1和2中，沒有天然蛋白質(zhì)對(duì)底物阿莫西林/克拉維酸和頭孢曲松二者顯示出表7中所述的比活性。實(shí)施例4：由tem-36和ctx-m16(且反之亦然)通過柔性接頭的融合體組成的非糖基化雜合蛋白分子tem-36(seqid1)和ctxm16(seqid2)的編碼序列在大腸桿菌的周質(zhì)表達(dá)載體中通過基因合成而商購(gòu)獲得(https：//www.dna20.com/services/gene-synthesis？qclid＝cpnqlp3c9r0cfaoewwodnrealg)。用起始甲硫氨酸的ndei限制性位點(diǎn)和終止密碼子后的hindiii限制性位點(diǎn)與編碼周質(zhì)靶向肽(msiqhfrvalipffaafclpvfa)的閱讀框同步獲得核苷酸序列。然后，將基因片段ndei/hindiii亞克隆在pet-26b(+)載體(invitrogen)中。如圖3所示，我們通過重疊pcr產(chǎn)生了兩種雜合蛋白分子。通過使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)和構(gòu)成接頭蛋白(在該實(shí)施例中為gggggg)的部分互補(bǔ)引物的pcr(95℃30秒-25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒-tm℃45秒-72℃1分鐘]-72℃5分鐘-4℃)來擴(kuò)增tem-36和ctx-m16的核苷酸序列。在55℃的tm下使用t7-f和tem36-g6-r-co引物對(duì)或者tem36-g6-f-c0和t7-r引物對(duì)來擴(kuò)增tem-36。在55℃的tm下使用ctxm16-g6-f-co和t7-r引物對(duì)或者ctxm16-g6-r-co和t7-f引物對(duì)來擴(kuò)增ctxm16。接頭gggggg的組成序列在表8中以粗體示出并且加有下劃線。表8.用于構(gòu)建和測(cè)序具有柔性接頭的tem-36/ctx-m16雜合蛋白的引物的列表。將由此獲得的兩種pcr片段(tem36-g6+g6-ctxm16和ctxm16-g6+g6-tem36)在53℃的tm下雜交，并使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)在沒有引物下在5個(gè)pcr循環(huán)(95℃30秒-53℃45秒-72℃2分15)內(nèi)使其互補(bǔ)。在添加外部引物(t7-f+t7-r)之后于55℃的tm下再擴(kuò)增編碼雜合蛋白的全序列。用ndei和hindiii限制性酶將由此產(chǎn)生的融合體tem36-gggggg-ctxm16和ctx-m16-gggggg-tem36克隆在pet26b+載體(在大腸桿菌中表達(dá))中(圖7)。在兩個(gè)方向上驗(yàn)證雜合構(gòu)建體的序列并且揭示，2種雜合蛋白分子的接頭實(shí)際上僅由5個(gè)甘氨酸組成?？赡茉趐cr雜交時(shí)發(fā)生更有利的核酸重排。圖8總結(jié)了用t7-f和t7-r引物獲得的pcr片段。在lb培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl10g/l，ph＝7)上通過維持50μg/ml的卡那霉素(euromedex)選擇壓力來在大腸桿菌dh10b中擴(kuò)增表達(dá)tem-36(seqid1)、ctx-m16(seqid2)以及融合體tem36-g5-ctxm16和ctxm16-g5-tem36的pet-26b(+)表達(dá)載體。通過熱休克來用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株bl21(de3)plyss。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在包含50μg/ml卡那霉素的lb-瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl10g/l、瓊脂15g/l，ph＝7)上。在大腸桿菌中從pet-26b(+)載體的表達(dá)導(dǎo)致目的蛋白在其具有功能的細(xì)菌周質(zhì)隔室中尋址。以2種互補(bǔ)的方式來評(píng)價(jià)如實(shí)施例4中所述產(chǎn)生的融合體：(i)通過在生物化學(xué)上表征經(jīng)部分純化的蛋白質(zhì)和(ii)通過比較不同β-內(nèi)酰胺類(阿莫西林、augmentin和rocéphine)對(duì)表達(dá)菌株的最小抑制濃度(mic)。大腸桿菌中雜合蛋白分子及其組分的純化將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在100mllb+50μg/ml卡那霉素中于37℃和200rpm的攪拌下培養(yǎng)，直到飽和。然后，將預(yù)培養(yǎng)物以1/40接種在1llb培養(yǎng)基+50μg/ml卡那霉素中。當(dāng)od600nm的值達(dá)到0.6時(shí)(約2小時(shí))，通過添加終濃度為0.5mm的最終iptg來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，并在20℃下在以200rpm攪拌下繼續(xù)進(jìn)行16小時(shí)。將細(xì)胞在4℃下以5,000×g離心15分鐘，并將沉淀物立即在滲透緩沖液中進(jìn)行處理以破壞外膜并回收周質(zhì)。將細(xì)胞用1ml緩沖液(磷酸鹽100mm、蔗糖500mm、edta1mm，ph＝7.0)處理以使od600nm為120個(gè)單位，并在渦旋均化下孵育數(shù)分鐘(改編自(schlegel，rujas等2013)的方案)。在4℃下以12,000×g離心20分鐘之后，將包含周質(zhì)蛋白的上清液在amiconultra(15ml，10kda，millipore)上濃縮，直到體積不超過10ml。將全部蛋白質(zhì)進(jìn)樣到排阻色譜柱(superdexg75，gehealthcare)上，并將蛋白質(zhì)在磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽10mm、nacl100mm，ph＝7.0)中按照1ml的級(jí)分且以1ml/分鐘的流量洗脫。將對(duì)頭孢硝噻吩具有最高活性(vwr)且純度最佳(sds-page)的級(jí)分合并，并濃縮至約0.1至0.5mg/ml。通過280nm下的吸光度和在sds-page凝膠上驗(yàn)證來測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)含量。圖9示出了如在生物化學(xué)表征之前獲得的經(jīng)部分純化的蛋白質(zhì)。如上述實(shí)施例中所述，對(duì)不同的β-內(nèi)酰胺類(阿莫西林(apolloscientific)、(glaxosmithkline)和頭孢曲松(roche))測(cè)量經(jīng)純化蛋白質(zhì)的酶活性，并且結(jié)果匯編在下表9中。表9.在大腸桿菌bl21(de3)plyss中產(chǎn)生并純化的雜合蛋白分子tem36-g5-ctxm16和ctxm16-g5-tem36(柔性接頭)及其組成酶的比活性。如實(shí)施例1至3中，沒有天然蛋白質(zhì)對(duì)底物阿莫西林和頭孢曲松二者顯示出表9中所述的比活性。表達(dá)雜合蛋白分子的大腸桿菌菌株針對(duì)不同β-內(nèi)酰胺類的抗性：將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(表達(dá)tem36、ctxm16或者融合體tem36-g5-ctxm16和ctxm16-g5-tem36)或空載菌株(bl21(de3)plyss)放入5mllb+50μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)物中，當(dāng)需要時(shí)在37℃和200rpm的攪拌下放入，直到飽和。然后，將預(yù)培養(yǎng)物以1/40接種在5mllb+50μg/ml卡那霉素培養(yǎng)基中，并且當(dāng)od600的值達(dá)到0.6時(shí)(約2小時(shí))，通過添加最終1mm的iptg來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，并在37℃下在以200rpm攪拌下繼續(xù)進(jìn)行1.5小時(shí)。將細(xì)胞以108cfu/ml歸一化，并級(jí)聯(lián)稀釋至107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml，并將5μl的每種懸浮液置于包含提高濃度的抗生素(阿莫西林0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml；augmentin0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml；和rocéphine0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml)的lb-瓊脂板上。將皿在37℃下孵育過夜，并在第二天記錄結(jié)果。mic對(duì)應(yīng)于最高接種物不生長(zhǎng)下的最低抗生素濃度。數(shù)據(jù)在下表10中提供。表10.β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)表達(dá)雜合蛋白分子tem36-g5-ctxm16和ctxm16-g5-tem36(柔性接頭)及其組成酶的大腸桿菌菌株的mic。如實(shí)施例4所述的表達(dá)雜合蛋白分子的大腸桿菌細(xì)胞顯示出針對(duì)氨基青霉素類(在例如克拉維酸的抑制劑存在或不存在下)和第三代頭孢菌素類(例如頭孢曲松)的多重抗藥性表型。到目前為止，在文獻(xiàn)中還沒有描述具有這樣的表型的天然細(xì)菌菌株。實(shí)施例5：由ctx-m16和aac-6’-lb-cr通過多聚組氨酸接頭的融合體組成的雜合蛋白分子編碼ctx-m16(seqid2)和aac-6’-lb-cr蛋白(在下文稱為aac)(seqid4)的核苷酸序列分別在大腸桿菌的表達(dá)載體pjexpress411(kanr)和pj404(ampr)中通過基因合成而商購(gòu)獲得。插入到pjexpress411載體中的ctx-m16的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于seqid16，并且插入到pj404載體中的aac的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于seqid12。然后，通過使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)和如表11所示的構(gòu)成蛋白質(zhì)接頭(在該實(shí)施例中為hhhhhh)的部分互補(bǔ)引物的pcr(95℃30秒-25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒-tm℃45秒-72℃1分鐘]-72℃5分鐘-4℃)來擴(kuò)增這些序列。使用tm為62℃的6h-ctx-f和t7r引物對(duì)來擴(kuò)增ctx-m16。使用tm為50℃的aac-f_coli和aac-6h-r引物對(duì)來擴(kuò)增acc。接頭hhhhhh的組成序列在表11中以粗體示出并且加有下劃線。表11.用于構(gòu)建和測(cè)序具有多聚組氨酸接頭的aac-h6-ctxm16雜合蛋白的引物的列表。將由此獲得的兩種pcr片段在62℃的tm下雜交，并使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)在沒有引物下在5個(gè)pcr循環(huán)(95℃30秒一62℃45秒一72℃2分15)內(nèi)使其互補(bǔ)。在添加外部引物(aac-f_coli+t7r)之后再擴(kuò)增編碼雜合蛋白的全序列。通過pcr進(jìn)行融合的這一實(shí)施方案示意性地示于圖3中。將編碼aac、ctxm16和融合體aac-6h-ctxm16的插入片段上樣在1％瓊脂糖凝膠上以示出其相應(yīng)大小(圖10)。根據(jù)圖7中示出的原理用ndei和hindiii限制性酶將由此產(chǎn)生的aac-6h-ctxm16融合體克隆在pet26b+載體(大腸桿菌表達(dá))中。在兩個(gè)方向上驗(yàn)證雜合構(gòu)建體的序列并且其對(duì)應(yīng)于所描述的融合體。在lb培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl10g/l，ph＝7.5)上通過維持100μg/ml氨芐西林(euromedex)和50μg/ml卡那霉素(euromedex)的選擇壓力來將表達(dá)aac的pj404-aac表達(dá)載體和表達(dá)aac-h6-ctxm16融合體的pet-aac-6h-ctxm16轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)plyss中。aac以及aac-6h-ctx融合體在大腸桿菌中從pj404載體的表達(dá)產(chǎn)生目的蛋白的包涵體。對(duì)于每種蛋白質(zhì)，從飽和的預(yù)培養(yǎng)物以1/40接種1l的lb，然后在37℃下在以200rpm攪拌下培養(yǎng)直到od(600nm)為約0.4至0.6。通過添加終濃度為0.5mm最終iptg在37℃和200rpm下誘導(dǎo)培養(yǎng)物。在產(chǎn)生結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞離心，并將沉淀物以40ml/l的培養(yǎng)物在裂解緩沖液(10mmtris-hcl、150mmnacl、1mmedta、0.1％tritonx100ph＝8.0和0.25mg/ml溶菌酶)中進(jìn)行處理，然后在-80℃下冷凍。將細(xì)胞解凍并在環(huán)境溫度下在mgso4(20mm)和dna酶(10μg/ml)存在下裂解45分鐘。將裂解物離心(在4℃下以12，000×g進(jìn)行30分鐘)并將包含目的蛋白(aac和aac-6h-ctxm16)的包涵體的沉淀物在緩沖液a(10mm磷酸鹽、150mmnacl、10mm咪唑、8m脲，ph＝8.0)中進(jìn)行處理。通過鎳親和色譜來純化蛋白質(zhì)并用緩沖液b(10mm磷酸鹽、150mmnacl、500mm咪唑、8m脲，ph＝8.0)的梯度洗脫。將包含目的蛋白的級(jí)分混合，在4℃下在1mmdtt存在下孵育1小時(shí)，然后在10mm磷酸鹽緩沖液(150mmnacl，ph＝8)中通過連續(xù)3次透析來復(fù)性。通過離心使蛋白質(zhì)澄清，然后通過10kda膜(centricon，millipore)進(jìn)行超濾來將其濃縮至不超過10ml的體積。將蛋白質(zhì)進(jìn)樣到尺寸排阻色譜柱(superdexg200；柱26＊60gehealthcare)上并在10mm磷酸鹽緩沖液(150mmnacl，ph＝8.0)中以1ml/分鐘的流量通過1ml級(jí)分洗脫。將對(duì)頭孢硝噻吩具有最高活性(vwr)且純度最佳(sds-page)級(jí)分合并，并濃縮至約0.5mg/ml。通過bca(pierce)、280nm下的吸光度和在sds-page凝膠上驗(yàn)證來測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)含量。圖11示出了所得的經(jīng)純化蛋白質(zhì)的結(jié)果。對(duì)不同的抗生素測(cè)試經(jīng)純化的蛋白質(zhì)：β-內(nèi)酰胺類的頭孢曲松(roche)和氨基糖苷類的卡那霉素。在25ml的反應(yīng)體積中在ph-stat(titrino2.5，metrohm)下在37℃和ph＝7.0下進(jìn)行對(duì)頭孢曲松的測(cè)定。在0.3mmtris緩沖液(150mmnacl)中以4g/l制備底物。β-內(nèi)酰胺核心的酶水解釋放酸并且導(dǎo)致ph下降。測(cè)定的原理是通過添加0.1n氫氧化鈉來補(bǔ)償酸化以維持在ph＝7.0。在這些條件下，1單位對(duì)應(yīng)于每分鐘添加1μmol氫氧化鈉，即每分鐘水解1μmolβ-內(nèi)酰胺。用乙酰-coa(sigma-aldrich)作為乙?；w，用卡那霉素作為受體，并用elleman試劑(dtnb，sigma-aldrich)滴定在酶反應(yīng)期間釋放的輔酶a還原(-sh)分子通過間接比色測(cè)定來測(cè)量乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性[參考]。在微量滴定板上用提高量的經(jīng)純化酶在200μl的終體積中并以500μm卡那霉素、500μm乙酰coa和250μmdtnb的濃度進(jìn)行反應(yīng)。在這些試驗(yàn)條件下，tnb2-離子在412nm下以ε(λ＝412nm)表觀19000m-1.孔-1(96孔板的孔填充有200μl)吸收，并且1單位對(duì)應(yīng)于在37℃下每分鐘釋放1納摩爾tnb2-。下表12總結(jié)了測(cè)量的每種蛋白質(zhì)對(duì)三種底物的比活性(6次實(shí)驗(yàn)的平均值，即n＝6)。表12.雜合蛋白aac-h6-ctx-m16及其組成酶的比活性這些結(jié)果表明，aac-6’-lb-cr與ctx-m16之間的融合產(chǎn)生能夠水解第三代頭孢菌素類并且通過乙酰化使氨基糖苷失活的雜合蛋白。沒有已知的天然酶能夠使屬于這兩個(gè)類別的抗生素失活。實(shí)施例6：由ereb和tem36通過標(biāo)簽多聚組氨酸型接頭的融合體組成的非糖基化雜合蛋白分子編碼tem-36(seqid1)和ereb(seqid5)的序列在大腸桿菌的表達(dá)載體中通過基因合成而商購(gòu)獲得。然后，將基因片段ndei/hindiii亞克隆在pet-26b(+)載體(invitrogen)中。根據(jù)圖3描述的原理，我們通過重疊pcr產(chǎn)生了ereb-h6-tem36雜合蛋白分子。通過使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)和構(gòu)成性蛋白質(zhì)接頭(在該實(shí)施例中為6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽)的部分互補(bǔ)引物的pcr(95℃30秒-25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒-tm℃45秒-72℃1分鐘]-72℃5分鐘-4℃)來擴(kuò)增tem-36和ereb的核苷酸序列。在65℃的tm下使用ereb6htem36_coli_f和t7_r引物對(duì)來擴(kuò)增tem-36。在65℃的tm下使用ereb_coli_f和ereb6htem36_r引物對(duì)來擴(kuò)增ereb。接頭hhhhhh的組成序列在表13中以粗體示出并且加有下劃線。表13.用于構(gòu)建和測(cè)序ereb-h6-tem-36雜合蛋白的引物的列表將由此獲得的pcr片段在55℃的tm下雜交，并使用高保真dna聚合酶(pfu，promega)在沒有引物下在5個(gè)pcr循環(huán)(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)內(nèi)使其互補(bǔ)。在添加外部引物(ereb_coli_f+t7-r)之后在55℃的tm下再擴(kuò)增編碼雜合蛋白的全序列。用ndei和hindiii酶限制性位點(diǎn)將由此產(chǎn)生的ereb-h6-tem36融合體克隆在pet26b+載體(在大腸桿菌中表達(dá))中(圖7)。在兩個(gè)方向上驗(yàn)證雜合構(gòu)建體的序列。圖12總結(jié)了用t7-f和t7-r引物對(duì)pet-tem36、ereb和ereb-h6-tem36系列獲得的pcr片段。在lb培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl10g/l，ph＝7)上在維持50μg/ml卡那霉素(euromedex)選擇壓力的同時(shí)在大腸桿菌dh10b中擴(kuò)增表達(dá)tem-36(seqid1)、ereb(seqid2)和融合體ereb-h6-tem36的pet-26b(+)表達(dá)載體。通過熱休克用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株bl21(de3)plyss。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在包含50μg/ml卡那霉素的lb-瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl10g/l、瓊脂15g/l，ph＝7)上。通過測(cè)量表達(dá)菌株對(duì)不同β-內(nèi)酰胺型抗生素(阿莫西林和augmentin)和大環(huán)內(nèi)酯型抗生素(紅霉素)的抗性來評(píng)價(jià)目的蛋白(tem36、ereb和融合體ereb-h6-tem36)在大腸桿菌中的功能性。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(表達(dá)tem36、ereb或ereb-h6-tem36)或空載菌株(bl21(de3)plyss)放入5mllb+50μg/ml卡那霉素中的培養(yǎng)物中，當(dāng)需要時(shí)在37℃下在以200rpm攪拌下，直到飽和。然后，將預(yù)接種物以1/40接種在5mllb+50μg/ml卡那霉素培養(yǎng)基中，并當(dāng)od600nm的值達(dá)到0.6時(shí)(約2小時(shí))，通過添加1mm最終iptg來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，并在37℃在以200rpm攪拌下繼續(xù)進(jìn)行1.5小時(shí)。將細(xì)胞相對(duì)于108cfu/ml歸一化并級(jí)聯(lián)稀釋至107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml，并將5μl的每種懸浮液置于包含提高濃度的抗生素的lb-瓊脂皿上(阿莫西林0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml、2048μg/ml；augmenting0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml；和紅霉素0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml)。將皿在37℃下孵育過夜，并在第二天記錄結(jié)果。mic對(duì)應(yīng)于最高接種物不再生長(zhǎng)下的最低抗生素濃度。數(shù)據(jù)在下表14中提供。表14.β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)表達(dá)ereb-h6-tem36雜合蛋白分子及其組成酶的大腸桿菌菌株的mic。如實(shí)施例6所述的表達(dá)雜合蛋白分子的大腸桿菌細(xì)胞顯示出針對(duì)氨基青霉素類(在例如克拉維酸的抑制劑存在或不存在下)和大環(huán)內(nèi)酯類(例如紅霉素)的多重抗藥性表型。到目前為止，在文獻(xiàn)中還沒有描述有天然細(xì)菌菌株具有這樣的由單蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生的表型。參考文獻(xiàn)aires，j.r.，t.kohler，h.nikaidoandp.plesiat(1999).″involvementofanactiveeffluxsysteminthenaturalresistanceofpseudomonasaeruginosatoaminoglycosides.″antimicrobagentschemother43(11)：2624-2628.ambler，r.p.(1975).″theaminoacidsequenceofstaphylococcusaureuspenicillinase.″biochemj151(2)：197-218.ambler，r.p.(1980).″thestructureofbeta-lactamases.″philostransrsoclondbbiolsci289(1036)：321-331.anand，a.，b.bashey，t.miranda.e.glatt(1994).″e(cuò)pidemiology，clinicalmanifestations，andoutcomeofclostridiumdifficile-associateddiarrhea.″amjgastroenterol89(4)：519-523.arthur，m.，d.autissierandp.courvalin(1986).″analysisofthenucleotidesequenceoftheerebgeneencodingtheerythromycinesterasetypeii.″nucleicacidsres14(12)：4987-4999.bartlett，j.g.(1996).″managementofclostridiumdifficileinfectionandotherantibiotic-associateddiarrhoeas.″e(cuò)urjgastroenterolhepatol8(11)：1054-1061.bonnet，r.(2004).″growinggroupofextended-spectrumbeta-lactamases：thectx-menzymes.″antimicrobagentschemother48(1)：1-14.bonnet，r.，c.dutour，j.l.sampaio，c.chanal，d.sirot，r.labia，c.dechampsandj.sirot(2001).″novelcefotaximase(ctx-m-16)withincreasedcatalyticefficiencyduetosubstitutionasp-240-->gly.″antimicrobagentschemother45(8)：2269-2275.bozdogan，b.，l.berrezouga，m.s.kuo，d.a.yurek，k.a.farley，b.j.stockmanandr.leclercq(1999).″anewresistancegene，linb，conferringresistancetolincosamidesbynucleotidylationinenterococcusfaeciumhm1025.″antimicrobagentschemother43(4)：925-929.bush，k.andg.jacoby(1997).″nomenclatureoftembeta-lactamases.″jantimicrobchemother39(1)：1-3.chaibi，e.b.，d.sirot，g.paulandr.labia(1999).″inhibitor-resistanttembeta-lactamases：phenotypic，geneticandbiochemicalcharacteristics.″jantimicrobchemother43(4)：447-458.chen，f.，s.nielsenandr.zenobi(2013).″understandingchemicalreactivityforhomo-andheterobifunctionalproteincross-linkingagents.″jmassspectrom48(7)：807-812.chen，x.，j.l.zaroandw.c.shen(2013).″fusionproteinlinkers：property，designandfunctionality.″advdrugdelivrev65(10)：1357-1369.chopra，i.andm.roberts(2001).″tetracyclineantibiotics：modeofaction，applications，molecularbiology，andepidemiologyofbacterialresistance.″microbiolmolbiolrev65(2)：232-260；secondpage，tableofcontents.committeeondruguseinfoodanimals(1999).theuseofdrugsinfoodanimals，benefitsandrisks.washington，d.c.，nationalacademypress.deshpande，a.，v.pasupuleti，p.thota，c.pant，d.d.rolston，t.j.sferra，a.v.hernandezandc.j.donskey(2013).″community-associatedclostridiumdifficileinfectionandantibiotics：ameta-analysis.″jantimicrobchemother68(9)：1951-1961.doi，y.andy.arakawa(2007).″16sribosomalrnamethylation：emergingresistancemechanismagainstaminoglycosides.″clininfectdis45(1)：88-94.drawz，s.m.andr.a.bonomo(2010).″threedecadesofbeta-lactamaseinhibitors.″clinmicrobiolrev23(1)：160-201.ecdc/emeajointworkinggroup(2009).thebacterialchallenge：timetoreact″.estimatesbasedonbacteriamostfrequentlyisolatedfrombloodculturesineurope.e.e.j.t.report.fancy，d.a.andt.kodadek(1999).″chemistryfortheanalysisofprotein-proteininteractions：rapidandefficientcross-linkingtriggeredbylongwavelengthlight.″procnatlacadsciusa96(11)：6020-6024.georgetownuniversitycenterforfoodandnutritionpolicy(1999).antibioticuseinanimals：foodsafetyandriskassessment，washington，d.c.gerding，d.n.(1989).″diseaseassociatedwithclostridiumdifficileinfection.″anninternmed110(4)：255-257.gilbert，d.n.(1994).″aspectsofthesafetyprofileoforalantibacterialagents.″infectiousdiseasesinclinicalpractice3(4)：236-245.gorkiewicz，g.(2009).″nosocomialandantibiotic-associateddiarrhoeacausedbyorganismsotherthanclostridiumdifficile.″intjantimicrobagents33suppl1：s37-41.hancock，r.e.(1981).″aminoglycosideuptakeandmodeofaction--withspecialreferencetostreptomycinandgentamicin.i.antagonistsandmutants.″jantimicrobchemother8(4)：249-276.harmoinen，j.，s.mentula，m.heikkila，m.vanderrest，p.j.rajala-schultz，c.j.donskey，r.frias，p.koski，n.wickstrand，h.jousimies-somer，e.westermarckandk.lindevall(2004).″orallyadministeredtargetedrecombinantbeta-lactamasepreventsampicillin-inducedselectivepressureonthegutmicrobiota：anovelapproachtoreducingantimicrobialresistance.″antimicrobagentschemother48(1)：75-79.harmoinen，j.，k.vaali，p.koski，k.syrjanen，o.laitinen，k.lindevallande.westermarck(2003).″e(cuò)nzymaticdegradationofabeta-lactamantibiotic，ampicillin，inthegut：anoveltreatmentmodality.″jantimicrobchemother51(2)：361-365.henquell，c.，c.chanal，d.sirot，r.labiaandj.sirot(1995).″molecularcharacterizationofninedifferenttypesofmutantsamong107inhibitor-resistanttembeta-lactamasesfromclinicalisolatesofescherichiacoli.″antimicrobagentschemother39(2)：427-430.herzberg，o.andj.moult(1987).″bacterialresistancetobeta-lactamantibiotics：crystalstructureofbeta-lactamasefromstaphylococcusaureuspc1at2.5aresolution.″science236(4802)：694-701.hogenauer，c.，h.f.hammer，g.j.krejsande.c.reisinger(1998).″mechanismsandmanagementofantibiotic-associateddiarrhea.″clininfectdis27(4)：702-710.instituteofmedicine，d.o.h.p.a.d.p.(1998).reportofastudy.humanhealthriskswiththesubtherapeuticuseofpenicillinortetracyclinesinanimalfeed.washington，d.c.，nationalacademypress.kelly，c.p.，c.pothoulakisandj.t.lamont(1994).″clostridiumdifficilecolitis.″nengljmed330(4)：257-262.kemal，c.andj.r.knowles(1981).″penicillanicacidsulfone：interactionwithrtembeta-lactamasefromescherichiacoilatdifferentphvalues.″biochemistry20(13)：3688-3695.klevens，r.m.，j.r.edwards，c.l.richards，jr.，t.c.horan，r.p.gaynes，d.a.pollockandd.m.cardo(2007).″e(cuò)stimatinghealthcare-associatedinfectionsanddeathsinu.s.hospitals，2002.″publichealthrep122(2)：160-166.knott-hunziker，v.，s.g.waley，b.s.orlekandp.g.sammes(1979).″penicillinaseactivesites：labellingofserine-44inbeta-lactamaseiby6beta-bromopenicillanicacid.″febslett99(1)：59-61.larkin，m.a.，g.blackshields，n.p.brown，r.chenna，p.a.mcgettigan，h.mcwilliam，f.valentin，i.m.wallace，a.wilm，r.lopez，j.d.thompson，t.j.gibsonandd.g.higgins(2007).″clustalwandclustalxversion2.0.″bioinformatics23(21)：2947-2948.leclercq，r.，a.brisson-noel，j.duvalandp.courvalin(1987).″phenotypicexpressionandgeneticheterogeneityoflincosamideinactivationinstaphylococcusspp.″antimicrobagentschemother31(12)：1887-1891.leroy，a.，g.humbert，g.oksenhendlerandj.p.fillastre(1978).″pharmacokineticsofaminoglycosidesinsubjectswithnormalandimpairedrenalfunction.″antibiotchemother(1971)25：163-180.lin，y.，j.m.pagel，d.axworthy，a.pantelias，n.hedinando.w.press(2006).″ageneticallyengineeredanti-cd45single-chainantibody-streptavidinfusionproteinforpretargetedradioimmunotherapyofhematologicmalignancies.″cancerres66(7)：3884-3892.mentula，s.，j.harmoinen，p.koski，e.westermarck，m.rautio，p.huovinenande.kononen(2004).″inhibitionofampicillin-inducedemergenceofresistanceinintestinalcoliformsbytargetedrecombinantbeta-lactamase.″intjantimicrobagents24(6)：555-561.morar，m.，k.pengelly，k.kotevaandg.d.wright(2012).″mechanismanddiversityoftheerythromycinesterasefamilyofenzymes.″biochemistry51(8)：1740-1751.morita，y.，k.kodama，s.shiota，t.mine，a.kataoka，t.mizushimaandt.tsuchiya(1998).″norm，aputativemultidrugeffluxprotein，ofvibrioparahaemolyticusanditshomologinescherichiacoli.″antimicrobagentschemother42(7)：1778-1782.novick，r.p.(1963).″analysisbytransductionofmutationsaffectingpenicillinaseformationinstaphylococcusaureus.″jgenmicrobiol33：121-136.ounissi，h.andp.courvalin(1985).″nucleotidesequenceofthegeneereaencodingtheerythromycinesteraseinescherichiacoli.″gene35(3)：271-278.pagel，j.m.，y.lin，n.hedin，a.pantelias，d.axworthy，d.stone，d.k.hamlin，d.s.wilburando.w.press(2006).″comparisonofatetravalentsingle-chainantibody-streptavidinfusionproteinandanantibody-streptavidinchemicalconjugateforpretargetedanti-cd20radioimmunotherapyofb-celllymphomas.″blood108(1)：328-336.paguirigan，a.l.andd.j.beebe(2007).″protocolforthefabricationofenzymaticallycrosslinkedgelatinmicrochannelsformicrofluidiccellculture.″natprotoc2(7)：1782-1788.poehlsgaard，j.ands.douthwaite(2005).″thebacterialribosomeasatargetforantibiotics.″natrevmicrobiol3(11)：870-881.ramirez，m.s.andm.e.tolmasky(2010).″aminoglycosidemodifyingenzymes.″drugresistupdat13(6)：151-171.richards，m.j.，j.r.edwards，d.h.culverandr.p.gaynes(2000).″nosocomialinfectionsincombinedmedical-surgicalintensivecareunitsintheunitedstates.″infectcontrolhospepidemiol21(8)：510-515.ripoll，a.，f.baquero，a.novais，m.j.rodriguez-dominguez，m.c.turrientes，r.cantonandj.c.galan(2011).″invitroselectionofvariantsresistanttobeta-lactamsplusbeta-lactamaseinhibitorsinctx-mbeta-lactamases：predictingtheinvivoscenario？″antimicrobagentschemother55(10)：4530-4536.roberts，m.c.(2008).″updateonmacrolide-lincosamide-streptogramin，ketolide，andoxazolidinoneresistancegenes.″femsmicrobiollett282(2)：147-159.roberts，m.c.，j.sutcliffe，p.courvalin，l.b.jensen，j.roodandh.seppala(1999).″nomenclatureformacrolideandmacrolide-lincosamide-streptograminbresistancedeterminants.″antimicrobagentschemother43(12)：2823-2830.robicsek，a.，g.a.jacobyandd.c.hooper(2006).″theworldwideemergenceofplasmid-mediatedquinoloneresistance.″lancetinfectdis6(10)：629-640.robicsek，a.，j.strahilevitz，g.a.jacoby，m.macielag，d.abbanat，c.h.park，k.bushandd.c.hooper(2006).″fluoroquinolone-modifyingenzyme：anewadaptationofacommonaminoglycosideacetyltransferase.″natmed12(1)：83-88.salverda，m.l.，j.a.devisserandm.barlow(2010).″naturalevolutionoftem-1beta-lactamase：experimentalreconstructionandclinicalrelevance.″femsmicrobiolrev34(6)：1015-1036.schlegel，s.，e.rujas，a.j.ytterberg，r.a.zubarev，j.luirinkandj.w.degier(2013).″optimizingheterologousproteinproductionintheperiplasmofe.colibyregulatinggeneexpressionlevels.″microbcellfact12：24.schultz，j.，y.lin，j.sanderson，y.zuo，d.stone，r.mallett，s.wilbertandd.axworthy(2000).″atetravalentsingle-chainantibody-streptavidinfusionproteinforpretargetedlymphomatherapy.″cancerres60(23)：6663-6669.shaw，k.j.，p.n.rather，r.s.hareandg.h.miller(1993).″moleculargeneticsofaminoglycosideresistancegenesandfamilialrelationshipsoftheaminoglycoside-modifyingenzymes.″microbiolrev57(1)：138-163.sherry，l.，b.murphy，j.xu.andk.d.kochanek(2012).deaths：preliminarydatafor2010.nationalvitalstatisticsreports.60：1-69.slimings，c.andt.v.riley(2013).″antibioticsandhospital-acquiredclostridiumdifficileinfection：updateofsystematicreviewandmeta-analysis.″jantimicrobchemother.sparks，s.g.，r.j.carman，m.r.sarkerandb.a.mcclane(2001).″genotypingofenterotoxigenicclostridiumperfringensfecalisolatesassociatedwithantibiotic-associateddiarrheaandfoodpoisoninginnorthamerica.″jclinmicrobiol39(3)：883-888.speer，b.s.，l.bedzykanda.a.salyers(1991).″e(cuò)videncethatanoveltetracyclineresistancegenefoundontwobacteroidestransposonsencodesannadp-requiringoxidoreductase.″jbacteriol173(1)：176-183.stiefel，u.，n.j.pultz，j.harmoinen，p.koski，k.lindevall，m.s.helfandandc.j.donskey(2003).″oraladministrationofbeta-lactamasepreservescolonizationresistanceofpiperacillin-treatedmice.″jinfectdis188(10)：1605-1609.tarkkanen，a.m.，t.heinonen，r.jogi，s.mentula，m.e.vanderrest，c.j.donskey，t.kemppainen，k.gurbanovandc.e.nord(2009).″p1arecombinantbeta-lactamasepreventsemergenceofantimicrobialresistanceingutmicrofloraofhealthysubjectsduringintravenousadministrationofampicillin.″antimicrobagentschemother53(6)：2455-2462.tenson，t.，m.lovmarandm.ehrenberg(2003).″themechanismofactionofmacrolides，lincosamidesandstreptograminbrevealsthenascentpeptideexitpathintheribosome.″jmolbiol330(5)：1005-1014.thompson，j.d.，d.g.higginsandt.j.gibson(1994).″clustalw：improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting，position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.″nucleicacidsres22(22)：4673-4680.tu，d.，g.blaha，p.b.mooreandt.a.steitz(2005).″structuresofmlsbkantibioticsboundtomutatedlargeribosomalsubunitsprovideastructuralexplanationforresistance.″cell121(2)：257-270.turner，p.j.(2005).″e(cuò)xtended-spectrumβ-lactamases.″clinicalinfectiousdiseases41(supplement4)：s273-s275.vardakas，k.z.，a.a.konstantelias，g.loizidis，p.i.rafailidisandm.e.falagas(2012).″riskfactorsfordevelopmentofclostridiumdifficileinfectionduetobi/nap1/027strain：ameta-analysis.″intjinfectdis16(11)：e768-773.walsh，c.(2000).″molecularmechanismsthatconferantibacterialdrugresistance.″nature406(6797)：775-781.weisblum，b.(1995).″e(cuò)rythromycinresistancebyribosomemodification.″antimicrobagentschemother39(3)：577-585.wistrom，j.，s.r.norrby，e.b.myhre，s.eriksson，g.granstrom，l.lagergren，g.englund，c.e.nordandb.svenungsson(2001).″frequencyofantibiotic-associateddiarrhoeain2462antibiotic-treatedhospitalizedpatients：aprospectivestudy.″jantimicrobchemother47(1)：43-50.zhou，x.y.，f.bordon，d.sirot，m.d.kitzisandl.gutmann(1994).″e(cuò)mergenceofclinicalisolatesofescherichiacoliproducingtem-1derivativesoranoxa-1beta-lactamaseconferringresistancetobeta-lactamaseinhibitors.″antimicrobagentschemother38(5)：1085-1089.當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12