豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白及其應(yīng)用，尤其涉及豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白作為豬囊尾蚴病檢測(cè)抗原的應(yīng)用和豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白在制備豬囊尾蚴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白能夠特異性診斷豬囊尾蚴病，而與豬細(xì)頸囊尾蚴、旋毛蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)病無(wú)任何交叉反應(yīng)。
【專利說(shuō)明】
豬帶練蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及豬帶緣蟲(chóng)TsSe巧in B6重組蛋白及其應(yīng)用，尤其設(shè)及TsSe巧in B6重組 蛋白作為豬囊尾蝴檢測(cè)抗原的應(yīng)用和TsSerpin B6重組蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 囊蟲(chóng)病(Cysticercosis)是由豬帶緣蟲(chóng)(Taenia solium)幼蟲(chóng)寄生在人和豬的皮 下、肌肉和腦等部位引起的一種食源性的人獸共患寄生蟲(chóng)病。該病不但對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大 經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅著食品安全和人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶抑制劑在蠕蟲(chóng)寄 生宿主免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要角色，病原體的絲氨酸蛋白酶抑制劑通過(guò)干擾宿主免疫調(diào)節(jié) 信號(hào)來(lái)抑制宿主免疫系統(tǒng)的激活。因此，研究豬帶緣蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑的免疫調(diào)節(jié)功 能，無(wú)疑將為闡明豬帶緣蟲(chóng)在感染宿主過(guò)程中的免疫逃避機(jī)制和探索新的診斷和疫苗抗原 具有指導(dǎo)意義。
[0003] 絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)是一類重要的結(jié)構(gòu)相似、功能多樣的球狀蛋白酶抑 制劑超家族，真核生物、細(xì)菌、病毒、古細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)存在Se巧in基因。Serpins參與很多重 要的生理活動(dòng)，例如信號(hào)傳導(dǎo)，血凝、纖維蛋白溶解、炎癥反應(yīng)W及補(bǔ)體激活等，在調(diào)節(jié)內(nèi)源 性蛋白酶和外源性蛋白酶中均發(fā)揮著重要作用。不僅如此，Se巧ins還在寄生蟲(chóng)入侵宿主過(guò) 程中也發(fā)揮著重要作用。寄生蠕蟲(chóng)的Serpins通過(guò)抑制宿主絲氨酸蛋白酶活性，使其免受宿 主體內(nèi)蛋白水解酶類的降解，從而逃避宿主的免疫攻擊。已有研究表明，從咖蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)等寄 生蟲(chóng)分離的絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制膜蛋白酶、糜蛋白酶等腸道消化酶活性。埃及血吸 蟲(chóng)通過(guò)蟲(chóng)體表面絲氨酸蛋白酶抑制劑因子與人的膜蛋白酶相結(jié)合來(lái)降低自身的免疫原性， 從而逃脫宿主的免疫攻擊。Mercke化ach等在多房棘球緣蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)原核表達(dá)的絲氨酸蛋白 酶抑制劑能抑制膜蛋白酶，糜蛋白酶及彈性蛋白酶活性，推測(cè)多房棘球緣蟲(chóng)能夠抵抗宿主 腸道消化酶對(duì)蟲(chóng)體的損傷，W此逃避宿主的免疫攻擊。因此，Serpin有望成為重要的疫苗和 診斷抗原候選分子。開(kāi)展豬帶緣蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑的相關(guān)研究將有助于闡明豬帶緣蟲(chóng) 免疫逃避機(jī)制，為研發(fā)新型疫苗、診斷制劑和藥物提供理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有豬囊尾蝴病診斷技術(shù)中存在的交叉反應(yīng)問(wèn)題，本發(fā)明提供了豬帶緣 蟲(chóng)TsSe巧in B6重組蛋白及其應(yīng)用，尤其設(shè)及TsSe巧in B6重組蛋白作為豬帶緣蟲(chóng)/囊尾蝴 檢測(cè)抗原的應(yīng)用和TsSerpin B6重組蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供豬帶緣蟲(chóng)TsSe巧in B6重組蛋白，所述豬帶緣蟲(chóng)TsSe巧in B6重組蛋白 的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0006] 本發(fā)明還提供豬帶緣蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白作為豬帶緣蟲(chóng)/囊尾蝴檢測(cè)抗原的 應(yīng)用;所述豬帶緣蟲(chóng)TsSe巧in B6重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0007] 本發(fā)明還提供豬帶緣蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒中的 應(yīng)用;所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0008] 本發(fā)明還提供一種豬囊尾蝴病化ISA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包被抗原為豬帶 緣蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0009] 作為優(yōu)選，所述試劑盒中還包括HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG。
[0010] 本發(fā)明還提供一種豬帶緣蟲(chóng)化ISA檢測(cè)方法，所述方法不W專利法規(guī)定的疾病的 診斷和治療為目的，W純化的TsSe巧in B6重組蛋白化g于37°C包被酶標(biāo)反應(yīng)板化，封閉液 為1 % BSA，用PBST充分洗涂后分別加入待測(cè)樣品和豬陰性血清，37 °C解育Ih，PBST洗涂S次 后，加入1: 5000倍稀釋的皿P標(biāo)記的兔抗豬IgG，充分洗涂后再加入DAB顯色，用濃硫酸終止 反應(yīng)后測(cè)定吸光度，P(陽(yáng)性VN(陰性)〉2時(shí)，為陽(yáng)性血清，反之，為陰性血清。
[0011] 本發(fā)明利用豬帶緣蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)TsSerpin B6特異引物，W豬囊尾 蝴總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增TsSe巧in B6基因，并通過(guò)生物信息學(xué)分析進(jìn)行鑒定。構(gòu)建祀T- 30a-TsSerpin B6重組表達(dá)載體，在大腸桿菌化2UDE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。純化的目的蛋白 進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析。結(jié)果為：TsSe巧in B6的ORF由1131個(gè)核巧酸組成， 編碼376個(gè)氨基酸殘基；其編碼氨基酸具有Se巧ins較為保守的反應(yīng)中屯、環(huán)(R化)和特征性 結(jié)構(gòu)域，并且存在9個(gè)潛在的線性B淋己細(xì)胞抗原表位。TsSe巧in B6的表達(dá)產(chǎn)物主要W包涵 體形式存在，且可與豬囊尾蝴陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，在53kDa處產(chǎn)生特異條帶。W純化的 TsSe巧in B6重組蛋白化g作為間接化ISA的診斷抗原，可特異性檢測(cè)豬囊尾蝴陽(yáng)性血清，而 與豬細(xì)頸囊尾蝴、豬旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)無(wú)任何交叉反應(yīng)。結(jié)論：所克隆的片段即為TsSerpin B6,其表達(dá)產(chǎn)物可作為豬囊尾蝴病化ISA診斷的特異性抗原。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[OOU]圖1為豬囊尾蝴的SerpinBS基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中，M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.SerpinB6;
[0014] 圖2為TsSe巧in B6的S級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；
[0015] 圖3為TsSerpin B6部分序列與其他寄生蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列對(duì)比；
[0016] 圖4為不同物種Se巧ins的系統(tǒng)進(jìn)化分析；
[0017]圖5為TsSe巧in B6融合蛋白純化結(jié)果；其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；l:50mM咪 挫；2:200mM咪挫；3:300mM咪挫；4:400mM咪挫；5: SOOmM咪挫；
[001引圖6為TsSe;rpin B6融合蛋白Western-blotting結(jié)果，其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)；1:豬陰性血清;2:豬陽(yáng)性血清。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市 售。
[0020] 實(shí)施例1
[0021 ] 1材料與方法
[0022] 1.1蟲(chóng)株與血清
[0023] 豬囊尾蝴、豬囊尾蝴陽(yáng)性和陰性血清均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所蠕蟲(chóng)病 課題組保存。
[0024] 1.2 試劑
[00巧]質(zhì)粒小量提取試劑盒、TRIzol Reagent、DNA膠回收試劑盒、pMD-T-19(simple) Vector、限制性內(nèi)切酶Ba恤I、Hind III、T4DNA連接酶、均購(gòu)自Takara公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、Prestained Protein Ladder均購(gòu)自Hiermo公 司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pET-30a、異丙基-e-D-硫代半乳糖巧（IPTG)、X-Gal、5 X蛋白上樣 緩沖液均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗豬IgG(HRP)購(gòu)自Sigma公司；Ni S巧harose 6化St Flow蛋白純化試劑盒購(gòu)自GE公司。
[0026] 1.3總RNA的提取及CDNA合成
[0027] 用TRIzol法提取豬帶緣蟲(chóng)囊尾蝴的總RNA，WReve;rt Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。
[002引1.4引物設(shè)計(jì)合成
[0029] 根據(jù)本課題組完成的豬帶緣蟲(chóng)全基因組測(cè)序注釋信息及轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合 GeneDB數(shù)據(jù)庫(kù)公布的豬帶緣蟲(chóng)SerpinBG的開(kāi)放閱讀框序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì) 特異性引物，上游引物加入B a m H I酶切位點(diǎn)，其序列為：5 ' - CGCGGATCCATGCTAGATGAATATTACTTTAATCACC-3' ;下游引物加入Hind III酶切位點(diǎn)，其序列 為：5 ' -CCCAAGCTTGGCAGGCCAGGGGAITGAC-3 '。引物送至江蘇金唯智生物技術(shù)有限公司合成。
[0030] 1.5基因克隆和轉(zhuǎn)化
[0031] W反轉(zhuǎn)錄的CDNA為模板，用TsSerpin B6基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體 系為：cDNA 0.5XPS Buffer IOiiUdNTP Mix 化L，上下游引物各化UEasy Taq酶化L， 補(bǔ)水至50化。PCR擴(kuò)增程序如下：951：5111111;941：4〇3,671：4〇3,72°(：1111111，30個(gè)循環(huán)；721： IOmiriDPCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-T-19simple載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞。選擇單 克隆菌株進(jìn)行PCR和酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送江蘇金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。該擴(kuò)增產(chǎn)物 的核巧酸序列為：
[0032] ATGCTAGATGAATATTACTTTAATCACCTGGTACTGTTCCCTCGAGGCTCGAAAAAAAACTGCTTCGTC TCACCACTGAGCATTTACTGCGGCTTGTCTTTGGCCCTCTCTGGGAGCTCCGGCAGATCACTTCATGAGATCGCTCA GGTCTTGCAGGTTCCTAAGCAGCAATTCAAGGATTACGACAGCATTTTAGCACATTTGGGTAGTCATCTGGATGCTG TTTCTGATGGAGATACCGGCAAAACCTTGGTTCTGGCAAACGGCCTTTTTTTGGAATCCACCATCGAGGTTAAGCAG CTCTTTAAAAAAGCCCTAGAAAAGCATTTCCATACAGATTTACATATGGTCGATTTCGCGTCAAACGCTGAGAAGGC CAGAAAGCAAATCAACGCCTGGGTCTCTGATCACACCTGCAAGAAGATCTCCGACCTCATGACTCGTGAATCCATCG ACAGTCAAACCCGCCTCGTTTTGGCTAATGCAATTTACTTTAAAGGTACTTGGAAGAATGTGTTTCACCGCGACGCA ACAACGGATTGGCCTTTTCAAACCCTTCATGACGGAGAGGTTCAGGTTCCAATGATGAATGACAATGGGGTCTATGA GATGTCTCGTTTCGATGAACTTAGCGCAACGGCACTAAAGATTCCCTTTAAATTCCATGAGATGCTTATCGTGTTAC CCGACGCAAAAGACGGTTTGATGGAGTTGTTGGAAAAGATATTCGACCCCAACCACATTTTGCGCTTCAAGGAGCTC TTCGACAAGAGCAAATACGACCCGAGCAGAGTGGAACTGCATCTACCCAAATTCAAACTTGGGGGTGTTGAAAGCCT GAATATGGAGAAACCGCTGTCTGCTATGGGTCTGGAGACTGTTTTTAACCATGATCACGCTGATTTCTCCCGCATTA CCAAGAAGGAAAAGTTGCACATCTCGAGTGTGGTTCATCAGGCTGTGATTGAGGTTAATGAGGAAGGAGCGGAGGCA GCAGCAGCAACTGGAATGGCCATTGCGCCCATGTGTCTGTGCCCAGATTTTACCGTAGATCATCCCTTTCTGTTCTT TATTGTCACCGAAACTGGTGTGCCCGCTTTCATAGGATATGTGGTCAATCCCCTGGCCTGA
[0033] 1.6 TsSe巧in B6基因的生物信息學(xué)分析
[0034] 利用在線軟件預(yù)測(cè)并分析蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、氨基酸組成、信號(hào)膚、二級(jí)和= 級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位、結(jié)構(gòu)域等。
[00巧]1.7 TsSe巧inB6蛋白的序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析
[0036] 用Bias巧軟件將TsSe巧inB6的氨基酸序列與GenBank中的其他物種氨基酸序列進(jìn) 行比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件中化St Maximum L化elihood Tree方法對(duì)選擇的序列構(gòu)建進(jìn)化 樹(shù)并分析。
[0037] 1.8重組表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)
[0038] 將鑒定正確的pMD19-T-TsSerpinB6及原核表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒分別用BamH 1+ 化O I進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收。利用T4DNA連 接酶將目的片段與祀T-30a連接，并轉(zhuǎn)化化2UDE3)感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒 定，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0039] 取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌液1:100接種于IOOmL LB(卡那抗性lOOmg/mL)液體培養(yǎng) 基中，37°C220r/min振蕩培養(yǎng)至菌液ODs日血m=0.6-l時(shí)，加入100化500mmol/L的IPTG，37°C 22化/min振蕩培養(yǎng)化。收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時(shí)設(shè)置誘導(dǎo)前和祀T-30a 轉(zhuǎn)化菌液的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照。
[0040] 1.9重組蛋白的純化及Western-blot分析
[0041 ] 取50mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，800化/min離屯、15min，棄上清，加等體積的PBS重懸菌體 沉淀后，反復(fù)凍融3次。利用超聲破碎儀處理菌體懸液20min，直至溶液澄清透亮。4°C， 1200化/min離屯、IOmin，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。利用儀NTA瓊脂糖凝膠FF 在不同咪挫梯度下對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白用豬囊尾蝴陽(yáng)性血清進(jìn)行Western- blotting 檢測(cè) 。該純化后的重組蛋 白的氨基酸序列為：
[0042] MLDEYYFNHLVLFPRGSKKNCFVSPLSIYCGLSLALSGSSGR 化肥 IAQVLQVPKQQFKDYDSILAHLGSHLDAVSD GDTGKTLVLANGLFLESTIEVKQLFKKALEKHFHTDLHMVDFASNAEKARKQINAWVSDHTCKKISDLMTRESIDSQ TRLVLANAIYFKGTWKNVFH 畑 ATTDWP 巧 TLHDGEVQVPMMNDNGVYEMSR 抑化 SATALIQPFKF 肥 MLIV …DA KDGLMELLEKI抑PNHILRFKELFDKSKYDPSRVEU1UKFKLGGVESLNMEKPLSAMGLETVFNHDHADFSRITKK 邸 UnSSVVHQAVKVNEEGAEAAAATGMAIAPMCLCPDFTVDHPFLFFIVTETGVPA門 GYVVNPLA*
[0043] 2 結(jié)果
[0044] 2.1 TsSe巧in B6基因的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析
[0045] W豬囊尾蝴的CDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得大小為113化P左右的片段，與預(yù)期 結(jié)果一致(圖1)。
[0046] 2.2豬帶緣蟲(chóng)TsSe巧in B6蛋白的生物信息學(xué)分析
[0047] TsSe巧in B6cDNA序列含有一個(gè)由113化P的開(kāi)放閱讀框，編碼由376個(gè)氨基酸殘基 組成的多膚，其理論分子質(zhì)量為42.3kDa。親水性分析表明，該蛋白為疏水性蛋白。 Predic巧rotein預(yù)測(cè)表明，在該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中a螺旋占35.37%，巧斤疊25.27%，其余部分 為無(wú)規(guī)卷曲。螺旋結(jié)構(gòu)和卷曲結(jié)構(gòu)散布在整個(gè)蛋白分子中，構(gòu)成了TsSerpin B6二級(jí)結(jié)構(gòu)的 基本骨架。綜合分析表明，TsSerpin B6蛋白的抗原表位可能主要位于氨基酸序列的第12~ 20、36~46、54~64、74~83、123~130、138~156、175~186、188~197、253~267位。 Motif Scan分析表明，TsSerpin B6可能存在1個(gè)潛在的cAMP和CGMP依賴性蛋白激酶憐酸化 位點(diǎn)、10個(gè)潛在的酪蛋白激酶憐酸化位點(diǎn)、5個(gè)潛在的N-豆違酷化位點(diǎn)、6個(gè)潛在的蛋白激酶 C憐酸化位點(diǎn)和1個(gè)潛在的酪氨酸蛋白激酶憐酸化位點(diǎn)。SMART分析顯示，TsSerpin B6氨基 酸序列中7-343位為TsSe巧in B6結(jié)構(gòu)域，具有Serpin蛋白的保守序列FXVDHP化FFI。 TsSerpin B6S級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白有13個(gè)a螺旋，15個(gè)0折疊，其余為無(wú)規(guī)卷曲（圖2)。 其中 3276111，328617,32941曰，3306111;34743口，348曲6,349化'，350￥曰1，35143口，352化3， 353Pro是絲氨酸蛋白酶抑制劑均含有較為保守的反應(yīng)中屯、環(huán)。
[004引2.3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析
[0049]通過(guò)同源序列相似性比較發(fā)現(xiàn)，TsSerpin B6與其他物種的Se巧ins擁有共同的活 性位點(diǎn)即Serpins反應(yīng)中屯、環(huán)(R化），具有絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員的特征性保守結(jié) 構(gòu):NAVYFKG 和DVNEEG (圖 3)。
[0化0] 在圖3中，紅色下劃線表示serpins特征性保守區(qū)序列，黑色方框表示serpins較為 保守的反應(yīng)中屯、環(huán)。SMSchi Stosoma haematobium)，Emu(Echinococcus multilocularis)，SjB6(S.japonicum)，Smpi56and Sm2(S.mansoni)，Cs(Clonor chissinensis)，Pw(Paragonimus westermani)，He(Haemon chuscontortus)，Tv (Trichostrong ylusvitrinus)，Bml曰nd Bm2(Brugi曰 m曰I曰yi)。
[0051] 利用MEGA 6.0軟件中Test Maximum Likelihood Tree方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 表明，TsSerpin B6與多房棘球緣蟲(chóng)的Serpin位于同一分支，親緣關(guān)系最近，而與其他物種 的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果如圖4?；⊿chi Stosoma haematobium) , EmiKEchinococcus multilocularis),SjB6(S.japonicum),Smpi56and Sm2(S.mansoni),Cs(Clonorchis sinensis),Pw(ParagonimuS westermani), He (Haemonchus contortus),Tv (TrichostrongyIus vitrinus),Bml曰nd Bm2(Brugi曰 m曰I曰yi)。
[0化2] 2.4重組菌株的表達(dá)與分析
[0化3] 重組質(zhì)粒pET-30a-TsSe巧inB6經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定均得到約113化P的片段，說(shuō) 明成功構(gòu)建了攜帶TsSe巧in B6基因的原核表達(dá)載體。用IPTG對(duì)祀T-30a-TsSe巧in B6重組 菌誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析，在預(yù)期的53kDa附近出現(xiàn)蛋白目的條帶，經(jīng)超聲破碎 后菌體SDS-PAGE分析結(jié)果表明，目的蛋白主要W包涵體形式存在。
[0化4] 2.5目的蛋白的Western-blot分析
[005日]8M尿素溶解包涵體沉淀，用Ni-NTA Purification System進(jìn)行純化。SDS-PAGE分 析表明，目的蛋白獲得較好的純化效果(結(jié)果如圖5)。^純化的TsSerpin B6重組蛋白為抗 原，進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果顯示，TsSerpin B6蛋白可與豬囊尾蝴陽(yáng)性血清特異性反 應(yīng)，說(shuō)明TsSerpin B6蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性（圖6)。
[0化6] 3討論
[0057]絲氨酸蛋白酶抑制劑呈現(xiàn)構(gòu)象多態(tài)性，功能多樣性，它們大多數(shù)都屬于非經(jīng)典類 Kazal抑制劑家族。絲氨酸蛋白酶抑制劑大多數(shù)為單鏈的糖蛋白，核屯、結(jié)構(gòu)含有8-9個(gè)a-螺 旋和3個(gè)0折疊，主要標(biāo)志性的結(jié)構(gòu)是較為保守的反應(yīng)中屯、環(huán)（reactive center loop , R化KR化結(jié)構(gòu)是絲氨酸蛋白酶識(shí)別絲氨酸蛋白酶抑制的祀點(diǎn)，當(dāng)RCL被絲氨酸蛋白酶識(shí)別 并被切開(kāi)后，絲氨酸蛋白酶抑制劑的構(gòu)象發(fā)生改變，從而引起絲氨酸蛋白酶的構(gòu)象也發(fā)生 改變，導(dǎo)致酶的活性中屯、破壞，發(fā)揮抑制作用。同源序列比對(duì)顯示，TsSerpin B6具有絲氨酸 蛋白酶抑制劑超家族成員的特征性保守結(jié)構(gòu):NAVYFKG和DVNEEG。系統(tǒng)進(jìn)行分析也表明所獲 得的序列與棘球緣蟲(chóng)Serp i n親緣關(guān)系較近，說(shuō)明本發(fā)明獲得的序列即為豬帶緣蟲(chóng)Serp i n B6基因。
[005引本發(fā)明利用生物信息學(xué)分析對(duì)TsSerpin B6蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，表明該蛋白N端不含信 號(hào)膚序列，可能為非分泌型蛋白。已有研究表明，Serpin基因家族成員既可胞內(nèi)表達(dá)，也可 分泌到胞外。但僅僅根據(jù)TsSerpin B6缺乏信號(hào)膚序列就判定其為非分泌性蛋白可能不太 準(zhǔn)確。因?yàn)橐延醒芯勘砻?，緣蟲(chóng)許多蛋白序列雖然缺乏信號(hào)膚序列，但在其囊液中都能檢測(cè) 到該蛋白組分，說(shuō)明運(yùn)些蛋白即使沒(méi)有信號(hào)膚仍然可分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明在原核表達(dá)系 統(tǒng)中高效表達(dá)的TsSe巧in B6蛋白，雖然主要W包涵體形式存在，但可與豬囊尾蝴陽(yáng)性血清 發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明重組TsSe巧in B6具有良好的免疫反應(yīng)性，而且該蛋白可能為分泌性 蛋白，可分泌到蟲(chóng)體外刺激宿主產(chǎn)生針對(duì)該組分的特異性抗體。W上結(jié)果表明TsSerpin B6 具有作為豬囊蟲(chóng)病血清學(xué)診斷候選分子的潛力。此外，通過(guò)對(duì)TsSerpin B6蛋白B淋己細(xì)胞 抗原表位的預(yù)測(cè)，表明該蛋白具有9個(gè)潛在的線性B細(xì)胞表位，說(shuō)明TsSerpin B6還可能成為 新型疫苗研發(fā)的候選分子。
[0059] 現(xiàn)已研究證實(shí)，在蠕蟲(chóng)、原生動(dòng)物和其他寄生蟲(chóng)中都存在絲氨酸蛋白酶抑制劑， Se巧ins在寄生蟲(chóng)-宿主相互作用過(guò)程中起著十分重要的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白酶和外 源性蛋白酶的作用，使寄生蟲(chóng)成功逃避宿主的防御機(jī)制。寄生蟲(chóng)在感染宿主的過(guò)程中，其絲 氨酸蛋白酶抑制劑可通過(guò)抑制宿主絲氨酸蛋白酶的活性，從而使自身的蛋白酶免遭宿主降 解，逃避宿主免疫攻擊。因此，進(jìn)一步研究豬帶緣蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑在蟲(chóng)體入侵及寄生 過(guò)程中的功能和作用，將為闡明豬帶緣蟲(chóng)入侵和免疫逃避機(jī)制，W及豬帶緣蟲(chóng)新型疫苗和 生物藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
[0060] 實(shí)施例2基于重組抗原TsSe巧inB6的豬囊尾蝴病化ISA檢測(cè)
[0061 ] W純化的TsSe巧inB6 Iiig于37°C包被酶標(biāo)反應(yīng)板化，包被緩沖液為抑9.6的碳酸 鹽緩沖液，包被抗原濃度為lOμg/ml，封閉液為1 %BSA，用PBST充分洗涂后分別加入倍比稀 釋的豬陰性血清及豬囊尾蝴、豬細(xì)頸囊尾蝴、豬旋毛蟲(chóng)和豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清，37°C解育化， PBST洗涂S次后，加入1:5000倍稀釋的皿P標(biāo)記的兔抗豬IgG,充分洗涂后再加入DAB顯色， 用濃硫酸終止反應(yīng)后測(cè)定吸光度。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。
[0062] 表1 W重組TsSe巧inB6( Iiig)為抗原的化ISA檢測(cè)結(jié)果
[0063]
[0064] 從表1可W看出，TsSerpinB6抗原與100倍稀釋的豬囊尾蝴陽(yáng)性血清反應(yīng)的平均OD 值達(dá)0.93,而與同樣倍數(shù)稀釋的豬陰性血清、豬細(xì)頸囊尾蝴陽(yáng)性血清、豬旋毛蟲(chóng)陽(yáng)性血清、 豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清反應(yīng)的OD值均在0.4 W下，即P(陽(yáng)性）/N(陰性）= 2.65〉2。說(shuō)明W TsSerpinBS為抗原的ELISA方法，具有很好的檢測(cè)特異性，克服了現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)方法易與 豬細(xì)頸囊尾蝴等存在交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，是理想的豬囊尾蝴病特異性檢測(cè)抗原。
[0065] 實(shí)施例3對(duì)豬帶緣蟲(chóng)陽(yáng)性血清的鑒定方法
[0066] 應(yīng)用實(shí)施例2中的試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)并分析檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)P (陽(yáng)性VN(陰性)〉2時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可判為陽(yáng)性，反之，則為陰性。
[0067] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可 W對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白，其特征在于:所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表 SEQ ID No.2。2. 豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白作為豬帶絳蟲(chóng)/囊尾蝴檢測(cè)抗原的應(yīng)用;所述豬帶絳 蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。3. 豬帶絳蟲(chóng)TsSerpin B6重組蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用；所述重組 蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。4. 一種豬囊尾蝴病ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中包被抗原為豬帶絳蟲(chóng) TsSerpin B6重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包括HRP標(biāo)記的兔抗豬 IgG06. -種豬帶絳蟲(chóng)ELISA檢測(cè)方法，所述方法不以專利法規(guī)定的疾病的診斷和治療為目 的，其特征在于：以純化的TsSerpin B6重組蛋白Iyg于37°C包被酶標(biāo)反應(yīng)板lh，封閉液為 1%BSA，用PBST充分洗滌后分別加入待測(cè)樣品和豬陰性血清，37°C孵育lh，PBST洗滌三次后， 加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸終止反應(yīng) 后測(cè)定吸光度，P(陽(yáng)性)/N(陰性)>2時(shí)，為陽(yáng)性血清，反之，為陰性血清。
【文檔編號(hào)】C07K14/81GK105924518SQ201610248978
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】駱學(xué)農(nóng), 劉光學(xué), 梁盼紅, 張少華, 侯俊玲, 郭愛(ài)疆, 鄭亞?wèn)|, 才學(xué)鵬
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所