專利名稱：：抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及抗代謝類化療藥物療效相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：化療藥物治療是目前治療腫瘤的主要手段之一，可以分為烷化劑類、抗代謝類、抗微管類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗生素類、激素類、分子靶點(diǎn)類等。其中，常用的抗代謝藥物有葉酸拮抗物、嘌呤類似物、嘧啶類似物等，這一類藥物的結(jié)構(gòu)和人體正常生理代謝的結(jié)構(gòu)類似，因而可以干擾正常代謝物的功能，在核酸合成的不同水平加以阻斷而產(chǎn)生療效。由于尚未發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞蛋白代謝上的特異性差異，起效的機(jī)制在于利用了正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中堿基和酶系含量的差異，因而抗代謝藥物的最大缺點(diǎn)是在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)增生旺盛的正常細(xì)胞也有相當(dāng)?shù)亩拘裕乙装l(fā)生耐藥。大量研究發(fā)現(xiàn)，核糖核苷酸還原酶M1(RRM1)、胸腺嘧啶合成酶(T預(yù)S，TS)等目標(biāo)基因的表達(dá)水平是預(yù)測(cè)患者能否使用抗代謝類藥物及其療效的重要依據(jù)。(1)吉西他濱與核糖核苷酸還原酶M1(RRM1)吉西他濱是細(xì)胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞。RRM1是DNA合成途徑中的限速酶，并參與吉西他濱的代謝途徑。通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥患者中RRM1高表達(dá)，并證實(shí)吉西他濱耐藥患者中RRM1表達(dá)水平同時(shí)對(duì)鉑類藥物治療亦有影響。研究表明RRM1和ERCC1的mRNA表達(dá)水平有很強(qiáng)的正向相關(guān)性。低RRM1mRNA水平的肺癌患者對(duì)吉西他濱和順鉑敏感性相對(duì)較高，中位生存期延長(zhǎng)，而高RRM1表達(dá)患者藥效性和中位生存期明顯下降。(2)嘧啶類抗代謝化療藥物(5-FU)與胸腺嘧啶合成酶(TYMS，TS)5-FU(氟尿嘧啶，fluorouracil)屬抗代謝類藥物中的氟尿嘧啶類，該類藥物還有替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脫氧氟尿苷以及卡培他濱等。這些藥物在體內(nèi)均轉(zhuǎn)化為5-FU，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。5-FU是最早使用的藥物之一，而且至今仍是癌癥治療中不可缺少的廣譜抗腫瘤藥。氟尿嘧啶類藥物的抗腫瘤療效雖得到廣泛認(rèn)可，但患者用藥后藥效的個(gè)體差異很大、且有不同程度的毒副作用。它對(duì)骨髓和消化道毒性較大，常引起脫發(fā)、神經(jīng)毒性和皮膚色素沉著，偶見肝、腎損害。5-FU是尿嘧啶5位上的氫被氟取代的衍生物，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5F-dUMP)，而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸(dUMP)甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?dTMP)，從而影響DNA的合成。此外，5-FU在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶核苷，以偽代謝產(chǎn)物形式摻入RNA中干擾蛋白質(zhì)的合成，故對(duì)處于各細(xì)胞周期細(xì)胞也有作用。T預(yù)S是嘧啶核苷酸合成的限速酶，也是5-FU發(fā)揮細(xì)胞毒作用的目標(biāo)酶。5-FU的代謝產(chǎn)物5F-dUMP與T預(yù)S、5，10-亞甲基四氫葉酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，阻礙T預(yù)S催化dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的生理過程，從而抑制DNA復(fù)制和修復(fù)。T預(yù)S基因mRNA的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和翻譯效率存在個(gè)體差異，并可導(dǎo)致腫瘤患者對(duì)5-FU為基礎(chǔ)的化療療效不同。大量臨床研究顯示，T預(yù)SmRNA高表達(dá)的患者較對(duì)5_FU產(chǎn)生耐藥性，即T預(yù)S基因表達(dá)水平低的患者對(duì)5-FU類藥物敏感，反之表達(dá)水平高的患者表現(xiàn)耐藥。對(duì)結(jié)直腸癌患者的臨床研究中顯示，T預(yù)S的mRNA表達(dá)水平與5_FU/奧沙利鉑治療的療效相關(guān)(p<0.001)，T預(yù)SmRNA低表達(dá)的患者在治療開始后，其生存概率明顯高于高表達(dá)者。因此，TYMS的表達(dá)水平可能是預(yù)測(cè)5-FU療效的關(guān)鍵指標(biāo)。(3)持家基因132-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)和TATA框結(jié)合蛋白(TBP)持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，但由于這種穩(wěn)定表達(dá)是相對(duì)的，在一定的病理狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。選擇在我們所研究對(duì)象中穩(wěn)定表達(dá)的基因作持家基因，對(duì)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此，本發(fā)明從一定數(shù)量的常用持家基因中進(jìn)行篩選，確定3個(gè)合適的持家基因，分別是P2-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白(TBP)?；谝陨匣虻谋磉_(dá)水平與化療藥物療效的相關(guān)性，專家推薦患者在接受化療藥物之前，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè)體差異制定個(gè)體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。目前，對(duì)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、RNA原位核酸雜交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細(xì)胞內(nèi)RNA分布以了解特定基因的表達(dá)情況，且其過程較長(zhǎng)、操作繁瑣，不適合用于臨床應(yīng)用；而逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進(jìn)行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)的結(jié)果受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性高；再次，這兩種方法一般只有一個(gè)持家基因作對(duì)照，其準(zhǔn)確性容易受到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法作為臨床應(yīng)用均存在著難以克服的技術(shù)缺陷。液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，在微球的制造過程中，摻入不同比例的染色劑，從而形成IOO種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對(duì)不同待檢測(cè)物的探針分子從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多達(dá)100中待檢物質(zhì)的同步并行檢測(cè)。因此，我們采用液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通量，大大提高了檢測(cè)效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供與抗代謝類化療藥物療效相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平液相檢測(cè)芯片，該液相芯片可用于檢測(cè)以下5種目標(biāo)基因的表達(dá)水平RRM1、T預(yù)S、B2M、TFRC、TBP。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下—種抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，主要包括(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列PI互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.30中的2條或2條以上；(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5'端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5，3'端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)RRMl基因的選自SEQ.NO.31-SEQ.NO.40中的5條或5條以上、和/或針對(duì)T預(yù)S基因的選自SEQ.NO.41-SEQ.NO.50中的5條或5條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.51-SEQ.NO.60中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.61-SEQ.NO.70中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.N0.71-SEQ.NO.80中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列?；蛘甙ㄓ?1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列PI互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)RRMl基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.30中的2條或2條以上；(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5'端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5;所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)RRMl基因的選自SEQ.NO.31-SEQ.NO.40中的5條或5條以上、和/或針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.41-SEQ.NO.50中的5條或5條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.51-SEQ.NO.60中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.61-SEQ.NO.70中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.71-SEQ.NO.80中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；禾口(4)標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具有生物素修飾。優(yōu)選地，所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，還包括有填充序列，包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.81-SEQ.NO.86中的一條或多條、針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.90中的一條或多條、針對(duì)B2M基因的選自SEQ.7NO.91-SEQ.NO.98中的一條或多條，和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.99-SEQ.NO.102中的一條或多條。優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T;所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。本發(fā)明另一目的是提供一種抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)方法。具體技術(shù)方案如下—種檢測(cè)抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法，使用上述液相芯片，主要包括以下步驟(—)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針帶有生物素標(biāo)記，擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；(三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(四)通過熒光檢測(cè)儀檢測(cè)?；蛘?，主要包括以下步驟(—)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合；(三)再加入標(biāo)記探針，標(biāo)記探針帶有生物素標(biāo)記，50°C±1°C，600rpm震蕩孵育1小時(shí)，標(biāo)記探針與擴(kuò)增延伸探針的序列P5互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；(四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋自進(jìn)行反應(yīng)；(五)通過熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)中特異性好、信噪比高。同時(shí)，多種探針的組合使用使液相芯片和檢測(cè)方法形成一個(gè)檢測(cè)效果完好的系統(tǒng)。運(yùn)用本發(fā)明所述的液相芯片和檢測(cè)方法，對(duì)抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的，無需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測(cè)結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，以多個(gè)持家基因作對(duì)照(N>3)，檢測(cè)結(jié)果不易受病理狀態(tài)的影響，準(zhǔn)確性高使檢測(cè)結(jié)果更為可靠。(2)本發(fā)明使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對(duì)、級(jí)聯(lián)放大的方式來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而不是PCR擴(kuò)增的方法，提高了檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。(3)本發(fā)明所述的液相芯片和檢測(cè)方法適用于新鮮組織、石蠟包埋固定組織、組織切片、穿剌組織等樣本類型，對(duì)比起其他的mRNA檢測(cè)方法，有著操作簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確性高、特異性高的特點(diǎn)。具體實(shí)施例方式本領(lǐng)域的人員所知，所述間隔臂序列為用于將支持探針與微球表面間隔開來，在支持延伸探針與擴(kuò)增延伸探針內(nèi)部也存在間隔臂序列，通過在探針序列與胺基之間、探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n^3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂(間隔臂長(zhǎng)度優(yōu)選2-4)。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個(gè)T，在中國，T的合成技術(shù)比較成熟，成本相對(duì)較低。實(shí)施例1抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片試劑盒，主要包括有—、偶聯(lián)有支持探針(SP)的微球支持探針由三部分組成，5'端是與微球結(jié)合的胺基端，3'端是與支持延伸探針結(jié)合的特異序列Pl，長(zhǎng)度為16nt，中間是8個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，并選用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。每個(gè)目標(biāo)基因的支持探針如表1所示表1不同的目標(biāo)基因及其選用微球的編號(hào)、支持探針(SP)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>所有探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的支持探針用滅菌(1朋20配成100nmol/ml的貯存液。微球包被的過程如下分別取5X106個(gè)上述編號(hào)的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕獲探針(100nmol/ml)。配制lOng/ml的EDC(N_(3-Dimethylaminopropyl)_N_ethylcarbodiimide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02X的Tween-20洗滌一次，再用0.1%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有支持探針的微球重懸于lOOul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA]中，2-8。C避光保存。二、)與目標(biāo)基因mRNA特異結(jié)合的支持延伸探針(SE)、擴(kuò)增延伸探針(AE1)支持延伸探針(SE)是連接支持探針(SP)與目標(biāo)基因mRNA之間的序列，SE由三部分組成，5'端是能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2，長(zhǎng)度介于17nt至26nt，3'端是能與支持探針PI序列通過堿基互補(bǔ)結(jié)合的特異性序列P3，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個(gè)目標(biāo)基因分別設(shè)計(jì)5支持延伸探針，以提高檢測(cè)的特異性。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇2條或2條以上支持延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用5條支持延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。合成后的每條探針分別用lOmmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標(biāo)基因的支持延伸探針(SE)見表2。表2目標(biāo)基因的支持延伸探針(SE)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2)擴(kuò)增延伸探針(AE)是連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分之間的序列，AE由三部分組成，5'端是能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4，3'端是能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列P5，(如不運(yùn)用標(biāo)記探針檢測(cè)時(shí)，則3'端還修飾有生物素)，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個(gè)目標(biāo)基因分別設(shè)計(jì)10至15條擴(kuò)增延伸探針，從而將檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行級(jí)聯(lián)放大。合成后的每條探針分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標(biāo)基因的擴(kuò)增延伸探針(AE)見表3。所述P5的設(shè)計(jì)按照本領(lǐng)域的探針設(shè)計(jì)的公知常識(shí)，其為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列，本發(fā)明優(yōu)選為堿基組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇5條或5條以上擴(kuò)增延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用10條擴(kuò)增延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇5條或5條以上擴(kuò)增延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用10條擴(kuò)增延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。表3目標(biāo)基因的擴(kuò)增延伸探針(AE)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表4目標(biāo)基因的填充序列(fs)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>三、標(biāo)記探針(LP)標(biāo)記探針(LP)由兩部分組成，其3'端是能與擴(kuò)增延伸探針序列P5互補(bǔ)結(jié)合的序列，5'端帶有生物素標(biāo)記，通過與擴(kuò)增延伸探針結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大'<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2運(yùn)用抗代謝類藥物療效相關(guān)的基因mRNA表達(dá)檢測(cè)液相芯片對(duì)臨床樣本<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>—、裂解樣本釋放總RNA1.將FFPE腫瘤組織切片從載玻片上刮下，放入1.5ml離心管中，加入300ul勻漿緩沖液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均勻，65t:消化2h。2.消化2h后的樣品，室溫下13，000rpm離心5分鐘，吸取中間澄清的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中備用。(如溶液仍不澄清，則重復(fù)本步驟12次。)二、目標(biāo)mRNA通過與探針特異性結(jié)合固定在微球上1.取出探針工作液于室溫融解，然后在95t:變性5分鐘，馬上置于冰上。2.按下表配制工作液，混合均勻<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.將上述配制好的工作液分裝至雜交板上，60ul/孔。然后將上述處理好的樣品以40ul/孔分別加入雜交板中；空白對(duì)照加入勻漿緩沖液40ul/孔。密封雜交板，54°C士rC，600rpm震蕩孵育過夜(16-22h)。4.用洗滌緩沖液潤(rùn)濕濾板1分鐘，除去洗滌緩沖液。5.將雜交板取出，500Xg離心1分鐘，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至濾板中。6.除去溶液，用200ul洗滌緩沖液洗滌3次。三、通過雜交反應(yīng)將目標(biāo)RNA信號(hào)放大1.加入標(biāo)記探針工作液飾1/孔。50°C士rC，600rpm震蕩孵育1小時(shí)。2.除去溶液，用200ul洗滌液洗滌2次。四、與SA-PE結(jié)合，并在液相芯片閱讀儀上檢測(cè)1.加入SA-PE工作液100u1/孔，600rpm震蕩室溫孵育30min。2.除去溶液，用200ulSA-PE洗滌液洗滌2次，用吸水紙吸干濾板底部。3.加入SA-PE洗滌液130u1/孔。室溫，600rpm震蕩孵育2至5分鐘。4.在液相芯片儀上讀取數(shù)據(jù)。五、數(shù)據(jù)分析及cutoff值的界定在5個(gè)目標(biāo)基因中，目標(biāo)基因2個(gè)，分別是RRM1、TYMS;持家基因3個(gè)，分別是B2M、TFRC、TBP;將讀取的熒光值按照以下方法進(jìn)行均一化處理步驟1:獲得原始數(shù)據(jù)(MFI值)步驟2:樣品的MFI減去空白孔N的MFI=netMFI步驟3:每個(gè)樣品的三個(gè)持家基因的netMFI值分別取幾何平均值，得到相應(yīng)的G1、G2、G3......Gn步驟4:每個(gè)樣品目標(biāo)基因mRNA的netMFI除以對(duì)應(yīng)的Gn得到相應(yīng)的Nn。Nn即為已排除上樣量差異，可在樣品間進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量比較的數(shù)值。本實(shí)施例中對(duì)10例樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下所示表610例樣品原始數(shù)據(jù)(MFI值)與RRM1、T預(yù)S的相對(duì)表達(dá)量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例3:不同間隔臂的液相芯片對(duì)鉑類藥物相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)—、液相芯片制備的設(shè)計(jì)(間隔臂的選擇)以ERCCl檢測(cè)液相芯片的支持探針為例，分別選用不同的間隔臂，具體設(shè)計(jì)如表7所示。探針SP、SE與AE的合成、SP序列包被微球、檢測(cè)方法等如實(shí)施例1和實(shí)施例2所述。表7間隔臂及其長(zhǎng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二、樣品檢測(cè)采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過程和方法對(duì)樣品11-55進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)熒光值)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>將4組設(shè)計(jì)的檢測(cè)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明4組設(shè)計(jì)的檢測(cè)效果沒有差異。因此，這4種間隔臂的設(shè)計(jì)是等效的。其它針對(duì)支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針內(nèi)部不同的間隔序列的液相芯片，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例4:不同信號(hào)檢測(cè)組分液相芯片對(duì)鉑類藥物相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)—、液相芯片制備的設(shè)計(jì)(信號(hào)檢測(cè)組分)信號(hào)檢測(cè)組分有兩種選擇，1)擴(kuò)增延伸探針3'端序列P5的3'端帶有生物素標(biāo)記；2)擴(kuò)增延伸探針3'端序列P5與標(biāo)記探針(LP)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，同時(shí)標(biāo)記探針的5'端帶有生物素標(biāo)記。這兩種信號(hào)檢測(cè)組分均能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，檢測(cè)到正常信號(hào)。其中，使用標(biāo)記探針的生物素活性更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。所述液相芯片以檢測(cè)RRM1基因的兩種信號(hào)檢測(cè)組分為例，具體設(shè)計(jì)如表9所示。即所述液相芯片的組成為實(shí)驗(yàn)組1:支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列同實(shí)施例l，擴(kuò)增延伸探針具有生物素標(biāo)記；沒有標(biāo)記探針；實(shí)驗(yàn)組2:支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列、標(biāo)記探針同實(shí)施例1，擴(kuò)增延伸探針不具有生物素標(biāo)記。表9信號(hào)檢測(cè)組分<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>二、樣品檢測(cè)采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過程和方法對(duì)樣品16-20進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)熒光值)表10樣品檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值〈MFI值>)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>將兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)結(jié)果沒有差異，因此，這兩種信號(hào)檢測(cè)組分對(duì)信號(hào)的檢測(cè)是等效的。其中，使用標(biāo)記探針的信號(hào)檢測(cè)組分，由于其生物素的活性更為穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以上是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。序列表〈110〉廣州益善生物技術(shù)有限公司〈120〉抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法〈160>103〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1actatacttcttcact16〈210>2〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tcattcattcatcaat16〈210>3〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉3ctttctttaatctcaa〈210〉4〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4cattcaaatctcaact〈210>5〈211>16〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>5caattacttcaaatct<210〉6〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>6ccgtctgagactc朋tgatggc〈210〉7〈211〉25〈212>DNA<213>人工序列〈400〉7cctcatctttgctggtgtactccac<210>8〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉8ttattcaagtttcggacaacgact〈210>9〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>9ctgccagaccttgtacccca20〈210>10〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉10ctccttggcaaggtcacagct21〈210〉11〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>11ggagaatcccaggctgtcca21〈210〉12〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉12ttgcagttggtcaactccctgt22〈210>13〈211>19<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉13C卿gggC3tggCEltggElg19〈210〉14〈211〉21〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>14tagctggcgatgttgaaaggc21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉16朋ggCC3Cgg3gCg3g3C3t<210>17〈211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈400>17ccattctctgctggatgacgtg22<210>18〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>18gctgaaagacaagtctgaatgctc24〈210〉19〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>19ttaactatcttgggctgtgacaaag25〈210>20〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>20gg3g3cagc3ctc朋3gtegaatta25〈210>21<211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>21acaatagcccaagtagccaateat24〈210>22〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2222tcggttcctgccagtctctc3C〈210〉23〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>23tctccgacaactttctcttcaggt<210〉24〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>24ccagcctcacgagggacatet〈210>25〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>25acgccagactttgctgagtttea〈210>26〈211〉24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>26cgaagtgcaatggtctttaggtca〈210>27<211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>27cgtggttcgtggctctcttatec〈210>28〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>28tattttcttgctgccagtctgg〈210>29〈211>2422242123242322〈212>DNA<213>人工序列〈400〉29catcacagctccccaccatattct〈210>30〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>30caattctgggtttgatcattctgtag〈210>31〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>31gctgctgagcttttacaactttgc〈210>32〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>32g朋tctttgt3g3gcatet3cgggg〈210>33<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>33gttctgctggttgctctttcg〈210>34〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>343C3tecatattcagggccaggggtgacttcagccaacttctt肌3g〈210>36〈211>25〈212>DNA<213>人工序列〈400〉36gcctctggtacaggatagtagttta〈210>37〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>37gggcgatggcgtttatttg〈210>38<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>38ctctcaaaagggtatctcatc郷a〈210>39<211>25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>39ctgcttattcagtaactgggcttct<210>40〈211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>40actggagagccctcataggt.ttc〈210>41〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列<400>41ggcatcccagattttcactcc〈210>42〈211>21251925252321<212〉DNA〈213>人工序列〈400〉42actggaagccate朋ctgggc〈210〉43〈211〉23<212〉DNA〈213>人工序列〈400>43tccatatctctgtattctgcccc〈210〉44〈211〉23<212〉DNA〈213>人工序列〈400>44ggttggttttgatggtgtcaate〈210〉45〈211〉22<212〉DNA〈213>人工序列〈400>45agatctcttggattccaagcgc〈210〉46〈211〉24<212〉DNA〈213>人工序列〈400>46aggacagctcactgttcacc〈210〉47〈211〉20<212〉DNA〈213>人工序列〈400>47aggcccatgtctcccgatct〈210〉48cgcaatcatgtecgtgagcag〈210>49〈211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>49tggcttcaggcccgtgat〈210〉50〈211〉20<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>50ctgggttctcgctgaagctg〈210〉51<211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉51ttcaggaatgcccgcca〈210>52〈211>23〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉52CC3ggCC3g333g3g3g3gtage〈210>53〈211〉23〈212〉DNA<213>人工序列〈400>53cctgaatctttggagtacgctgg〈210〉54〈211〉24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉54ggatg3肌cccagac3C3tagc朋<210〉55〈211>24明書_23/31頁21182017232324agtgggggtgguattc;agtgtElgtEl〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>55〈210>56<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>56tcacacggcaggcatactcatct23〈210>57<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>57gctgcttacatgtctcgatccc22〈210>58<211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>58tgcggcatcttcaaacctcc20〈210>59<211>25〈212>DNA〈213>人工序列〈400>59gcaacctgctcagatacatcaaaca25〈210>60<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>60cctctaagttgccagccctceta23〈210>61<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6128atagtcccatagcagatacttccac〈210>62〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>62caatc朋g朋3朋g3Cgfitc3C3gC〈210〉63〈211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>63ctcagtttttggttctacccctt〈210〉64〈211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉64ctcctggctcctccctcactg〈210>65<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>65cgacgtgctgcagggaagt<210>66〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>66gctggtgaagtctgtgctgtcc〈210>67〈211〉22〈212>DNA<213>人工序列〈400>67ttttcattcagcagcttgatgg〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>68cgagttttgagcgctgtctttg〈210>69<211>24〈212>DNA〈213>人工序列〈400>69caggattctccaccaggtaaacaa24〈210>70<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>70gttgcagccttactatacgccac23〈210>71<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>71gcagctgcggtacaatccc19〈210>72<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>72tacaaccaagattcactgtggatac25〈210>73<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>73gattatattcggcgtttcgggc22〈210>74<211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈400>74atgattaccgcagc朋accgc21〈210>75〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>75gcacaccattttcccagaactg22〈210>76〈211>23〈212>DNA<213>人工序列〈400>76ctgttcttcactcttggctcctg23〈210>77〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>77acccaacttctgtacaactctagc24〈210〉78〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>78tcttgaagtccaagaacttagctgg25〈210〉79〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列<400>79gggtgagcacaaggccttct肌22〈210>80〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>80caggaaateactctggctca26〈210>81〈211>22<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>81tgcacaggttgctgcatttgat〈210〉82〈211〉19<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>82agccaaattec朋3cagc3〈210〉83〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉83cgtatgtgtgttctgatgt〈210〉84〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉84C3g3gcaccateateaategtttc〈210〉85〈211〉24<212〉DNA〈213>人工序列〈400〉85catetcatactgaagaattccttt〈210〉86〈211〉21〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉86gtcccataggtctgtaggagt〈210〉87aagtccccttcttctctg〈210>88〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>88atgatgattcttctgtcgtc〈210〉89〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>89attttcagtggctcgatgtg〈210〉90〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉90gaagaatcctgagctttggga朋g〈210>91<211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>91cggcccgaatgctgtca<210>92〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>92cagtaagtcaacttcaatgteg〈210>93〈211〉23〈212>DNA<213>人工序列〈400>93ctttttcaattctctctccattc〈210〉94〈211>20明書_29/31頁1820202417222333〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉943g3g3t3g朋3g3CC3gtCC〈210>95〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>953g朋tttgg33ttcatcc朋tec<210>96〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>96age<210>97〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>97ctacattttgtgcataaagtgta〈210>98〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>98g朋g3tcatgtccatgtt朋cat〈210>99〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>99cgcaagattttcatctttttgagcacgaaattgattttcaacatac〈210>101〈211〉22〈212>DNA〈213>人工序列〈400>101ctgaatcttaacaaaatgttg￡l〈210>102<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>102ctaccgttcttatcaactatgat〈210>103〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>103t卿C3CgggElggC由gg19權(quán)利要求一種抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.30中的2條或2條以上；(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5，3’端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.31-SEQ.NO.40中的5條或5條以上、和/或針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.41-SEQ.NO.50中的5條或5條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.51-SEQ.NO.60中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.61-SEQ.NO.70中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.71-SEQ.NO.80中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.81-SEQ.NO.86中的一條或多條、針對(duì)T預(yù)S基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.90中的一條或多條、針對(duì)B2M基因的選自SEQ.N0.91-SEQ.N0.98中的一條或多條，和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.99-SEQ.NO.102中的一條或多條。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。5.—種抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列Pl互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對(duì)T預(yù)S基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.30中的2條或2條以上；(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5'端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5;所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.NO.31-SEQ.NO.40中的5條或5條以上、和/或針對(duì)TYMS基因的選自SEQ.NO.41-SEQ.NO.50中的5條或5條以上；以及針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.51-SEQ.NO.60中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.61-SEQ.NO.70中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.71-SEQ.NO.80中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；禾口(4)標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具有生物素修飾。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，包括有針對(duì)RRM1基因的選自SEQ.N0.81-SEQ.NO.86中的一條或多條、針對(duì)T預(yù)S基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.90中的一條或多條、針對(duì)B2M基因的選自SEQ.N0.91-SEQ.N0.98中的一條或多條，和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.99-SEQ.NO.102中的一條或多條。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。9.一種檢測(cè)抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述液相芯片，主要包括以下步驟(一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54°C±1°C，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的PI互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針帶有生物素標(biāo)記，擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；(三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(四)通過熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。10.—種檢測(cè)抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述液相芯片，主要包括以下步驟(一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合；(三)再加入標(biāo)記探針，標(biāo)記探針帶有生物素標(biāo)記，5(TC士rC，600rpm震蕩孵育1小時(shí)，標(biāo)記探針與擴(kuò)增延伸探針的序列P5互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；(四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(五)通過熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，所述檢測(cè)液相芯片，主要包括有與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球；連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端的能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列互補(bǔ)配對(duì)的序列；連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分間的擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列。本發(fā)明還公開了運(yùn)用該液相芯片對(duì)抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)的方法。本發(fā)明檢測(cè)過程無需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測(cè)結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，由于液相芯片技術(shù)使多指標(biāo)并行檢測(cè)成為了現(xiàn)實(shí)，在一次檢測(cè)中可設(shè)置多個(gè)內(nèi)參基因，使檢測(cè)結(jié)果更為可靠。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101698885SQ200910193799公開日2010年4月28日申請(qǐng)日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者吳詩揚(yáng),楊惠夷,羅彩英,許嘉森,郭元杰申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司