專利名稱：：抑制Na_v1.8的短干擾核酸組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供單鏈或雙鏈短干擾核酸，所述干擾核酸可導(dǎo)致Nav1.8鈉通道基因的mRNA發(fā)生RNAi誘導(dǎo)的降解；本發(fā)明還提供含這種短干擾核酸的藥物組合物；含這種短干擾核酸的重組載體；抑制mRNA翻譯的方法；抑制多肽表達(dá)的方法；阻斷細(xì)胞膜電位的方法；阻斷細(xì)胞鈉電流的方法；及抑制慢性疼痛的方法。
背景技術(shù)：
：慢性疼痛是由AIDS、癌癥化療、糖尿病或外周神經(jīng)的直接物理損傷所誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病的主要癥狀。這種神經(jīng)性疼痛通常會使人高度衰弱，而且耐受治療干預(yù)。神經(jīng)疼痛的動物模式表明，神經(jīng)狀態(tài)維持中的突出特征是外周神經(jīng)中的感覺傳入神經(jīng)元在損傷后異常的、持續(xù)的超興奮性。此外，一個常見的臨床發(fā)現(xiàn)是諸如利多卡因這樣的廣譜鈉通道阻斷劑，可強(qiáng)烈地抑制神經(jīng)性疼痛。但仍不清楚各種鈉通道亞型在神經(jīng)性疼痛方面的相對貢獻(xiàn)。電壓門控鈉通道對在神經(jīng)元中起始和傳播動作電位非常關(guān)鍵。另外，這些通道也參與神經(jīng)興奮性的調(diào)控。因此，電壓門控鈉通道在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)間傳遞疼痛信息方面具有重要作用。外周神經(jīng)損傷可引起鈉通道積累在損傷位點周圍的初級傳入膜上。這導(dǎo)致受損傳入及其周圍未受損神經(jīng)元的重復(fù)放電以及興奮性增加。興奮性的增加在表達(dá)神經(jīng)性疼痛方面是非常關(guān)鍵的。在腦、神經(jīng)元和橫紋肌中至少鑒定出10種不同的鈉通道異構(gòu)體。鈉通道的主要成分是形成通道孔的260kDa的a-亞基。a-亞基由4個同源結(jié)構(gòu)域DI、DII、DIII和DIV組成，每種又含有6個跨膜部分S1-S6。絕大多數(shù)鈉通道均與輔助型p-亞基Pl-P4相連，其平均分子量為30kDa。P-亞基可調(diào)控這些通道的表達(dá)水平及開關(guān)。在PNS中主要表達(dá)3種鈉通道異構(gòu)體，即Nav1.7、Nav1.8和Navl.9。其中Nav1.7廣泛存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)中，從而在Schwann細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中存在于所有類型的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中。Nav1.7對納摩爾量的河豚毒素敏感。Nav1.8僅存在于感覺傳入神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中。Navl.8通道對河豚毒素高度耐受，IC50高于50^M。Nav1.9也在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的小纖維中表達(dá)，而且也耐受納摩爾濃度的河豚毒素，但半數(shù)最大阻斷量是約40pM河豚毒素。最近對尋找治療疼痛的治療性靶點的研究集中在在成熟的背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中所發(fā)現(xiàn)的抗河豚毒素的鈉通道。已知其一個重要部分是疼痛敏感的"傷害性感受器"。這種鈉通道的一種是Nav1.8，以前被認(rèn)為是PN3或外周神經(jīng)鈉通道類型3。已發(fā)現(xiàn)該通道在慢性疼痛疾病中，在背根神經(jīng)節(jié)中是上調(diào)的。另外，Nav1.8的理化特性使該通道成為在損傷后維持外周神經(jīng)持續(xù)地重復(fù)放電的一種可能候選物。另外，Nav1.8的表達(dá)被限制在背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元外周，這表明阻斷該通道可能以最小副作用減輕神經(jīng)性疼痛。但由于目前可獲得的鈉通道阻斷劑不能區(qū)分鈉通道亞型，因此這種可能性沒有進(jìn)行藥理學(xué)檢測。已在神經(jīng)性疼痛的動物模型中使用針對Nav1.8表達(dá)的反義脫氧寡核苦酸來檢測該通道的選擇性衰減表達(dá)是否可減輕神經(jīng)性疼痛。參見Porreca等"Acomparisonofthepotentialroleofthetetrodotoxin-insensitivesodiumchannels,PN3/SNSandNaN/SNS2，inratmodelsofchronicpain"，Proc.Nat.Acad.ScL,vol.96，pp.7640-7644(1999)。已發(fā)現(xiàn)通過反義脫氧寡核苷酸抑制Nav1.8的表達(dá)可在其他動物疼痛模型中抑制慢性疼痛。參見Yoshimura等"Theinvolvementofthetetrodotoxin國resistantsodiumchannelNav1.8(PN3/SNS)inaratmodelofvisceralpain"，J.Neuroscience，vol.21,pp.8690-8696(2001》和Khasar等"Atetrodotoxin-resistantsodiumcurrentmediatesinflammatorypainintherat",NeuroscienceLetters,vol.256，no.1，pp.17-20(1998)。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)表明通過針對Nav1.8的特異反義寡核苷酸選擇性敲減背根神經(jīng)節(jié)中的Nav1.8蛋白抑制了由脊髓神經(jīng)連接損傷所引起的痛覺過敏和痛覺超敏。參見Kim等"Anexperimentalmodelforperipheralneuopathyproducedbysegmentalspinalnerveligationintherat",Pain,vol.50，pp.355-363(1992)。以上數(shù)據(jù)表明Nav1.8在幾種外周神經(jīng)性和發(fā)炎性疾病中的病理生理作用。但反義寡核苷酸在治療上的用途由于其體內(nèi)的不穩(wěn)定性、有限的效率和可能產(chǎn)生"脫靶"效應(yīng)而受到限制。由于沒有確定可特異阻斷Nav1.8的小分子，因此在治療疼痛時仍然需要調(diào)控Nav1.8的替代途徑。本發(fā)明通過提供特異敲減Nav1.8表達(dá)的短干擾核酸和siRNAs而滿足上述需求。siRNA由于高效的靶特異性、降低的脫靶可能性，其用途備受矚目，可進(jìn)行高效的抑制作用。代表短干擾RNA或小干擾RNA的siRNA是一種RNA干擾(RNAi)方式。RNAi是一種通過降解細(xì)胞中特異的mRNA耙標(biāo)、從而敲減或下調(diào)編碼的蛋白的水平來研究基因功能的技術(shù)。siRNA的作用機(jī)制包括多步驟過程。首先，雙鏈RNA(dsRNA)被RNaseHI家族成員識別，并被切割為21到23個核苷酸的siRNAs。然后，siRNAs整合到稱為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的RNAi耙復(fù)合物中。RISC是一種可識別靶mRNA的雙功能螺旋酶和RNase。在識別耙mRNA后，RISC與mRNA結(jié)合，并松開siRNA，這可使siRNA的反義鏈通過互補(bǔ)堿基配對(Watson-Crick堿基配對)而與耙mRNA結(jié)合。這可引起mRNA的水解和破壞，導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低。另外，siRNA顯然可進(jìn)行再循環(huán)，從而使一種siRNA分子可誘導(dǎo)切割約1000個mRNA分子。因此，siRNA介導(dǎo)的RNAi比目前已有的抑制靶基因表達(dá)的技術(shù)更有效。本文所包括的所有參考文獻(xiàn)、出版物、專利申請和專利均作為參考并入本文中。發(fā)明概述本發(fā)明涉及特異針對并引起Nav1.8鈉通道基因的mRNA發(fā)生RNAi誘導(dǎo)的降解的短干擾核酸以及使用這種干擾核酸的方法。本發(fā)明的一個技術(shù)方案提供了一種包含選自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸。該分離或重組短干擾核酸可進(jìn)一步包括3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明一個選擇性的技術(shù)方案提供了一種包含選自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列、并進(jìn)一步包含其互補(bǔ)核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸，。該分離或重組短干擾核酸可進(jìn)一步包括3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另一個技術(shù)方案提供了一種包含選自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸、進(jìn)一步包含其互補(bǔ)核苷酸序列，其中核苷酸序列和互補(bǔ)核苷酸序列可雜交形成雙鏈體。核苷酸序列和互補(bǔ)核苷酸序列各自均可進(jìn)一步含有3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另外一個技術(shù)方案提供了一種包含有義鏈和反義鏈的分離或重組短干擾核酸，其中有義鏈和反義鏈可雜交形成雙鏈體，其中有義鏈含與靶序列基本同一的核苷酸序列，其中靶序列選自SEQIDNOs:12-577。有義鏈和反義鏈可進(jìn)一步含有3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的栽體的藥物組合物。本發(fā)明的一個技術(shù)方案提供了一種含選自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物中一種或多種核苷酸序列的重組載體。另一個技術(shù)方案提供了一種抑制mRNA翻譯為多肽的方法，包括將能夠表達(dá)Nav1.8mRNA的細(xì)胞與一個或多個含選自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸相接觸。一個選擇性技術(shù)方案提供了一種抑制多肽表達(dá)的方法，包括將能夠表達(dá)Na丄8多肽的細(xì)胞與一個或多個含選自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸接觸。另一個選擇性技術(shù)方案提供了一種阻斷細(xì)胞中Nav1.8來源的膜電位的方法，包括將表達(dá)Nav1.8多肽的細(xì)胞與一個或多個含選自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸接觸。另外一個技術(shù)方案提供了一種阻斷細(xì)胞中Nav1.8來源的鈉離子流的方法，包括將表達(dá)Nav1.8多肽的細(xì)胞與一個或多個含選自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苦酸序列的分離或重組短干擾核酸接觸。進(jìn)一步的技術(shù)方案提供了一種抑制慢性疼痛的方法，包括對患者給藥有效劑量的藥物組合物，所述藥物組合物含有一種或多種含選自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。上述分離或重組短干擾核酸可進(jìn)一步包含3'突出端。發(fā)明的詳細(xì)描述本文所有引用的出版物均作為參考并入本文中。定義本申請所用的術(shù)語"反義鏈，，是指與有義鏈互補(bǔ)的核酸序列。本申請所用的術(shù)語"慢性疼痛"定義為持續(xù)很長時間的疼痛。本申請所用的術(shù)語"互補(bǔ)"是指與另一個核苷酸序列進(jìn)行Watson-Crick堿基配對的核苷酸序列，即噤呤與嘧啶結(jié)合。例如，一個核苷酸序列可代表有義鏈，而其互補(bǔ)的核苷酸序列則表示反義鏈。本文所用術(shù)語"雙鏈體"是指兩個可雜交的互補(bǔ)核酸序列，例如有義鏈和反義鏈。本文所用術(shù)語"表達(dá)，，、"表達(dá)"和"表達(dá)"是指核酸通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生多肽的分子生物學(xué)過程，即在該過程中，遺傳信息從基因傳到蛋白質(zhì)，使基因的作用表現(xiàn)出來。術(shù)語"同源性，，和"同源的"是指兩個核酸序列間的比較，當(dāng)序列進(jìn)行比對和比較時，它們具有相似性。兩個核酸序列間的同源性可通過序列比較或基于雜交的條件進(jìn)行測定。當(dāng)考慮到核苷酸插入或缺失而進(jìn)行優(yōu)化比對時，如果兩個序列(或其互補(bǔ)鏈)的核苷酸殘基一樣，說明具有核苷酸序列同源性。當(dāng)一個核苷酸序列可與另一個序列在選擇的雜交條件下進(jìn)行雜交時，則也存在同源性。在用來確定同源性的雜交中所用條件的嚴(yán)謹(jǐn)度依賴于諸如鹽濃度、溫度、是否存在有機(jī)溶劑及其他參數(shù)這樣的因素。本申請所用術(shù)語"敲減"是指降低mRNA表達(dá)水平，從而減少mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯。本申請所用術(shù)語"敲除"是指抑制mRNA表達(dá)，從而使mRNA不能翻譯為蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語"mRNA，，是指信使RNA。本文所用術(shù)語"膜電位"是指細(xì)胞膜兩側(cè)電荷的差異。本申請所用術(shù)語"疼痛"是指身體的疼痛，例如身體不舒服的感覺，從輕微的不適到極度難受或痛苦，通常是由疾病、損傷或脅迫造成的結(jié)果；或神經(jīng)上的疼痛，例如頭腦不適、精神沮悲痛、痛苦、焦慮或憂傷。本申請所用術(shù)語"RNAi"是指RNA干擾，是一種通過降解細(xì)胞或生物中特異的mRNA靶標(biāo)、從而敲除或敲減所編碼蛋白的水平來研究基因功能的技術(shù)。也稱為RNA沉默。本申請所用術(shù)語"有義鏈"是指核酸的編碼鏈。本申請所用術(shù)語"siRNA"是指短或小干擾核糖核酸，是RNA干擾中RNA沉默機(jī)制的一種類型。本申請中所定義的"短干擾核酸"是指脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或二者聯(lián)合的短干擾段。該術(shù)語也包括核酸的修飾和非常規(guī)堿基。優(yōu)選地，短干擾核酸是siRNA。本文所用術(shù)語"鈉電流"是指一部分由鈉離子作用產(chǎn)生的細(xì)胞膜電位。術(shù)語"患者"是指人和非人動物。本申請所用術(shù)語"轉(zhuǎn)染"是指通過諸如使用病毒來向細(xì)胞中導(dǎo)入核酸。本申請所用術(shù)語"轉(zhuǎn)錄，，是指由雙鏈DNA合成單鏈RNA的分子生物學(xué)過程。本申請所用術(shù)語"翻譯"是指由mRNA合成多肽的分子生物學(xué)過程。本文所用術(shù)語"治療"是指疾病或紊亂的治療、預(yù)防或抑制方法，可產(chǎn)生任何臨床所要的或有益的效果，包括但不限定于，減輕一個或多個癥狀，降低、減緩或停止疾病或紊亂的發(fā)展。Nav1.8特征Nav1.8鈉通道含一個a亞基和至少一個p亞基。Nav1.8完整的開放閱讀框的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列在本領(lǐng)域是已知的。例如，鼠Nav1.8的核酸序列和氨基酸序列分別為美國專利No.6，451，554中的SEQIDNOs:1和2。Nav1.8及其亞基的核酸序列和氨基酸序列也可在GenBanl^數(shù)據(jù)庫中找到，如以下表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>人Navl.8基因與鼠Navl.8基因具有較高的同源性，約為82%。因此，與可敲減鼠Nav1.8鈉通道的鼠Nav1.8短干擾核酸相對應(yīng)的人Nav1.8短干擾核酸可能會有效敲減人Nav1.8鈉通道。核酸含針對Nav1.8mRNA的短干擾核酸的組合物和方法可用于敲減或敲除Nav1.8鈉通道的表達(dá)，從而治療慢性疼痛。具體地，本發(fā)明的短干擾核酸可引起Nav1.8mRNARNAi介導(dǎo)的破壞。在慢性疼痛疾病中，背根神經(jīng)節(jié)中的Nayl.8鈉通道是上調(diào)的。因此，能夠敲減或敲除Nav1.8mRNA表達(dá)以及Nav1.8功能的短干擾核酸序列可用于阻止或治療慢性疼痛。因此，本發(fā)明提供了分離的或重組的短干擾核酸。本文所用術(shù)語"分離的"是指基本上是從通常在細(xì)胞或重組表達(dá)系統(tǒng)中所發(fā)現(xiàn)的其他成分中分離出來的核酸，例如RNA或DNA分子或混合的多聚體。這些成分包括，但不限定于，核糖體、聚合酶、血清成分及旁側(cè)基因組序列。因此該術(shù)語包括從天然環(huán)境中分離出來的短干擾核酸，包括重組或克隆的短干擾核酸分離物及化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。充分純化的分子包括分子的分離形式。分離的核酸通常是分子的同源成分，但在某些技術(shù)方案中，也含有較小的異源性。這種異源性典型地存在于核酸編碼序列的末端或?qū)λ枭锕δ芑蚧钚圆魂P(guān)鍵的區(qū)域。"重組的"短干擾核酸通過其生產(chǎn)方法或結(jié)構(gòu)來定義。因此某些重組核酸是通過使用涉及人工干預(yù)——例如操作或篩選的重組DNA技術(shù)制備的。其他是通過將兩個天然不相鄰的片段融合而制備的。包括載體和含使用任何合成寡核苷酸過程獲得的序列的核酸。短干擾核酸可以是單鏈或雙鏈的。單鏈短干擾核酸含有義鏈，而雙鏈短干擾核酸含有義鏈和反義鏈。優(yōu)選地，雙鏈短干擾核酸中的有義和反義鏈可通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對作用雜交而形成雙鏈體或通過單鏈發(fā)卡區(qū)連接。已知第二種形式的siRNA分子的發(fā)卡區(qū)可被"Dicer"蛋白或其等價物進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)切割，從而形成兩個獨(dú)立的堿基配對的RNA分子的siRNA。短干擾核酸的長度為17到29個核苷酸，優(yōu)選地為19到25個核苷酸，更優(yōu)選地為21到23個核苷酸，最優(yōu)選地為21個核苷酸。優(yōu)選地，短干擾核酸是siRNA。即，所有核苷酸在序列上是核糖核苷酸堿基。但本發(fā)明也包括小干擾核酸的類似物。短干擾核酸的類似物包含一個或多個核苷酸堿基的增加、缺失、變換、替代或修飾。例如，短千擾核酸可被變換、替代或修飾以含一個或多個脫氧核糖核苷酸堿基或非常規(guī)堿基或這些任意組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的短干擾核酸的一條或兩條鏈含有3'突出端。本文所用"3'突出端"是指從短干擾核酸鏈的3'端延伸出來的至少一個未匹配的核苷酸。3'突出端可以從1到6個核苷酸(包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，優(yōu)選地為1到5個核苷酸，更優(yōu)選地為1到4個核苷酸，特別優(yōu)選地為2到4個核苷酸，最優(yōu)選地為2個核苷酸。在本發(fā)明的另一個技術(shù)方案中，雙鏈體的有義和反義鏈含3'突出端。雙鏈體每條鏈的突出端長度可以相同或不同。更優(yōu)選地，3'突出端存在于雙鏈體的兩條鏈中，每條鏈的突出端長度為2個核苷酸。例如，雙鏈體的每條鏈可含二胸腺嘧啶酸("tt")或二尿嘧啶酸("uu")的3'突出端。為了增強(qiáng)短干擾核酸的穩(wěn)定性，3'突出端也是抗降解而穩(wěn)定的。在一個技術(shù)方案中，3'突出端通過含有諸如腺嘌呤或鳥嘌呤核苷酸這樣的嘌呤核苷酸來穩(wěn)定。選擇性地，通過修飾的類似物替代嘧咬核苷酸，例如用2'-脫氧胸腺嘧啶替代在3'突出端的尿嘧啶核苦酸，可耐受且不影響RNAi降解的效率。特別是，2'-脫氧胸腺嘧啶中的2'羥基顯著地增強(qiáng)3'突出端在組織培養(yǎng)基中對核酸酶的抗性。短干擾核酸作用于Navl.8靶mRNA。本文所用的"作用于Nav1.8靶mRNA"的短干擾核酸是指其有義鏈的核苦酸序列與耙mRNA相同或基本相同，并可誘導(dǎo)RNAi介導(dǎo)的mRNA降解的單鏈或雙鏈短干擾核酸。當(dāng)然，雙鏈siRNA的反義鏈的序列與siRNA有義鏈和靶mRNA互補(bǔ)。本文所用與靶序列"基本同一"的短干擾核酸是指與靶序列有1-4個核普酸差異的核酸序列。例如，短干擾核酸可含有與靶序列有一個、兩個、三個或四個核苷酸差異的有義鏈——只要RNAi介導(dǎo)的靶mRNA降解是由短干擾核酸誘導(dǎo)的即可。本文所用的"靶mRNA"或"靶序列"是指人Nav1.8mRNA、Nav1.8mRNA的突變體或選擇的拼接形式，或關(guān)聯(lián)的(cognate)Na4.8基因的mRNA。本文所用術(shù)語"突變體，，是指與靶mRNA有核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸替代或核苷酸修飾這些差異的短干擾核酸。這種改變可包括例如諸如在短干擾核酸的末端或短干擾核酸一個或多個內(nèi)部核苷酸中增加非核苷酸材料；使短干擾核酸抗核酸酶消化的修飾；或用脫氧核糖核普酸對短干擾核酸的一個或多個核苷酸進(jìn)行替代。本文所用術(shù)語"關(guān)聯(lián)的"是指來源于其他哺乳動物種的核酸。應(yīng)理解人Nav1.8mRNA可含有與其關(guān)聯(lián)物或突變體共有的靶序列。因此，含這種共有靶序列的單個短干擾核酸可誘導(dǎo)含共有靶序列的不同種類RNA的RNAi介導(dǎo)的降解。本發(fā)明的短干擾核酸可作用于任何靶mRNA序列中約19-25個連續(xù)核苦酸片段。篩選短干擾核酸的靶序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。另外，耙mRNA上的耙序列可選自對應(yīng)于靶mRNA的給定cDNA序列，優(yōu)選地從起始密碼子50到100個核苷酸下游——即以3'方向開始。不過靶序列可以位于5'或3'非翻譯區(qū)，或在臨近起始密碼子的區(qū)域。Nav1.8cDNA序列中合適的靶序列如實施例1所示。本發(fā)明的短干擾核酸可含有部分純化的核酸，基本純化的核酸，合成的核酸或重組產(chǎn)生的核酸。本文術(shù)語"基本純化的，，是指短干擾核酸不含其他污染蛋白、核酸及其它來源于初級原料生物或重組DNA表達(dá)系統(tǒng)的生物物質(zhì)?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法測定純度，典型地至少要高于50%、優(yōu)選地至少高于75%，更優(yōu)選地至少高于90%,最優(yōu)選地至少約95%的純度。可基于質(zhì)量或摩爾量估計純度。本發(fā)明的短干擾核酸可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來獲得。另外，短干擾核酸也可通過兩個獨(dú)立的、互補(bǔ)的核酸分子，或具有兩個互補(bǔ)區(qū)域的單個核酸分子來合成。例如，本發(fā)明的短干擾核酸可通過使用合適的保護(hù)性核糖核苷亞磷酰胺和傳統(tǒng)的DNA/RNA合成儀或其他已知的方法進(jìn)行化學(xué)合成。另外，短干擾核酸可由商品供應(yīng)商，例如Proligo(Hamburg,Germany)、DharmaconResearch(Lafayette,CO,USA)、PierceChemical(partofPerbioScience,Rockford，IL，USA)、GlenResearch(Sterling,VA，USA)、ChemGenes(Ashland,MA，USA)和Cruachem(Glasgow,UK)來產(chǎn)生。選擇性地，短干擾核酸可通過諸如環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒這樣的重組表達(dá)載體、使用任何合適的啟動子來表達(dá)。重組表達(dá)載體典型地是含有編碼某種短干擾核酸的核酸的自我復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)建體，通常與可在兼容的宿主細(xì)胞中調(diào)控核酸表達(dá)的合適的遺傳控制元件可操作連接在一起。遺傳控制元件包括原核啟動子系統(tǒng)或真核啟動子表達(dá)控制系統(tǒng)，典型地包括轉(zhuǎn)錄啟動子、可選的用來控制轉(zhuǎn)錄開始的操作子、提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、編碼合適的核糖體結(jié)合位點的序列、翻譯起始位點、多聚腺苷酸位點、及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)栽體也含有可使載體在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制原點，或諸如可提供抗生素抗性的選擇基因。本發(fā)明所用的載體包括微生物質(zhì)粒、病毒、噬菌體、整合的DNA片段及其他利于核酸整合到宿主基因組中的工具。質(zhì)粒是常用的載體形式，但所有具有相同功能的其他形式的栽體一一它們在本領(lǐng)域是已知的--均適用于本文中。參見例如，Pouwelsetal"CloningVectors:ALaboratoryManual,1985andSupplements,Elsevier,N.Y"andRodriguezetal，(eds.)，Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,1988，Buttersworth,Boston,MA。從質(zhì)粒中表達(dá)本發(fā)明短干擾核酸的合適的啟動子包括，例如U6啟動子、HlRNApolIII啟動子和巨細(xì)胞病毒啟動子。篩選其他合適的啟動子屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。本發(fā)明的重組質(zhì)粒也含有在特定組織或特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境表達(dá)短干擾核酸的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動子。從重組質(zhì)粒表達(dá)的短干擾核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行分離，或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明的短干擾核酸可以以兩個獨(dú)立的、互補(bǔ)的RNA分子，或具有兩個互補(bǔ)區(qū)的單個RNA分子從重組質(zhì)粒中表達(dá)。適于表達(dá)本發(fā)明的短干擾核酸的質(zhì)粒的篩選、向質(zhì)粒中插入表達(dá)短干擾核酸的核酸序列的方法及將重組質(zhì)粒遞送到目標(biāo)細(xì)胞中的方法均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。例如參見，Tuschl，Nat.Biotechnol,vol.20,pp.446-448(2002);Brummelkampetal"Science,vol.296，pp.550-553(2002);Miyagishietal"Nat.Biotechnol"vol.20，ppl.497-500(2002);Paddisonetal"GenesDev.，vol.16，pp.948-958(2002);Leeetal"Nat.Biotechnol"vol.20,pp.500-505(2002);Pauletal，Nat.Biotechnol"vol.20，pp.505-508(2002)和Suietal"Proc.Natl.Acad.ScLvol99，2002，PP5515-5520).如實施例所示，質(zhì)粒可含有在人U6RNA啟動子控制下、與polyT終止序列可操作連接的有義RNA鏈編碼序列，及在人U6RNA啟動子控制下、與polyT終止序列可操作連接的反義RNA鏈編碼序列。本文所用的"可操作連接"是指編碼有義和反義鏈的核酸序列與另一個序列相鄰。優(yōu)選地，編碼有義和反義鏈的序列以S'方向與多聚T終止信號緊密相鄰。因此，在有義或反義序列從質(zhì)粒中轉(zhuǎn)錄時，多聚T終止信號起到終止轉(zhuǎn)錄的作用。本文所用"在啟動子控制下，，是指編碼有義和反義鏈的核酸序列位于啟動子3'端，從而可使啟動子起始有義或反義編碼序列的轉(zhuǎn)錄。短干擾核酸的表達(dá)可通過傳統(tǒng)的方法在原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。高等真核生物包括來自動物細(xì)胞一一包括非哺乳動物來源，例如昆蟲細(xì)胞和鳥類，以及哺乳動物來源，例如人、靈長類和嚙齒類——的已建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系。多種合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是HEK293細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤/DRG細(xì)胞系ND7/23。本發(fā)明的短干擾核酸也可從重組的病毒載體表達(dá)。本發(fā)明的重組病毒載體含有編碼本發(fā)明的短干擾核酸的序列和任何適于表達(dá)短干擾核酸序列的啟動子。從病毒載體中表達(dá)短干擾核酸的合適啟動子包括，例如U6啟動子、HIRNApolIII啟動子和細(xì)胞巨病毒啟動子。篩選其他合適啟動子的方法屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。本發(fā)明的重組病毒載體也含有在特定組織或特定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)短干擾核酸的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動子。在實施例5中詳細(xì)討論了將本發(fā)明的短干擾核酸遞送到體內(nèi)細(xì)胞的重組病毒載體的用途。本發(fā)明的短干擾核酸可以以兩個獨(dú)立的、互補(bǔ)的核酸分子，或具有兩個互補(bǔ)區(qū)的單個核酸分子從重組病毒載體中表達(dá)?？墒褂萌魏慰山邮艽磉_(dá)的短干擾核酸的編碼序列的病毒載體，例如來源于腺病毒(AV)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰滲病毒等的載體。另外，也可通過用外膜蛋白或來源于其他病毒的其他表面抗原假型包裝載體來修飾病毒載體的向性。適于本發(fā)明的重組病毒載體的篩選、向載體中插入表達(dá)短干擾核酸的核酸序列的方法及將病毒載體遞送到目標(biāo)細(xì)胞中的方法均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。例如參見，Domburg，GeneTherap"vol.2，pp.301-310(1995);Eglitis，Biotechniqupsilones，vol.6，pp.608-614(1988);Miller,HumGeneTherap.，vol.1，pp.5-14(1990)和Anderson,Nature,vol.392，pp.25-30(1998)。優(yōu)選的病毒載體是來源于腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒的那些栽體。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明的短干擾核酸可從重組的含U6啟動子的腺病毒載體中以單鏈核酸分子表達(dá)。優(yōu)選的病毒載體也可以是皰滲病毒載體。例如參見Burton,E.A.etal.，(2005)Curr.Opin.Mol.Ther..Aug:7(4):326誦36和YeomansD.D.etal.(2005)-HumGeneTherapFeb:16(2):271-7。以下作為示例而非限定，所表達(dá)的單鏈核酸分子可包含兩個通過單鏈發(fā)卡區(qū)連接的互補(bǔ)區(qū)。單鏈核酸分子可進(jìn)一步含有3'突出端。體外和體內(nèi)方法可通過測定細(xì)胞中RNA或蛋白水平的標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)來評估短干擾核酸引起RNAi介導(dǎo)的靶mRNA降解的能力。例如，可將短干擾核酸遞送到培養(yǎng)的細(xì)胞中，通過Northerii印跡、斑點印跡或定量RT-PCR測定耙mRNA的水平。選擇性地，培養(yǎng)細(xì)胞中Nav1.8蛋白的水平可通過ELISA或Western印跡測定。在下面實施例2中描述了合適的用于測定本短干擾核酸對靶mRNA或蛋白水平的作用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。如上所述，本發(fā)明的短干擾核酸針對并引起Nav1.8mRNA或其選擇性拼接形式、突變體或關(guān)聯(lián)體的RNAi介導(dǎo)的降解。由本短干擾核酸引起的靶mRNA降解可降低Nav1.8基因的功能基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了一種在患者中抑制Nav1.8表達(dá)的方法，一種抑制mRNA翻譯的方法，一種抑制多肽表達(dá)的方法，一種阻斷細(xì)胞中Nav1.8來源的膜電位的方法，及一種阻斷細(xì)胞中Nav1.8來源的鈉電流的方法。在本發(fā)明的方法中，阻斷包括但不限定于消除或降低Nav1.8來源的膜電位或Nav1.8來源的鈉電流。雖然這些方法在實施例中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，但它們都具有一些共同特征。上述每種方法中的步驟均包括將細(xì)胞與短干擾核酸接觸。在體內(nèi)，接觸步驟包括對患者給藥作為藥物組合物的短干擾核酸。在體外，接觸步驟包括將細(xì)胞與短干擾核酸物理上臨近，從而使細(xì)胞和短干擾核酸可相互接觸。該接觸步驟可使短干擾核酸進(jìn)入細(xì)胞，并引起RNAi誘導(dǎo)的Nayl.8鈉通道基因mRNA的降解。優(yōu)選地，接觸步驟使用序列為SEQIDNOs:1-11的短干擾核酸。序列為SEQIDNOs:1、2、3、5、10和11的短干擾核酸是優(yōu)選的。序列為SEQIDNOs:2和5的短干擾核酸是更優(yōu)選的。序列為SEQIDNOs:1和3的短干擾核酸是最優(yōu)選的。也可在本發(fā)明的方法中使用序列為SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、lO和ll的一個或多個短干擾核酸。以下作為示例而非限定，可在本發(fā)明的方法中使用序列為SEQIDNOs:1、2、3、5、10和11的一個或多個短干擾核酸。另外，在本方法的操作中，應(yīng)理解可對細(xì)胞或患者同時或順序給藥本發(fā)明的多個短干擾核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了與一個或多個蛋白和/或靶核酸復(fù)合在一起的本發(fā)明的短干擾核酸以及含一個或多個本發(fā)明的短千擾核酸的細(xì)胞。藥物組合物本發(fā)明的短干擾核酸和siRNAs可用于治療慢性疼痛。本發(fā)明的各種化合物可作為藥物組合物。例如，藥物組合物可含有單鏈短干擾核酸、具有3'突出端的單鏈短干擾核酸、雙鏈短干擾核酸、每條鏈均具有3'突出端的雙鏈短干擾核酸。優(yōu)選地，藥物組合物含有序列為SEQIDNOs:1-11的短干擾核酸。序列為SEQIDNOs:2和5的短千擾核酸是更優(yōu)選的。序列為SEQIDNOs:1和3的短干擾核酸是最優(yōu)選的?？稍诒景l(fā)明的藥物組合物中使用序列為SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO和11的一個或多個短干擾核酸。以下作為示例而非限定，可在本發(fā)明的藥物組合物中使用序列為SEQIDNOs:1、2、3、5、10和11的一個或多個短干擾核酸。治療性給藥這種物質(zhì)的典型流程是本領(lǐng)域已知的。雖然本發(fā)明的組合物可以以簡單的溶液給藥，但更典型地是與其他物質(zhì)——例如載體，優(yōu)選地是藥學(xué)上可接受的載體一一聯(lián)合給藥。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體，，是指任何適于將本發(fā)明的成分遞送給患者的相容的、無毒的物質(zhì)。例如，無菌水、乙醇、脂肪、蠟和惰性固體可包括在載體中。藥學(xué)上可接受的佐劑，例如緩沖劑和分散劑也可包括在藥物組合物中。通常，這種藥物用于腸道外給藥的成分是已知的；例如Remington'sPharmaceuticalScience,17thEd.(MackPublishingCompany,Easton，PA,1990)?？山o藥治療性配方。配方典型地含有至少一種活性成分及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。配方可包括適于口服、直腸、鼻、透皮或腸道外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈和皮內(nèi))給藥的那些。配方可以單位劑量的形式存在或通過任何制藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法制備。參見例如Gilmanetal.(eds.)(1990)，ThePharmacologicalBasesofTherapeutics,8thEd"PergamonPress;andRemington'sPharmaceuticalSciences,supra，Eastern,Peim.;Avisetal.(eds.)(1993)PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedicationsDekker，NewYork;Liebermanetal.(eds.)(1990)PharmaceuticalDosageForms:TabletsDekker，NewYork;andLiebermanetal.(eds.)(1990)，PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystemsDekker，NewYork。在實施例中，本發(fā)明的任何短干擾核酸或載體可通過透皮給藥。透皮成分可采用面霜、洗液、氣溶膠和/或乳劑形式，可包括在基于此目的的本領(lǐng)域中常用的基質(zhì)或儲液嚢類型的透皮貼劑中。參見例如，Remington'sPharmaceuticalScience,17thEd.(MackPublishingCompany,Easton，PA，1990)。治療應(yīng)用中的給藥方案可通過參與的醫(yī)生、考慮各種可能改變治療性物質(zhì)作用的因素一—例如患者的癥狀、體重、性別和飲食，感染的嚴(yán)重性、住院時間及其它臨床因素來確定。通常，治療劑量從低水平逐漸增加，以獲得最佳安全性和有效性。通常，日常劑量范圍為每千克體重100-500jug。典型地，劑量范圍為每千克體重150-250jag。優(yōu)選地，劑量為每千克體重200pg。在給藥后可根據(jù)更小的分子大小和可能降低的半衰期(清除時間)對劑量進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的組合物的"有效劑量"是可減輕患者慢性疼痛的量。慢性疼痛包括一個或多個以下特征疼痛持續(xù)3個月以上，通過常規(guī)藥物治療沒有完全消除的疼痛，或超過正?；謴?fù)期的疼痛。慢性疼痛的例子包括，但不限定于，慢性神經(jīng)性疼痛和慢性發(fā)炎性疼痛。慢性神經(jīng)性和/或慢性發(fā)炎性疾病的例子包括，但不限定于皰滲后神經(jīng)痛、痛性糖尿病神經(jīng)病、神經(jīng)根病變、神經(jīng)壓迫性損傷(例如腕管綜合征、三叉神經(jīng)痛、肺瘤相關(guān)的神經(jīng)壓迫)、上下腰痛(例如來自推間盤損傷、強(qiáng)直性脊柱炎或未知的病理學(xué)疾病)、I型或II型復(fù)雜性區(qū)域性疼痛綜合癥、神經(jīng)損傷性疼痛(例如截肢后幻肢痛、其它截肢后引起的疼痛癥狀)、神經(jīng)根性撕脫傷、HIV-相關(guān)的疼痛、化療方案引起的神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病、坐骨神經(jīng)痛、痛覺過敏、痛覺過敏和進(jìn)行性灼傷痛(例如傷口相關(guān)的疼痛，包括但不限定于手術(shù)后疼痛)、關(guān)節(jié)痛、風(fēng)濕和骨關(guān)節(jié)炎痛、纖維肌痛、燒傷痛、神經(jīng)炎、坐骨神經(jīng)痛、肌腱炎、骨痛、偏頭痛、泌尿生殖器痛、和膀胱反射性亢進(jìn)引起的神經(jīng)性疾病。實施例通過下述以本發(fā)明的示例提供的非限制性實施例可更好理解本發(fā)明。以下實施例是為了用于更詳細(xì)說明本發(fā)明，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。除非特別說明，以下給出的固體混合物中的固體、液體中的液體及液體中的固體的百分比分別基于wt/wt、vol/vol和wt/vol。在細(xì)胞培養(yǎng)時通常維持無菌狀態(tài)。材料和通用方法使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法，如Maniatisetal"MolecularCloning:ALaboratoryManual,1982，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress;Sambrooketal"MolecularCloning:ALaboratoryManual,(2ded.)，Vols1-3，1989，ColdSpringHarborPress,NY;Ausubeletal"Biology,GreenePublishingAssociates,Brooklyn,NY或Ausubel,etal.(1987andSupplements),CurrentProtocolsinMolecularBiology,Greene/Wiley,NewYork;和lnnisetal.(eds.)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,1990，AcademicPress,N.Y中所述。實施例1本實施例說明針對Nav1.8的siRNAs的設(shè)計。針對鼠和人Nav1.8編碼序列的推定的siRNA序列通過Tuschl's預(yù)測原則進(jìn)行鑒定。參見Tuschl等"TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedKNAinvitro",GenesDev，vol.13，肌24，pp.3191-3197(Dec.15，1999);和Elbashiretal""Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells",Nature,vol.411，pp.494-498(2001)。表2確定了針對人Navl.8編碼序列的推定的siRNA序列。也列出靶序列、每個靶序列在基因中的位置及靶序列中鳥嘌呤/胞嘧啶的百分比。表3確定了針對鼠Nav1.8編碼序列的推定的siRNA序列。也列出靶序列和每個靶序列在基因中的位置。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>AAATTGCTGCCAAGCAGGGAA(SEQIDNO:17)AAGCAGGGAACAAAGAAAGCC(SEQIDNO:18)AACAAAGAAAGCCAGAGAGM(SEQIDNO:19)AAAGAAAGCCAGAGAGAAGCA'(SEQIDNO:20>AAAGCCAGAGAGMGCATAGG<SEQIDNO:21>AAGCATAGGGAGCAGMGGAC鄰QIDNO:22)AAGGACCAAGAAGAGMGCCT(SEQIDNO:23)AAGAAGAGAAGCCTCGGCCCC(SEQIDNO:24}AAGAGAAGCCTCGGCCCCAGC(SEQIDNO:25)AAGCCTCGGCCCCAGCTGGAC(SEQIDNO:26)AMGCCTGCAACCAGCTGCCC(SEQIDNO:27)AACCAGCTGCCCAAGTTCTAT(SEOIDNO:28)AAGTTCTATGGTGAGCTCCCA(SEQIDNO:29)AACTGATCGGGGAGCCCCTGG(SEQIDNO:30>AACAAAGGGAGGACCATTTCC(SEQIDNO:31)AAAGGGAGGACCATTTCCCGG(SEQIDNO:32)AACCTGATCAGMGAACGGCC(SEQIDNO:33)AAGMCGGCCATCAAAGTGTC(SEQIDNO:34)AACGGCCATCAAAGTGTCTGT(SEQIDNO:35)AAAGTGTCTGTCCACTCGTGG(SEQIDNO:36)AATTGTGTGTGCATGAGCCGA(SEQIDNO:37)AACTGACCTTCCAGAGAAMT(SEQIDNO:38)AAAATTGMTATOTCTTCACT(SEQIDNO:39)AATTGAATATGTCTTCACTGT(S￡QIDNO:40)AATATGTCTTCACTGTCATTT(SEQIDNO:41)AAGCGTTGATAAAGATACTGG(SEQIDNO:42)AMGATACTGGCMGAGGATT(SEQ,DNO:43)AAOAGGATTTTGTCTAAATGA(SEQIDNO:44)AAATGAGTTCACGTACCTGAG(SEQIDNO:45)AACTGGCTGGATTTTAGCGTC(SEQIDNO:46)AATAGATCTCCGTGGGATCTC(SEQIDNO:47)AAAAACAGTTTCTGTGATCCC(SEQIDNO:48)AAACAGTTTCTGTGATCCCAG(SEQIDNO:49)AAGGTCATTGTGGGGGCCGTG(SEQIDNO:50)AAGAAACTGGCTGATGTGACC(SEQIDNO:51)AAACTGGCTGATGTGACCATC(SEQIDNO:52)AAGTGTTnTGCCTTGGTGGG(SEQIDNO:53)AACTCTTCMGGGCMCCTCA(SEQIDNO:54)AAGGGCAACCTCMAAATAM(SEQIDNO:55;AACCTCAAMATAAATGTGTC(SEQIDNO:56)AAAAATAAATGTGTCMGAAT(SEQIDNO:57JAAATMATGTGTCMGMTGA(SEQIDNO:58)AAATGTGTCAAGMTGACATG(SEQIDNO:59)AAGAATGACATGGCTGTCAAT(SEQIDNO:60)AATGACATGGCTGTCMTGAG(SEQIDNO:61)AATGAGACMCCMCTACTCA(SEQIDNO:62)AACCAACTACTCATCTCACAG(SEQIDNO:63)AACTACTCATCTCACAGAAM(SEQIDNO:64)AAMCCAGATATCTACATAAA(SEQIDNO:65)AACCAGATATCTACATAAATA(SEQIDNO:66)AAATMGCGAGGCACTTCTGA(SEQIDNO:67)4TT34.4-546676446455445432223324443464444321233434322411111.1.111.12223333444445555566667777C0888888888888222222222233333333334444.3-444445555IJ-55A<\GCGAGGCACTTCTGACCCC(SEQIDNO:68)901AATGGATCTGACTCAGGCCAC(SEQIDNO:69)934AAAACTTCTGACAACCCGGAT(SEQIDNO:70)979AACTTCTGACAACCCGGATTT(SEQIDNO:71)981AACCCGGATTTTAACTACACC(SEQIDNO:72;991AACTACACCAGCTTTGATTCC(SEQIDNO:73)1003AACGCCTCTACCAGCAGACCC(SEQIDNO:74)1076AAAATCTATATGATCIIIIII(SEQIDNO:75>1111AATCTATATGATCIIMIIGT(SEQIDNO:76)"13AATC丌CCTGGGATCTTTCTA(SEQIDNO:77)1140AACTTGATCTTGGCTGTAGTC(SEQIDNO:78)1168/\ACCAGGCMCCACTGATGM(SEQIDNO:79》1210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85AAGTGCCCACCCTGCTTGATC(SEQIDNO:394)86AAGTATCTGATCTGGGAGTGC(SEQIDNO:395)87MGTGGAGGMGTTCAAGATG(SEQIDNO:396)88AAGTTCMGATGGCGCTGTTC(SEQIDNO:397)89MGATGGCGCTGTTCGAGCTG(SEQIDNO:398)90AACACCGTCTTCATGGCCATG<S￡QIDNO:399)91AAGCCGGCAACATTGTCTTCA(SEQIDNO:鄰o592AACATTGTCTTCACCC3TGTTT(SEQIDNO:401〉93AATGC5AGATGGCCTTCAA(3AT<SEQIDNO:402)S4AAGATCATTGCCTTCGACCCC('SEQIDNO:403)95AAGAAGTGGAATATCTTCGAC(SEQIDNO:404J56MGTGGMTATCTTCGACTGT(SEQIDNO:405;j57MTATCTTCGACTGTGTCATC(SEQIDNO:406〉98AAGMGGGCAGCCTGTCTGTG(S￡QIDN。:407)S9AAGGGCAGCCTGTCTGTGCTC(SEQIDNO:408)100MGCTGGCCMGTCCTGGCCC(SEQIDNO:409)101AAGTCCTGGCCCACCCTGMC(SEQIDNO:410)102AACACCCTCATCMGATCATC(SEQIDNO:4")103AAGATCATCGGGMCTCCGTG(SEQIDNO:412)104AACTCCGTGGGGGCCCTGGGC(SEQIDNO:413)105AACCTGACCTTTATCCTGGCC(SEQIDNO:414)106AAAGCAGCTTCTCTCAGAGGA(SEQIDNO:415)107MGGACGGCGTCTCCGTGTGG(SEQIDNO:416〉108AACGGCGAGAAGCTCCGCTGG(SEQIDNO:417)109MGCTCCGCTGGCACATGTGT(SEQIDNO:418)110AATCCTCTGCGGGGAGTGGAT(SEQIDNO:419)111AACATGTOGGTCTGCATGC3AG(SEQIDNO:420)112AAATCCATCTGCCTCATCCTC(SEQIDNO:421)113MCCTAGTGC3TGCTCAACCTT(SEQIDNO:422)114MCCTTTTCATCGCTTTACTG(SEQIDNO:423)115MCTCCTTCAGCGCGGACMC(SECHDNO:424)116AACCTCACGGCTCCAGAGGAT(SEQIDNO:425)117AACMCTTGCAGTTAGCACTG(SEQIDNO:426)118MCTTGCAGTTAGCACTGGCC(SEQIDNO:427)119AAGGTGGAGACCCAGCTCGGC(SEQIDNO:428)120MGCCCCCACTCACCAGCTCA(SEQIDNO:429)121AAGAACCACATTGCCACTGAT(SEQIDNO:43D)122AACCACATTGCCACTGATGCT(S￡QIDNO:431)123MCCTGACAAAGCCAGCTCTC(SEQIDNO:432)124MAGCCAGCTCTCAGTAGCCC(SEQIDNO:433)125AAGGAGAACCACGGGGACTTC(SEQIDNO:434)126AACCACGGGGACTTCATCACT(SEQIDNO:435)127MCGTGTGGGTCTCTGTGCCC(SEQIDNO:436)128MTCTGACCTCGACGAGCTCG(SEQIDNO:437)129MGATATGGAGCAGGCTTCGC(SEQIDNO:438)130MGAGGACCCCMGGGACAGC(SEQIDNO:439)131MGGGACAGCAGGAGCAGTTG(SEQIDNO:440)132MGTCCAAAAGTOTGAAAACC(SEQIDNO:441)133MAAGTGTGAAMCCACCAGG(SEQIDNO:442)134MGTGTGAAAACCACCAGGCA(SEQIDNO:443)135AAAACCACCAGGCAGCCAGAA(SEQIDNO:444)136AACCACCAGGCAGCCAGAAGC(SEQIDNO:445)137AAGCCCAGCCTCCATGATGTC(SEQIDNO:446)133AAGAGGAAGGATAGCCCTCAG(SEQIDNO:447)139AAGGATAGCCCTCAGGTCCCT(SEQIDNO:448)140AAATCCTGAGGAAGATCCCCG(SEQIDNO:449)141MGATCCCCGAGCTGGCAGAT(SEQIDNO:450)142MGGCTGCACTCGCCGCTGTC(SEQIDNO:451)143MCGTGMTACTAGCAAGTCT(SEQIDNO:452)144MTACTAGCAAGTCTCCTTGG(SEQHDNO:453)145AAGTCTCCTTGGGCCACAGGG(SEQIDNO:454)146MGACCTGCTACGGCATCGTG(SEQIDNO:455)147MCTACCTGGMGAGAAACCC(SEQIDNO:456^148MGAGAMCCCCGAGTGMGT(SEQIDNO:457)149AMCCCCGAGTGMGTCCGTG(SEQIDNO:458)150AAGTCCGTGCTGGAGTACACT(SEQIDNO:459)151MGTGGGTAGCCTATGGCTTC(SEQIDNO:460)152AAAMGTATTTCACCAATGCC(SEQIDNO:461)153AAAGTATTTCACCAATGCCTG(SEQIDNO:462)154AATGCCTGGTGCTGGCTGGAC(SEQIDNO:453)155AACATCTCCCTGACMGCCTC(SEQIDNO:464)156AAGCCTCATAGCGAAGATCCT(SEQIDNO:465)AAGATCCTTGAGTATTCCGAC(SEQIDNO:466)AAAGCCCTTCGGACTCTCCGT(SEQIDNO:467)AAGGCATGAGGGTAGTGGTGG(SEQIDNO:468)MCGTCCTCCTCGTCTGCCTC(SEQIDNO:469)MCCTCTTCGCCGGGAAATTT(SEQIDNO:AAATTTTCGMGTGCGTCGAC(SEQIDNO:47"AAGTGCGTCGACACCAGAMT(SEQIDNO:472)AAATAACCCATTTTCCMCGT(SEQIDNO:473)AACCCATTTTCCAACGTGMT(SEQ10NO:474)AACGTGAATTCGACGATGGTG(SEQIDNO:475)AATTCGACGATGGTGMTMC(SEQIDNO:476)AATMCAAGTCCGAGTGTCAC'(SEQ'DNO:477)MCMGTCCGAGTGTCACMT(SEQIDNO:478)MGTCCGAGTC5TCACAATCM(SEQIDNO:479)MTCAAMCAGCACCGGCCAC(SEQIDNO:480)AAAACAGCACCGGCCACTTCT(SECHDNO:48"AACAGCACCGGCCACTTCTTC(SEQIDNO:482)AACGTCAMGTCAACTTCGAC(SEQIDNO:483)AAAGTCMC丌CGACMCGTC(SEQIDNO:484;AACTTCGACAACGTCGCTATG(SEQIDNO:485)AACGTCGCTATGGGCTACCTC(SEQIDNO:486)AACCTTCAAAGGCTGGATGGA(SEQIDNO:487)AAAGGCTGGATGGACATAATG(SEQ,DNO:頓)AATGTATGCAGCTGTTGATTC<SEQIDNO:489)MCAGTCAGCC丁MCTGGGAG(SEQIDNO:4恥〉A(chǔ)ACTGGGAGAACMCTTGTAC(SEQIDNO:491)AACAACTTGTACATGTACCTG(SEQIDNO:492)AACTTGTACATGTACCTGTAC(SEQIDNO:493)AATCTCTTTGTTGGGGTCATA(SEQIDNO:494)AATCGACAACTTCAACCMCA^SEQIDNO:495)AACTTCAACCMCAGAAAAAA(SEQIDNO:496JAACCAACAGAAAAMAAGCTA(SEQIDNO:497)AACAGMAAAAMGCTAGGAG(SEQIDNO:498)AAAAMAAGCTAGGAGGCCAG(SEQIDNO:499)AAAAAAGCTAGGAGGCCAGGA(SEQIDNO:500)AAAAGCTAGGAGGCCAGGACASEQ'DNO:501)MGCTAGGAGGCCAGGACATC(SEQIDNO:502)AAGAGCAGMGMGTACTACA(SEQIDNO:503)MGMGTACTACMTGCCATG(SEQIDNO:504)AAGTACTACAATGCCATGAAG(SEQIDNO:505)AATGCCATGAAGAAGCTGGGC(SEQIDNO:506)AAGAAGCTGGGCTCCAAGAM(SEQIDNO:507;AAGCTGGGCTCCAAGAAACCC^SEQIDNO:508)MGAAACCCCAGMC5CCCATC(S￡QIDNO:509;AAACCCCAGAAGCCCATCCCA(SEQIDNO:510)MGCCCATCCCACGGCCCCTG(SEQIDNO:5")MTMGTACCMGGCTTCGTG(SEQIDNO:512)AAGTACCAAGGCTTCGTGTTT(SEQIDNO:513)AAGGCTTCGTGTTTCSACATCG(SEQIDNO:514)MGCCTTTGACATCATCATCA<SEQIDNO:515)AACATGATCACCATGATGGTG(SEQIDNO:516)MGACGAAGGTTCTGGGCAGA(SEQIDNO:517)AAGG丌CTGGGCAGAATCAAC(SECHONO:518)AATCMCCAG丌CTTTGTGGC(SEQIDNO:519)AACCAGTTCTTTGTGGCCGTC(SEQIDNO:520)AAGATGTTCGCCCTGCGACAG(SEQIDNO:521).AACGGCTGGMCGTGTTCGAC(SEQIDNO:522)AACGTGTTCGACTTCATAGTG<SEQIDNO:523)AATCCTTAAG丁CACTGGMAA(SEQIDNO:524)AAGTCACTGC3AAAACTACTTC(SEQIDNO:525)AAAACTACTTCTCCCCGACGC(SEQ舊NO:528)AACTACTTCTCCCCGACGCTC(SEQIDNO:527)AAGGGGATTCGCACGCTGCTC(SEQIDNO:528)MCATCGGCCTCCTCCTCTTC(SEQIDNO:529)MCGTCGTGGACGAGGCCGGC(SEOIDNO:530)AACTTCMGACCTTTGGCAAC(SEQIDNO:53"AAGACCTTTGGCAACAGCATG(SEQIDNO:532)AACAGCATGCTGTGCCTGTTC(SEQIDNO:533)'AACACGGGGGCTCCCTACTGC(SEQIDNO-534)AACCTGCCCAACAGCAACGGC(SEQIDNO:535;AACAGCMCGGCTCCCGGGGG(SEQIDNO:536)AACGGCTCCCGGGGGMCTGC(SEQIDNO:537;AACTGCGGGAGCCCGGCGGTCS(SEQIDNO:538)AACATGTACATCGCAGTGATT(SEQIDNO:539)AACTTCAACGTGGCCACCGAG<SEQIDNO:540)AACGTGGCCACCGAGGAGAGC(SEQIDNO:541)AAGTTCGACCCGGAGGCCACC(SEQIDNO:542)AAYcCCCAAACCCAACCAGM(SEQIDNO:543)AAACCCAACCAGAATATATTA(SEQIDNO:544)AACCAGMTATATTMTCCAG(SEQ,DNO:545)AATATATTMTCCAGATGGAC(SEQ舊NO:546)MTCCAGATGGACCTGCCGTT(SEQIDNO:547)AAGATCCACTGTCTGGACATC(SEQIDNO:548)AAAGMCGTCTTGGGAGAATC(SEQIDNO:549)MCGTCTTGGGAGAATCCGGG(SEQIDNO:550)AATCCGGGGAGTTGGACTCCC(SEQIDNO:551)AAGACCAATATGGAAGAGAAG(SEQIDNO:552)AATATGGMGAGMGTTTATG(SEQIDNO:553)MGAGMGTTTATC3GCGACCA(SEQIDNO:554)AAGTTTATGGCGACCMTCTC(SEQIDNO:555)MTCTCTCCAAAGCATCCTAT(SEQIDNO:556)MAGCATCCTATGMCCMTA(SEQIDNO:557)AACCMTAGCCACCACCCTCC(SEQIDNO:558)AATAGCCACCACCCTCCGGTG(SEQIDNO:559)AAGCAGGAAGACCTCTCAGCC(SEQIDNO:560)MGACC丁CTCAGCCACAGTCA(SEQIDNO:561)AAAAGGCCTACCGGAGCTACA(SEQIDNO:562)MGGCCTACCGGAGCTACATG(SEQIDNO:563)AACACCCTGCATGTGCCCAGG(SEQIDNO:564)MGGCTACGTTACATTCATGG(SEQIDNO:565)AAACAGTGGACTCCCGGACAA(SEQIDNO:566)AAATCAGAMCTGGGTCTGCT(SEQIDNO:567)222222222222222222222222222222222222222sswsJwwssii;ss^ss3CSSMSC::3sfs:s59..;;M840aJ2713:730509268591680955c^ys6ss明M明ts!35s35SM"SJ559G:477533455923.^-87800002245782t^sM^T^r^TJr,TJ3'444.44444444555555555555555&555_y_J-_^555555JKK5JJJ5JO-5259AAACTGCCTCTGCTACGTCTT(SEQIDNO:568)5726260AACATTMCCCATCTAGCTCA(SEQIDNO:569)5794261AACCCATCTAGCTCAATGCM(SEQIDNO:570)5800262AATGCAAMTGMGATGAGGT(SEQIDN0:57"5814263AAAATGMGATGAG(3TCGCTG(SECMDNO:572)5819264AATGMGATGAGGTCGCTGCT(SEQIDNO:573)5821265MGATGAGGTCGCTGCTMGG(SEQIDNO:574)5825266AAGGMGGAAACAGCCCTGGA(SEQIDNO:575)5842267AAGGAAACAGCCCTGGACCTC<SEQIDNO:576)5846268AAACAGCCCTGGACCTCAGTG(SEQIDNO:577)5850在上述siRNA序列中，選擇5個來檢測其在體外敲減Nav1.8表達(dá)及功能的能力。選擇的5個siRNAs覆蓋了Navl.8編碼序列全部5874個核苷酸的不同區(qū)域。這5個siRNA序列，包括每個序列定位在基因組中的核苷酸位置均列在表4中表4<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例2由QiagenInc.,Valencia,CA合成上述5個選擇的siRNA序列，序列號為SEQIDNOs:1-5。然后我們將Nav1.8cDNA克隆到pcDNA3.1哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，得到cDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒。當(dāng)將對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞(MicrobixBiosystems，Inc.,Ontario,CanadaM8Z3A8)中，細(xì)胞可表達(dá)高水平的Nav1.8RNA和蛋白。沖艮據(jù)說明書通過Taqman⑧定量RT-PCR(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)檢測Nav1.8RNA的表達(dá)。用Nav1.8特異肽抗體SODl(AnaSpec，SanJose，CA)通過western免疫印跡分析檢測HEK293細(xì)胞中Nav1.8蛋白的表達(dá)。用公開的肽序列制備SODl抗體。參見Novakovic等"Distributionofthetetrodotoxin-resistantsodiumchannelPN3inratsensoryneuronsinnormalandneuropathicconditions,J.Neuroscience，vol.18，no.6，pp.2174-2187(1998)。Nav1.8RNA的敲減將5個化學(xué)合成的siRNAs——SEQIDNOs:1-5與pcDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒一起，分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中siRNA終濃度維持在25nM。在轉(zhuǎn)染24小時后，裂解細(xì)胞，從裂解液中通過RNAeasy柱(Qiagen，Valencia,CA)根據(jù)說明書純化總RNA。對從用獨(dú)立的siRNAs共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞中純化的總RNA用大鼠Nayl.8特異的Taqman⑧引物和探針組(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)進(jìn)行定量RT-PCR分析。在該方案中任何大鼠Nav1.8特異引物均應(yīng)可工作。PCR引物的設(shè)計是本領(lǐng)域已知。將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的Nav1.8RNA表達(dá)水平與對照細(xì)胞中的RNA表達(dá)進(jìn)行比較。用pcDNA3.1-Navl.8對照表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞其相對的rNav1.8RNA表達(dá)水平為100%。用pcDNA3.1-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和序列為SEQIDNO:1的siRNA共轉(zhuǎn)染的siRNA1細(xì)胞其相對的rNav1.8RNA表達(dá)水平為20%。用pcDNA3.1-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和序列為SEQIDNO:2的siRNA共轉(zhuǎn)染的siRNA2細(xì)胞其相對的rNav1.8RNA表達(dá)水平為65%。用pcDNA3.1國Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和序列為SEQIDNO:3的siRNA共轉(zhuǎn)染的siRNA3細(xì)胞其相對的rNav1.8RNA表達(dá)水平為30%。用pcDNA3.1-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和序列為SEQIDNO:4的siRNA共轉(zhuǎn)染的siRNA4細(xì)胞其相對的rNav1.8RNA表達(dá)水平為115%。用pcDNA:3.1-Na4.8對照表達(dá)質(zhì)粒和序列為SEQIDNO:5的siRNA共轉(zhuǎn)染的siRNA5細(xì)胞其相對的rNav1.8RNA表達(dá)水平為70%。用siRNA1或siRNA3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的Nav1.8RNA沉默，而用siRNA2和siRNA5共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出中等水平的RNA沉默。在用siRNA4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有觀察到Navl.8表達(dá)的敲減。Navl.8蛋白的敲減將5個化學(xué)合成的siRNAs——SEQIDNOs:1-5與pcDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒一起，分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中siRNA終濃度維持在25nM。在轉(zhuǎn)染24小時后，在變性裂解緩沖液中裂解細(xì)胞，將裂解液在變性12°/。TBE膠(Invitrogen，Carsbad,CA)中進(jìn)行電泳。將膠印跡在硝酸纖維素膜上，并用Nav1.8特異抗體SOD1(AnaSpec，SanJose,CA)進(jìn)行檢測。pcDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞的裂解液表現(xiàn)出高水平Nav1.8蛋白的表達(dá)。pcDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和siRNA1或siRNA3所共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解液表明Navl.8蛋白的表達(dá)幾乎完全消失。pcDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和siRNA2或siRNA5所共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解液表現(xiàn)出中等水平的Nav1.8蛋白的表達(dá)。pcDNA-Nav1.8對照表達(dá)質(zhì)粒和siRNA4所共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解液表明Nav1.8蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有降低。實施例3然后，我們測定了siRNA是否能有效敲減Nav1.8鈉通道。使用FlexStation⑧檢測法(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)和電壓鉗檢測法進(jìn)行該測定法。我們通過反轉(zhuǎn)錄病毒的整合，在成神經(jīng)細(xì)胞瘤/DRG融合細(xì)胞系ND7/23(EuropeanCollectionofCellCultures,Wiltshire,UK)中穩(wěn)定表達(dá)Nav1.8編碼序列。ND7/23細(xì)胞系是大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤和小鼠神經(jīng)細(xì)胞的雜合子，由歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心No.92090卯3鑒定。該ND7/23-Nav1.8細(xì)胞系在FlexStation⑧膜電位檢測法和全細(xì)胞電壓鉗檢測法中均表現(xiàn)出持續(xù)的高水平Nav1.8鈉電流。FlexStation⑧檢測法我們將上述5個選擇的siRNA序列——SEQIDNOs:1-5分別轉(zhuǎn)染到ND7/23-Nav1.8細(xì)胞系中。根據(jù)說明書在FlexStation@上通過膜電位檢測法來驗證siRNAs對Navl.8功能的敲減。用獨(dú)立的siRNAs轉(zhuǎn)染1天后在FlexStation⑧上讀數(shù)。將對照細(xì)胞的發(fā)光水平與用siRNAsl-5獨(dú)立轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的發(fā)光水平進(jìn)行比較。所有細(xì)胞均用Nav1.8編碼序列轉(zhuǎn)染。對照細(xì)胞表現(xiàn)出的發(fā)光水平為175,000單位。用序列為SEQIDNO:1的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA1細(xì)胞其發(fā)光水平為48，000單位。用序列為SEQIDNO:2的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA2細(xì)胞其發(fā)光水平為70,000單位。用序列為SEQIDNO:3的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA3細(xì)胞其發(fā)光水平為45,000單位。用序列為SEQIDNO:4的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA4細(xì)胞其發(fā)光水平為1M，000單位。用序列為SEQIDNO:5的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA5細(xì)胞其發(fā)光水平為80，000單位。siRNAsl和3阻斷Navl.8來源的膜電位，而siRNAs2和5表現(xiàn)出對膜電位中等水平的阻斷。siRNA4對膜電位的阻斷水平最小或沒有。每個siRNAs對膜電位的阻斷水平與siRNAs在HEK293系統(tǒng)中的蛋白和RNA沉默水平是相似的。在本實驗的另一個實施例中，對照細(xì)胞表現(xiàn)出的發(fā)光水平為198,698單位。用序列為SEQIDNO:1的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA1細(xì)胞其發(fā)光水平為46,068單位(相當(dāng)于對照信號的23%)。用序列為SEQIDNO.'2的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA2細(xì)胞其發(fā)光水平為71，523單位(相當(dāng)于對照的36%)。用序列為SEQIDNO:3的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA3細(xì)胞其發(fā)光水平為42,422單位(相當(dāng)于對照的21%)。用序列為SEQIDNO:4的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA4細(xì)胞其發(fā)光水平為151,067單位(相當(dāng)于對照信號的76%)。用序列為SEQIDNO:5的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA5細(xì)胞其發(fā)光水平為80,567單位(相當(dāng)于對照信號的41%)。電壓鉗測定法為了進(jìn)一步Navl.8鈉電流功能的敲減，我們在用siRNA1轉(zhuǎn)染的ND7/23-Navl.8對照細(xì)胞中進(jìn)行了全細(xì)胞電壓鉗測定。簡要來說，用非沉默siRNAs假轉(zhuǎn)染ND7/23-Nav1.8細(xì)胞作為對照細(xì)胞，或用siRNA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到siRNA1細(xì)胞。siRNA1濃度維持在25nM。通過與綠色熒光蛋白(GFP)(CIontech，PaloAlto，CA)共轉(zhuǎn)染所鑒定的成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被用來進(jìn)行全細(xì)胞電壓鉗測定。測定在轉(zhuǎn)染后24和48小時后進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染24小時后，對照細(xì)胞表現(xiàn)出的峰幅值為-900，而siRNA1細(xì)胞的峰幅值為-175。在轉(zhuǎn)染48小時后，對照細(xì)胞表現(xiàn)出的峰幅值為-775，而siRNA1細(xì)胞的峰幅值為-175。因此，我們在siRNAl轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到鈉電流幾乎完全阻斷。實際上，阻斷大于85%。另外，可通過在siRNA1處理的ND7/"-Nav1.8細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)對河豚毒素敏感的電流的阻斷來確定Nav1.8阻斷的特異性。在另一個實施例中，在轉(zhuǎn)染24小時后，對照細(xì)胞(樣品大小=10)表現(xiàn)出的平均峰全細(xì)胞Nav1.8電流幅值為力UpA，而siRNAl細(xì)胞(樣品大小-ll)的平均峰幅值為-l仍pA。因此，在轉(zhuǎn)染24小時后，siRNA1將Nav1.8電流幅值降低到對照的18.5%。另外，可通過在siRNA1處理的ND7/23-Nav1.8細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染24小時或48小時后沒有發(fā)現(xiàn)河豚毒素敏感的鈉電流幅值的降低來確定siRNA的特異性。實施例4為了鑒定可高水平敲減Nav1.8的備份siRNAs，我們在覆蓋siRNA1和siRNA3的Nav1.8編碼區(qū)設(shè)計了另外6條siRNAs,序列為SEQIDNOs:6-ll。這另外6條siRNAs的設(shè)計與實施例l使用的程序相同，具有以下序列，如下表5所示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>所有這6條另外的siRNAs——SEQIDNOs:6-11均在ND7/23細(xì)胞中篩選其敲減Navl.8來源的膜電位的能力。使用與實施例3相似的程序，將對照細(xì)胞的發(fā)光水平與分別用siRNAs6-11轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的發(fā)光水平進(jìn)行比較。對照細(xì)胞的發(fā)光水平為175,000單位。用序列為SEQIDNO:6的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA6細(xì)胞的發(fā)光水平為85，000單位。用序列為SEQIDNO:7的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA7細(xì)胞的發(fā)光水平為50,000單位。用序列為SEQIDNO:8的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA8細(xì)胞的發(fā)光水平為45,000單位。用序列為SEQIDNO:9的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA9細(xì)胞的發(fā)光水平為43,000單位。用序列為SEQIDNO:10的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA10細(xì)胞的發(fā)光水平為10，000單位。用序列為SEQIDNO:11的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA11細(xì)胞的發(fā)光水平為35,000單位。用與實施例2和3相似的程序，我們確i人了所有6個siRNAs也可阻斷Nav1.8的表達(dá)和功能，從而獲得有效的siRNAs組。在另一個實施例中，對照細(xì)胞的發(fā)光水平為198,698單位。用序列為SEQIDNO:6的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA6細(xì)胞的發(fā)光水平為86，105單位(對照細(xì)胞的43%)。用序列為SEQIDNO:7的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA7細(xì)胞的發(fā)光水平為50,237單位(對照細(xì)胞的25%)。用序列為SEQIDNO:8的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA8細(xì)胞的發(fā)光水平為44,038單位(對照細(xì)胞的22%)。用序列為SEQIDNO:9的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA9細(xì)胞的發(fā)光水平為46,917單位(對照細(xì)胞的24%)。用序列為SEQIDNO:10的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNAIO細(xì)胞的發(fā)光水平為21,847單位(對照細(xì)胞的7%)。用序列為SEQIDNO:11的siRNA轉(zhuǎn)染的siRNA11細(xì)胞的發(fā)光水平為30,587單位(對照細(xì)胞的15%)。實施例5Nav1.8siRNA的腺病毒給藥為了將siRNA長期遞送到細(xì)胞中并敲減Nav1.8的功能，我們設(shè)計了啟動siRNA表達(dá)的腺病毒載體。簡要來說，構(gòu)建體設(shè)計為在U6啟動子表達(dá)盒調(diào)控下表達(dá)siRNA3(SEQIDNO:3)。然后將siRNA3表達(dá)盒克隆到缺失El的pTG"l3腺病毒載體(TransgeneSA，F(xiàn)rance)中。用上述siRNA3腺病毒載體構(gòu)建體以1^顆粒/ml轉(zhuǎn)染實施例3中的ND7/23-Nav1.8細(xì)胞。對照細(xì)胞用相同濃度的含U6啟動子表達(dá)盒的對照腺病毒進(jìn)行感染。將感染的細(xì)胞裂解，純化總RNA，以進(jìn)行Taqrnan⑧檢測或FlexStation⑧檢測。對Taqrnan⑧檢測而言，感染的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染6、8和10天后(dpi)進(jìn)行裂解，從裂解液中純化RNA，并通過定量RT-PCR分析測定Nav1.8的表達(dá)。在感染6天后，以非沉默腺病毒siRNA的百分比表示，Navl.8RNA的表達(dá)是18。/。。在感染8天后，以非沉默腺病毒siRNA的百分比來表示，Nav1.8RNA的表達(dá)是22%。在感染10天后，以非沉默腺病毒siRNA的百分比來表示，Nav1.8RNA的表達(dá)是30%。對FlexStation⑧檢測而言，轉(zhuǎn)染2、4、6、8和10天后(dpi)，在FlexStation⑧上測定感染細(xì)胞的Nav1.8來源的膜電位。在每個時間點，將在siRNA3腺病毒載體構(gòu)建體感染的細(xì)胞中的膜電位的敲減，與對照腺病毒感染的細(xì)胞的膜電位進(jìn)行比較。在轉(zhuǎn)染2天后，與非沉默腺病毒siRNA相比較，百分比鈉電流是4"/。。在轉(zhuǎn)染4天后，與非沉默腺病毒siRNA相比較，百分比鈉電流是15%。在轉(zhuǎn)染6天后，與非沉默腺病毒siRNA相比較，百分比鈉電流是8%。在轉(zhuǎn)染8天后，與非沉默腺病毒siRNA相比較，百分比鈉電流是8%。在轉(zhuǎn)染IO天后，與非沉默腺病毒siRNA相比較，百分比鈉電流是4%。為了進(jìn)一步確定在病毒siRNA構(gòu)建體中RNA表達(dá)的降低就是表示功能性Nav1.8鈉通道活性的衰減，我們進(jìn)行了多個全細(xì)胞電壓鉗實驗，以在多個感染后時間點直接測定Navl.8介導(dǎo)的電流。在每個這些實驗中，測定已用對照、非沉默siRNA構(gòu)建體或腺病毒-siRNA3構(gòu)建體感染的ND7/23-Nav1.8細(xì)胞樣品的電流幅值。在用非沉默病毒構(gòu)建體感染4天后，總平均(10個細(xì)胞樣品)全細(xì)胞Nav1.8電流是-821pA，而在siRNA3病毒感染的細(xì)胞中測定的為-101pA(相當(dāng)于對照的12.3%)。在用非沉默病毒構(gòu)建體感染6天后，總平均(IO個細(xì)胞樣品)全細(xì)胞Navl.8電流是-932pA，而在siRNA3病毒感染的細(xì)胞中測定的為-247.7pA(相當(dāng)于對照的26.6%)。在用非沉默病毒構(gòu)建體感染10天后，總平均(10個細(xì)胞樣品)全細(xì)胞Nayl.8電流是-976.7pA，而在siRNA3病毒感染的細(xì)胞中測定的為-542.7pA(相當(dāng)于對照的55.6%)。因此，Taqrnan⑧和FlexStation⑧及電壓鉗檢測均表明Nav1.8RNA表達(dá)和Nav1.8來源的膜電位的敲減至少可持續(xù)8dpi。通過siRNA表達(dá)腺病毒的感染可導(dǎo)致至少80%的Navl.8表達(dá)和功能的敲減。因此，用病毒載體遞送siRNA可高水平對Nav1.8進(jìn)行持續(xù)阻斷。實施例6Nav1.8siRNA在大鼠慢性疼痛模型中的作用用siRNA3考察了Navl.8-siRNA在大鼠慢性疼痛模型中的作用。用分級von-Frey微纖絲(gradedvon-Freymicrofilaments)效，J定一群鼠的后爪觸覺靈敏性(-基線靈敏性)。然后將同樣的大鼠進(jìn)行外科手術(shù)，在股中部暴露其左側(cè)坐骨神經(jīng)，然后用標(biāo)準(zhǔn)的縫合材料松散地縫合傷口。當(dāng)傷口愈合后，在進(jìn)行任何隨后的行為評估前，先使動物恢復(fù)至少1周。手術(shù)造成的神經(jīng)損傷可導(dǎo)致在左后爪具有觸覺超敏感性一一即稱為觸痛覺超敏的疾病。痛覺超敏的程度可按照與基線測定相同的von-Frey微纖絲(von-Freyfilaments)程序來定量，這種測定在手術(shù)后進(jìn)行13天。為了評估siRNA3(SEQIDNo:3)對痛覺超敏的作用，將siRNA以雙鏈體形式通過永久性內(nèi)部鞘內(nèi)導(dǎo)管遞送到脊索周圍的鞘內(nèi)空間。在3天的時間里，每天分別注射2次2pgsiRNA3，對照大鼠僅用栽體通過相同的時間程序進(jìn)行處理。在這些實驗中所用的基線后爪靈敏性的范圍在13到15克力。在神經(jīng)損傷13天后，對每只大鼠重新測定其后爪靈敏性，發(fā)現(xiàn)在命名為siRNA的組中范圍是1.2+-0.4g，在對照組是2.1+-0.4g(組的大小=藥物處理組有6只大鼠，對照組有5只大鼠)因此，神經(jīng)損傷可導(dǎo)致深刻的疼痛觸覺超靈敏性(痛覺超敏)，這是在患有慢性神經(jīng)性疼痛疾病的人類患者中的典型癥狀。定期評估表明在僅接受栽體注射的對照組中疼痛的痛覺超敏癥狀持續(xù)(典型地〈2.1g)13天到21天。相反，在13天的評估后立即注射3天siRNA3的鼠，表現(xiàn)出疼痛的痛覺超敏(8.1+-2.1g，在第16天評估)的顯著逆轉(zhuǎn)。與對照相比較，用siRNA3處理的鼠在進(jìn)行測定的隨后幾天中具有持續(xù)提高的疼痛分值(例如，改善了實驗誘導(dǎo)的慢性疼痛癥狀)。權(quán)利要求1.一種分離的或重組的短干擾核酸或其類似物，其中，所述的短干擾核酸含有選自SEQIDNOs1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1的分離的或重組的短干擾核酸，其包含選自SEQIDNOs:l、2、3、5、9和10的核苦酸序列。3.權(quán)利要求1的分離的或重組的短干擾核酸，其進(jìn)一步包含3'突出"^fi^04.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或3的短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的栽體。5.權(quán)利要求1或3的分離的或重組的短千擾核酸，其進(jìn)一步包含其互補(bǔ)的核苷酸序列。6.權(quán)利要求5的互補(bǔ)核苷酸序列，進(jìn)一步包含3'突出端。7.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求5或6的短干擾核酸和其互補(bǔ)核苷酸序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。8.權(quán)利要求5的分離的或重組的短干擾核酸，其中所述核苷酸序列和所述互補(bǔ)核苷酸序列可雜交形成雙鏈體。9.權(quán)利要求8的雙鏈體，其中所述核苷酸序列進(jìn)一步包含3，突出端，而且所述互補(bǔ)核苦酸序列進(jìn)一步包含3，突出端。10.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的雙鏈體以及藥學(xué)上可接受的載體。11.一種含有義鏈和反義鏈的分離的或重組的短干擾核酸，其中所述有義鏈和所述反義鏈可雜交形成雙鏈體，其中所述有義鏈含有與靶序列基本同一的核苷酸序列，其中所述靶序列選自SEQIDNOs:12-577。12.權(quán)利要求11的雙鏈體，其中所述有義鏈進(jìn)一步包含3，突出端，所述反義鏈進(jìn)一步包含3，突出端。13.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求11或12的雙鏈體以及藥學(xué)上可接受的載體。14.一種含權(quán)利要求1或3的核苷酸序列的重組載體。15.—種抑制mRNA翻譯為多肽的方法，包括將可表達(dá)Nav1.8mRNA的細(xì)胞與權(quán)利要求1或3的短干擾核酸相接觸。16.—種抑制多肽表達(dá)的方法，包括將可表達(dá)Nav1.8多肽的細(xì)胞與權(quán)利要求1或3的短干擾核酸相接觸。17.—種阻斷細(xì)胞中膜電位的方法，包括將表達(dá)Nav1.8多肽的細(xì)胞與權(quán)利要求1或3的短干擾核酸相接觸。18.—種阻斷細(xì)胞中鈉電流的方法，包括將表達(dá)Nav1.8多肽的細(xì)胞與權(quán)利要求1或3的短干擾核酸相接觸。19.一種抑制慢性疼痛的方法，包括對患者給藥有效劑量的權(quán)利要求4、7、10或13的藥物組合物。20.權(quán)利要求1或3的一個或多個短干擾核酸在制備抑制慢性疼痛的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了可導(dǎo)致Na_v1.8鈉通道基因的mRNA發(fā)生RNAi誘導(dǎo)降解的單鏈或雙鏈短干擾核酸，含這種短干擾核酸的藥物組合物；含這種短干擾核酸的重組載體；抑制mRNA翻譯的方法；抑制多肽表達(dá)的方法；阻斷細(xì)胞膜電位的方法；阻斷細(xì)胞鈉電流的方法；及抑制慢性疼痛的方法。文檔編號A61K48/00GK101103112SQ200580045090公開日2008年1月9日申請日期2005年10月26日優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日發(fā)明者J·C·亨特,S·戈爾高克,T·普里斯特利申請人:先靈公司;坎吉有限公司