本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病或疼痛或二者的化合物。

發(fā)明背景

美國專利公開號US20120295863公開了用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的、靶向腺苷A2A受體和腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)體的雙重作用化合物。一種命名為CGS21680(縮寫CGS)的選擇性A_2A腺苷受體(A_2AR)激動劑，已表明在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中能夠減輕亨廷頓氏舞蹈病(HD)癥狀，并通過提高泛素-蛋白酶系統(tǒng)的活性來拯救HD疾病的尿素循環(huán)缺陷(Chiang等.,2009Hum Mol Genet.18:2929-2942；Chou等.,2005J Neurochem.93:310-320)。然而，已知CGS具有強(qiáng)的免疫抑制作用和其它副作用，因此不適合臨床使用。

N⁶-(4-羥基芐基)腺苷，在US20120295863中命名為T1-11并也是一種A_2AR激動劑，已表明在治療神經(jīng)退行性疾病上具有治療潛力。然而由于其生物利用度差(F<5％)，因此T1-11開發(fā)為一種可口服的藥物仍然困難。口服生物利用度是藥物開發(fā)中的一個重要性質(zhì)，因?yàn)樗砦镔|(zhì)被吸收和代謝后，到達(dá)系統(tǒng)循環(huán)的百分比。

發(fā)明概要

一方面，本發(fā)明涉及式(I)或(IA)化合物：

或其藥學(xué)上可接受鹽，其中X為鹵素。

鹵素(F,Cl,Br或I)在式(I)中可位于3-、4-或5-位，或在式(IA)中位于2-、4-或5-位。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，化合物選自下組：N⁶-[(3-鹵代噻吩-2-基)甲基]腺苷、N⁶-[(4-鹵代噻吩-2-基)甲基]腺苷、和N⁶-[(5-鹵代噻吩-2-基)甲基]腺苷。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，化合物選自下組：N⁶-[(2-鹵代噻吩-3-基)甲基]腺苷、N⁶-[(4-鹵代噻吩-3-基)甲基]腺苷、和N⁶-[(5-鹵代噻吩-3-基)甲基]腺苷。

進(jìn)一步在本發(fā)明另一個實(shí)施例中，化合物選自下組：N⁶-[(5-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷、N⁶-[(4-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷、N⁶-[(3-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷、N⁶-[(5-氯噻吩-2-基)甲基]腺苷、N⁶-[(4-氯噻吩-2-基)甲基]腺苷、和N⁶-[(3-氯噻吩-2-基)甲基]腺苷。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，化合物選自下組：N⁶-[(2-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷、N⁶-[(4-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷、N⁶-[(5-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷N⁶-[(2-氯噻吩-3-基)甲基]腺苷、N⁶-[(4-氯噻吩-3-基)甲基]腺苷,和N⁶-[(5-氯噻吩-3-基)甲基]腺苷。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種制備如上所提到的式(I)或式(IA)化合物的方法，包括步驟(I)或(II)：

(I):

(a)在堿存在下，將6-氯嘌呤呋喃核糖苷與式3或3A所示的氟、氯、溴或碘取代的(噻吩基)甲胺進(jìn)行反應(yīng)，

從而得到式(I)或(IA)化合物；或

(II):

(a1)在堿存在下，將(2',3'-O-亞異丙基)腺苷與羥基保護(hù)試劑進(jìn)行反應(yīng)，從而得到具有羥基保護(hù)基的(2',3'-O-亞異丙基)腺苷衍生物；

(b)將具有羥基保護(hù)基的(2',3'-O-亞異丙基)腺苷衍生物與胺基保護(hù)試劑進(jìn)行反應(yīng)，從而得到具有羥基保護(hù)基和胺基保護(hù)基的(2',3'-O-亞異丙基)腺苷衍生物；

(c)將具有羥基保護(hù)基和胺基保護(hù)基的(2',3'-O-亞異丙基)腺苷衍生物與式7或7A所示的含取代的(噻吩基)甲基的化合物進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)：

其中X為F、Cl、Br、或I，和Y為X、OH、甲磺酸基(OSO₂CH₃、OMs)、對甲苯磺酸基(OSO₂C₆H₄-p-CH₃,OTs)、或三氟甲磺酸基(OSO₂CF₃,OTf)，

從而得到包含保護(hù)基和取代的(噻吩基)甲基基團(tuán)的產(chǎn)物；和

(d)在酸性條件下從步驟(c)的產(chǎn)物中除去保護(hù)基，從而得到式(I)或(IA)化合物。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，步驟(a)中的堿可以是二異丙基乙胺。羥基保護(hù)試劑可以是叔丁基二甲基氯硅烷。胺基保護(hù)試劑可以是二碳酸二叔丁酯。步驟(a1)中的堿可以是咪唑。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，步驟(I)(a)中，堿為二異丙基乙胺，而取代的(噻吩基)甲胺為：(i)(5-溴噻吩-2-基)甲胺，從而得到N⁶-[(5-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷；或(ii)(5-氯噻吩-2-基)甲胺，從而得到N⁶-[(5-氯噻吩-2-基)甲基]腺苷。

進(jìn)一步在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，偶聯(lián)反應(yīng)在三苯基膦和偶氮二甲酸二異丙酯存在下進(jìn)行。含取代的(噻吩基)甲基基團(tuán)的化合物可以是(5-溴噻吩-2-基)甲醇。

進(jìn)一步在另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，它包括：

(a)治療有效量的如前述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和

(b)藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或運(yùn)載體。

在另一方面，本發(fā)明涉及如前所述化合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療有此需要的對象中的神經(jīng)退行性疾病和/或疼痛。或者，本發(fā)明涉及如前所述化合物在治療有此需要的對象中的神經(jīng)退行性疾病和/或疼痛的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，神經(jīng)退行性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、朊病毒病、亨廷頓氏舞蹈病和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)。脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)可選自下組：脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)2型、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)7型。疼痛可以是酸誘發(fā)的疼痛。酸誘發(fā)的疼痛可以是酸誘發(fā)的肌肉疼痛。酸誘發(fā)的肌肉疼痛可以是酸誘發(fā)的慢性肌肉疼痛。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，疼痛選自下組：炎癥性疼痛、癌疼痛、胸痛、背痛、頸部疼痛、肩痛、偏頭痛、頭痛、肌筋膜疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉疼痛綜合癥、神經(jīng)病理性疼痛、末梢性神經(jīng)疼痛、交感神經(jīng)痛、術(shù)后疼痛、創(chuàng)傷后疼痛和多發(fā)性硬化癥疼痛。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，疼痛可以是功能失調(diào)性疼痛。功能失調(diào)性疼痛可選自下組：纖維肌痛、肌筋膜疼痛、膀胱疼痛綜合癥，和由腸易激綜合癥所致的疼痛。

基于以下附圖和優(yōu)選實(shí)施例的以下描述的結(jié)合中，可以明顯看出這些方面以及其他方面，盡管可以在不脫離本發(fā)明公開內(nèi)容的新穎概念的精神和范圍的情況下，進(jìn)行各種變化和改動。

所附附圖用于闡述本發(fā)明的一個或多個實(shí)施例，并與書面描述一起解釋本發(fā)明的原理。只要有可能，相同的引用編號在整個附圖中指實(shí)施例中相同或相似的元素。

附圖的簡要說明

圖1顯示了接受T1-11或JMF3464靜脈注射(1mg/kg)或口服(10mg/kg)的ICR小鼠中，T1-11(A)和JMF3464(B)在血液中的濃度。T1-11和JMF3464的口服生物利用度分別估計(jì)為2.8％和17.4％。

圖2顯示了A_2AR激動劑(CGS21680、T1-11、JMF3464和JMF3818)對去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的效果。去血清PC₁₂細(xì)胞用或不用所指定試劑處理24小時。與含血清的對照組的平均值相比，以來自MTT試驗(yàn)結(jié)果的百分?jǐn)?shù)來表示細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示為平均值±SEM(n＝3～6)。

圖3A-B顯示了JMF3464對運(yùn)動障礙和壽命的影響。使用ALZET滲透微泵對指定的7周齡小鼠皮下給藥JMF3464(0.11μg/鼠/天)，JMF1907(0.11μg/鼠/天)或運(yùn)載體(對照，CON)6周。對這些小鼠的轉(zhuǎn)動棒行為(A)和壽命(B)進(jìn)行評估。*p<0.05；***p<0.005。

圖4A-B顯示了T1-11在預(yù)防突變型SCA2基因過表達(dá)誘導(dǎo)的蛋白集聚和SCA2轉(zhuǎn)基因小鼠的行為表現(xiàn)方面的效果。(A)pSCA2-22Q-EGFP或pSCA2-104Q-EGFP-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)10μM T1-11或10μM JMF1907(一種T1-11-衍生的A_2A-R激動劑)處理24小時。收獲細(xì)胞并進(jìn)行過濾阻滯試驗(yàn)或圖像采集。(B)野生型(WT)或轉(zhuǎn)基因小鼠(SCA2)喝含有或不含有T1-11的水。用轉(zhuǎn)動棒行為來測量小鼠的行為功能。

圖5A-C顯示了T1-11改善SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動功能障礙和腦橋神經(jīng)元死亡。(A)在4周齡開始給SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠飲用含運(yùn)載體(0.2％DMSO)或T1-11(0.1mg/ml)的水。轉(zhuǎn)動棒測試表明，相比于野生型(WT)小鼠，運(yùn)載體(vehicle)處理的4月齡的共濟(jì)失調(diào)蛋白(ataxin)-3-Q79轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出明顯更短的落下延遲和動作不協(xié)調(diào)性。T1-11處理的4月齡SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠(每天1mg)的轉(zhuǎn)動棒行為明顯優(yōu)于運(yùn)載體處理的相同年齡的共濟(jì)失調(diào)蛋白-3-Q79小鼠。每個點(diǎn)顯示了7-8只小鼠的平均值+S.E.。(B-C)神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的免疫組化染色表明，T1-11的每日口服給藥(每天1mg)顯著改善了4月齡的SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的腦橋核中的神經(jīng)元死亡(SCA3+T1-11)。比例尺為50μm。每條柱狀顯示7-8只小鼠的平均值+S.E.。與SAC3轉(zhuǎn)基因小鼠相比*P<0.01。

圖6A-C顯示了JMF1907緩解SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的共濟(jì)失調(diào)癥狀和腦橋神經(jīng)元死亡。(A)轉(zhuǎn)動棒試驗(yàn)表明，相比于運(yùn)載體處理的4月齡SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠，JMF1907處理的4月齡SCA3小鼠(每天1mg)的轉(zhuǎn)動棒行為顯著改善。每個點(diǎn)顯示6只小鼠的平均值+S.E.。(B-C)NeuN免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，JMF1907口服給藥(每天1mg)明顯預(yù)防了4月齡SCA3小鼠腦橋核中的神經(jīng)元死亡(SCA3+JMF1907)。比例尺為50μm。每條柱狀顯示6只小鼠的平均值+S.E.。與SAC3小鼠相比，*P<0.01。

圖7A-C顯示了JMF3464改善SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的共濟(jì)失調(diào)和腦橋神經(jīng)元死亡。(A)SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出受損的轉(zhuǎn)動棒行為。每日給藥JMF3464(每天0.3mg)大大改善了4月齡SCA3小鼠的轉(zhuǎn)動棒行為。(B-C)神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的免疫細(xì)胞化學(xué)染色表明，每日口服JMF3464(每天0.3mg)治療顯著改善4月齡SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的腦橋核中的神經(jīng)元死亡。每條柱狀顯示6只小鼠的平均值+S.E.。相比SAC3轉(zhuǎn)基因小鼠，#P<0.01。

圖8A-B顯示了經(jīng)JMF1907處理，改善了TDP-43轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動功能。測試了4種不同劑量的JMF1907(3.7,1.25,0.5,0.1mg/kg)。對照CTL：經(jīng)DMSO處理的轉(zhuǎn)基因小鼠。WT：經(jīng)DMSO處理的野生型小鼠。采用兩因素ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對于轉(zhuǎn)動棒，1.5和0.5mg/kg的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)，0.1mg/kg的12-21周和3.7mg/kg的10-12周的數(shù)據(jù)點(diǎn)，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對于握力，對于所有測試劑量的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。N＝18(CTL)、15(WT)、15(0.1)、15(0.5)、15(1.25)、5(3.7)。

圖9顯示了經(jīng)JMF3464處理降低了NSC34細(xì)胞中TDP-43錯誤定位。細(xì)胞經(jīng)JMF3464(30μM)預(yù)處理1小時，然后在JMF3464存在下用AICAR(1mM,Al)再處理24小時。通過免疫染色對TDP-43(紅色)定位進(jìn)行分析。細(xì)胞核位置由Hochest(藍(lán))標(biāo)記。

圖10A-C顯示了JMF3464對小鼠纖維肌痛模型的鎮(zhèn)痛效果。(A-1和A-2)T1-11口服給藥顯示對小鼠纖維肌痛模型沒有鎮(zhèn)痛效果，其中肌內(nèi)酸注射和染料木黃酮處理后，小鼠發(fā)展為慢性肌肉疼痛。空心箭頭表示小鼠接受酸注射的時間。黑色箭頭表示小鼠接受Tl-11(口服)的時間。(B)JMF3464顯示了對小鼠纖維肌痛模型的鎮(zhèn)痛效果，其中在經(jīng)間歇冷應(yīng)激處理2天后，小鼠發(fā)展為慢性彌漫性疼痛。JMF3464的鎮(zhèn)痛效果是劑量依賴性的。有效劑量起始于100μg/kg(i.p.)。(C)JMF3464口服給藥(1mg/kg)顯示出對間歇冷應(yīng)激模型的鎮(zhèn)痛效果。

發(fā)明詳細(xì)說明

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有相同的含義，該含義是本發(fā)明涉及領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的。在沖突的情況下，本文(包括其定義)優(yōu)先。

術(shù)語“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指對有此需要的對象施用有效量的治療試劑，目的是治愈、減輕、緩解、補(bǔ)救、改善，或預(yù)防所述疾病和/或疼痛，所述疾病和/或疼痛的癥狀，或所述疾病和/或疼痛的傾向，而該對象具有神經(jīng)退行性疾病和/或疼痛，或有這種疾病和/或疼痛的癥狀或傾向。這樣的對象可通過健康護(hù)理專業(yè)人士依據(jù)任何合適的診斷方法的結(jié)果加以確定。

“有效量”是指賦予治療對象療效所需要的活性化合物的量。如那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，有效劑量可有所不同，這取決于施用途徑、賦形劑的使用，和與其他治療處理共同使用的可能性等。

美國食品與藥品管理局健康與人類服務(wù)部出版的“評估成人健康志愿者治療的臨床試驗(yàn)的安全起始劑量的行業(yè)和評審人指南”公開，一種“治療有效量”可由下面的公式計(jì)算而獲得：

HED＝動物劑量mg/kg×(動物體重kg/人體體重kg)^0.33。

JMF 1907表示化合物N⁶-[2-(吲哚-3-基)乙基]腺苷，其作為化合物6披露在美國專利公開號No.20120295863A1中。

化學(xué)合成

在一種方法中，在堿存在下，將6-氯嘌呤呋喃核糖苷(2)用任選取代的噻吩甲胺(3)進(jìn)行處理，得到所需的式(I)化合物。

例如，二異丙基乙胺被用作堿，在溶劑1-丙醇中，通過加熱，進(jìn)行6-氯嘌呤呋喃核糖苷與(5-溴噻吩-2-基)甲胺的取代反應(yīng)，從而得到N⁶-[(5-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷(JMF3464，結(jié)構(gòu)式1)。

方案1

方案2

在另一種方法中，在堿咪唑存在下，(2'，3'-O-異亞丙基)腺嘌呤(4)用叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)處理，得到硅醚衍生物(5)。6-氨基基團(tuán)被保護(hù)為帶有叔丁氧基羰基(Boc)取代基的氨基甲酸酯6。引入任選取代的噻吩甲基，并在酸性條件下除去所有保護(hù)基后，得到所需式(I)化合物。

例如，使用三苯基膦和偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)，來促進(jìn)化合物6和(5-溴噻吩-2-基)甲醇(化合物7，其中X＝5-溴，Y＝OH)的偶聯(lián)反應(yīng)，從而得到化合物8。在酸性條件下對化合物8中的甲硅烷基、丙酮基和Boc基團(tuán)全面去保護(hù)，從而得到化合物1。

使用相同化學(xué)方法，得到化合物(IA)。

方案3

口服生物利用度

為測量受試化合物的口服生物利用度，在口服(10mg/kg)或靜脈內(nèi)(1mg/kg)給予受試化合物后，從雄性ICR小鼠(6周齡；20-25g)采集血液樣本。在指定時間采集的血液樣本用含0.1％甲酸的甲醇提取，然后將每種提取樣本10μL注入U(xiǎn)PLC-MSMS進(jìn)行定量。結(jié)果(圖1A-B)表明，ICR小鼠中T1-11和JMF34964的口服生物利用度分別為2.8％和17.4％，這表明JMF3464口服吸收比T1-11高6倍多。

JMF3464結(jié)合于A_2AR和ENT1以及保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

我們首先用放射性配體結(jié)合試驗(yàn)，對JMF3464藥理性質(zhì)進(jìn)行表征。表1顯示了T1-11、JMF1907和JMF3464的藥理性質(zhì)。使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合方案，對指定化合物和A_2A腺苷受體(A_2AR)和腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(ENT1)的結(jié)合進(jìn)行表征。如表1所示，JMF3464結(jié)合于A_2AR和腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體1)。JMF3464對A_2AR的親和力與T1-11和JMF1907(T1-11類似物)的親和力相似，然而它對ENT1的親和力比T1-11和JMF1907的親和力好很多。我們的研究還表明，N⁶-[(5-氯噻吩-2-基)甲基]腺苷(JMF3818)也抑制因血清去除所引起的PC12細(xì)胞凋亡。10μM的JMF3818分別抑制54％A_2A受體和96％的腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(ENT1)(圖2)。

表1

JMF3464在HD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中對亨廷頓氏舞蹈病(HD)主要癥狀產(chǎn)生有益的效果

由于A_2AR和ENT1位于紋狀體中并與紋狀體功能有關(guān)，因此我們假設(shè)用JMF3464進(jìn)行長期治療會調(diào)節(jié)HD的進(jìn)展。我們測試了JMF3464在HD轉(zhuǎn)基因小鼠模型(R6/2)中的效果，在該模型中A_2AR激動劑具有有益效果。如轉(zhuǎn)動棒行為(Rotarod performance)所評價的那樣，對小鼠從7周大起添加JMF3464(0.11mg/kg/天)抵消了運(yùn)動協(xié)調(diào)性中進(jìn)行性惡化(圖3A)。通過持續(xù)(長期)的JMF3464治療，被縮短的R6/2小鼠的壽命也有提高。

JMF3464對脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)2型(SCA2)的有益效果

由于活化的蛋白酶體活性可能是A_2AR受體信號通路在預(yù)防突變型Htt集聚或R6/2轉(zhuǎn)基因小鼠中行為表現(xiàn)的機(jī)制(Huang等人,2011PLoS One.6:e20934；Lee等人,2012PLoS One.7:e38865)，因此A_2AR激動劑可能在減輕其他多聚谷氨酰胺疾病(如SCA2)上也具有益處。事實(shí)上，我們的數(shù)據(jù)顯示，T1-11在預(yù)防突變ATXN2集聚(圖4A)和SCA2轉(zhuǎn)基因小鼠(ATAXN2^Q127)的行為表現(xiàn)(圖4B)是有效的，這支持了上述假說?？紤]到JMF3464的生物利用度明顯優(yōu)于T1-11，我們推斷JMF3464也會對SCA2產(chǎn)生有益的效果。

T1-11及其類似物對脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型(SCA3)的有益效果

與野生型小鼠相比，用運(yùn)載體處理的表達(dá)多聚谷氨酰胺-擴(kuò)展型(expanded)共濟(jì)失調(diào)蛋白-3-Q79的SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠，表現(xiàn)出各種共濟(jì)失調(diào)癥狀，包括受損的轉(zhuǎn)動棒行為(rotarod performance)(圖5A和6A)，發(fā)病年齡約為3-4個月。如圖5A和6A所示，4月齡SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)每日口服給藥T1-11(每天1mg)或JMF1907(每天1mg)治療，表現(xiàn)出顯著改善的轉(zhuǎn)動棒行為。與SCA3患病動物相似，在SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的腦橋核中發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡(圖5B和6B)。與轉(zhuǎn)動棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，每日T1-11(圖5B和5C)或JMF1907(圖6B和圖6C)的口服治療，明顯緩解了SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠中腦橋神經(jīng)元死亡(圖5B，5C，6B和圖6C)。這些結(jié)果提供了證據(jù)，即持續(xù)的T1-11或JMF1907口服治療改善SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)和神經(jīng)病理學(xué)表型。

JMF3464具有更高的生物利用度。因此，JMF3464也被期望對SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠中突變型共濟(jì)失調(diào)蛋白-3-Q79誘導(dǎo)的共濟(jì)失調(diào)和神經(jīng)退行性病變具有有益的效果。果然，每日使用JMF3464(每天0.3mg)緩解了SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的共濟(jì)失調(diào)(圖7A)和腦橋神經(jīng)元死亡(圖7B和7C)。

JMF1907和JMF3464對肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的有益效果

如圖8A-B所示，被給予4個不同劑量(3.7,1.25,0.5和0.1mg/kg/天)JMF1907的轉(zhuǎn)基因小鼠，明顯比對照組小鼠在轉(zhuǎn)動棒和握力測試中表現(xiàn)得更好。1.25mg/kg劑量表現(xiàn)出最大的益處。這些數(shù)據(jù)表現(xiàn)出明確的運(yùn)動功能的改善。JMF3464(一種T1-11和JMF1907的類似物)具有更高的生物利用度。因此，JMF3464被期望在ALS小鼠中發(fā)揮有益的效果。用JMF3464對NSC34細(xì)胞進(jìn)行處理，可使得由AMPK活化引起的TDP-43錯誤定位變得正常(圖9)，這將支持以下觀點(diǎn)：JMF3464能夠預(yù)防ALS發(fā)病的起始階段。這些發(fā)現(xiàn)支持：JMF3464對ALS表現(xiàn)出有益效果。

JMF3464對疼痛的有益效果

盡管T1-11(腹腔內(nèi))對2種纖維肌痛小鼠模型(酸誘導(dǎo)的慢性彌漫性疼痛和間歇冷應(yīng)激模型)表現(xiàn)出優(yōu)異的鎮(zhèn)痛效果，但其生物利用度非常低。T1-11口服給藥(高達(dá)2mg/kg)對酸誘導(dǎo)慢性彌漫性疼痛模型沒有表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效果，在該模型中，在肌內(nèi)酸注射和染料木黃酮處理后，小鼠發(fā)展為纖維肌痛樣疼痛(圖10A)。JMF3464(一種T1-11類似物)對纖維肌痛小鼠模型表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效果，在該模型中，在經(jīng)間歇冷應(yīng)激處理2天后，小鼠發(fā)展為慢性彌漫性疼痛(圖10B)。與其良好的生物利用度一致，JMF3464(1mg/kg)口服給藥對間歇冷應(yīng)激模型表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效果(圖10C)。

實(shí)施例1

所有試劑和溶劑為試劑級，并無需進(jìn)一步純化而使用，除非另外說明。四氫呋喃和乙醚從鈉/二苯甲酮中蒸餾，CH₂C1₂從CaH₂中蒸餾。所有空氣或濕氣敏感的實(shí)驗(yàn)在氬氣下操作。所有玻璃容器在烘箱干燥超過2小時并在干燥器中冷卻至室溫后使用。使用聚焦型單模微波裝置(CEM Discover)進(jìn)行微波反應(yīng)。該機(jī)器由連續(xù)聚焦的微波功率輸送系統(tǒng)組成，并且該系統(tǒng)具有操作者可選的功率輸出。

熔點(diǎn)記錄在Yanaco微型儀器中。旋光度在日本JASCO Co.DIP-1000數(shù)字旋光儀中測定。[α]_D值以10^–1度cm²g^–1為單位。紅外(IR)光譜用Nicolet Magna 550-11記錄。NMR譜由Varian Unity Plus-400(400MHz)獲得，化學(xué)位移(δ)以相對于CHCl₃/CDCl₃的δ_Η7.24/δ_C77.0(t中心線)，相對于(CH₃)₂CO/(CD₃)₂CO的δ_Η2.05/δ_C 29.92，相對于CH₃OH/CD₃OD的δ_H3.31/δ_C49.0,和相對于(CH₃)₂SO/(CD₃)₂SO的δ_H 2.49(m)/δ_C 39.5(m)的每百萬部分(ppm)(parts per million)記錄。分裂模式被報(bào)告為s(單峰)、d(雙峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)和br(寬峰)。耦合常數(shù)(J)以Hz給出。ESI-MS實(shí)驗(yàn)在Bruker Daltonics BioTOF III高分辨率質(zhì)譜儀上進(jìn)行。分析薄層色譜法(TLC)在E.Merck硅膠60F₂₅₄板(0.25mm)上進(jìn)行。化合物通過UV、茴香醛或茚三酮噴霧顯示。在70-230目硅膠柱上進(jìn)行柱層析。

通過HPLC(Agilent HP-1 100)在280nm波長檢測，化合物的純度為評估為≥95％。

2',3'-O-亞異丙基-5'-O-(叔丁基二甲基硅基)腺苷(5)

向在冰浴下冷卻的2',3'-(O-亞異丙基)腺苷(4,614mg,2.00mmol)和咪唑(408mg,6mmol)的無水CH₂Cl₂溶液(12mL)中，在氮?dú)夥障潞?℃，添加叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl,452mg,3mmol)。移除冰浴，混合物在室溫下攪拌12小時。加入甲醇(4mL)，混合物再攪拌15分鐘，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮。固體殘留物溶解在CH₂Cl₂，并依次用1M HCl，去離子水和鹽水洗滌。收集有機(jī)層，MgSO₄干燥并過濾。減壓下濃縮濾液，得到化合物5(819mg,1.57mmol,78％收率)，為白色固體。

6-N-叔丁氧羰基-2',3'-O-亞異丙基-5'-O-(叔丁基二甲基硅基)腺苷(6)

化合物5(819mg,1.57mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，催化量)的無水THF溶液(10mL)在氮?dú)庀聰嚢?分鐘。將溶液在冰浴下冷卻，滴加二碳酸二叔丁酯((Boc)₂O,1.08mL,4.71mmol)。移除冰浴，混合物室溫?cái)嚢?2小時。反應(yīng)完成后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮混合物。粗品溶解在CH₂Cl₂中，依次用1M HCl、去離子水和鹽水洗滌。收集有機(jī)層，MgSO₄干燥，過濾。減壓下濃縮濾液，得到淡黃色泡沫狀的雙-Boc化合物(859mg,1.38mmol,87％收率)。

向雙-Boc化合物(400mg,0.64mmol)的甲醇溶液(8mL)中加入甲胺(0.25mL的40％的甲醇溶液,2.54mmol)?；旌衔锸覝?cái)嚢?0小時直到TLC分析表明起始原料完全消耗。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮混合物。粗品在硅膠柱上并用EtOAc/正己烷(0:1到2:1梯度)洗脫液進(jìn)行層析純化，得到淡黃色油狀的化合物6(300mg,0.57mmol,88％收率)。

6-N-(5-溴噻吩-2-基)甲基-6-N-叔丁氧羰基-2',3'-O-亞異丙基-5'-O-(叔丁基二甲基硅基)腺苷(8,X＝5-溴)

化合物6(300mg,0.57mmol)，(5-溴噻吩-2-基)甲醇(164mg,0.85mmol)和三苯基膦(226mg,0.85mmol)的無水THF溶液(9mL)，在氮?dú)夥障?，?5℃攪拌2分鐘。滴加偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD,0.168mL,0.85mmol)。混合物再攪拌45分鐘直到TLC分析顯示化合物6消失。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮混合物。粗品經(jīng)快速柱層析法(EtOAc/正己烷＝1:9)純化，得到淡黃色油狀的化合物8(X＝5-溴)。

N⁶-[(5-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷(JMF3464)

方法A：攪拌化合物8(X＝5-溴,138mg,0.19mmol)在去離子水(5mL)和THF(1mL)中的懸浮液，并冰浴下冷卻。0℃滴加三氟乙酸(5mL)?；旌衔飻嚢?0分鐘，移除冰浴，混合物再攪拌30分鐘。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮混合物。粗品經(jīng)快速柱層析法(MeOH/EtOAc＝1:49)純化，得到白色粉末JMF3464(化合物1)。

方法B：將(5-溴噻吩-2-基)甲胺(768mg,4mmol)，6-氯嘌呤呋喃核糖苷(143mg,0.5mmol)和二異丙基乙胺(2mL,12mmol)在1-丙醇中的混合物(20mL)，在70℃加熱7小時。將包含所需的產(chǎn)物和未反應(yīng)的(5-溴噻吩-2-基)甲胺的混合物，用含二碳酸二叔丁酯(0.92mL,4mmol)的THF(6mL)和NaHCO₃(672mg,8mmol)在室溫下處理2小時。混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并經(jīng)快速柱層析(硅膠，MeOH/EtOAc＝1:9)純化。所需產(chǎn)物JMF3464(59mg,27％收率)如果在MeOH中重結(jié)晶而獲得。通過HC-C18柱(Agilent,4.6×250mm,5μm)并用50％含水MeOH梯度洗脫的HPLC顯示，產(chǎn)物純度為96％。

方法C：向密封管(15mL)中，加入(5-溴噻吩-2-基)甲胺(384mg,2mmol)，6-氯嘌呤呋喃核糖苷(287mg,1mmol)，和二異丙基乙胺(3mL,17mmol)(在乙醇(8mL)中)。密封管放置在聚焦型單模微波反應(yīng)器(CEM Discover)的腔內(nèi)并在80℃下100W照射20分鐘。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除溶劑。殘留物經(jīng)快速柱層析法純化(硅膠，MeOH/EtOAc＝1:9)，并在MeOH中重結(jié)晶，得到所需產(chǎn)物JMF3464(159mg,36％收率)。

C₁₅H₁₆BrN₅O₄S；黃色粉末；mp 141.4–141.7℃；[α]²⁵_D＝–43.0(DMSO,c＝1.0)；TLC(2-丙醇/己烷(2:3))R_f＝0.38；¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ8.55(1H,br s),8.40(1H,s),8.29(1H,br s),7.03(1H,d,J＝3.6Hz),6.78(1H,d,J＝4.0Hz),5.90(1H,d,J＝6.0Hz),5.45(1H,d,J＝6.0Hz),5.34–5.32(1H,m),5.19(1H,d,J＝4.4Hz),4.76(2H,s),4.63–4.59(1H,m),4.15–4.14(1H,m),3.96–3.95(1H,m),3.69–3.65(1H,m),3.57–3.52(1H,m),¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ153.9,152.2,148.5,145.0,140.2,129.6,126.3,120.0,109.7,87.9,85.8,73.5,70.6,61.6,42.9,C₁₅H₁₇BrN₅O₄S的ESI-MS計(jì)算值:442.0185,測得值m/z442.0189[M+H]⁺。

N⁶-(噻吩-3-基-甲基)腺苷(JMF3461)

將3-(氨基甲基)噻吩(0.25mL,2.5mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(143mg,0.5mmol)和二異丙基乙胺(2mL,12mmol)在1-丙醇(25mL)中的混合物，在80℃加熱6小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮混合物，在MeOH中重結(jié)晶，得到所需產(chǎn)品JMF3461(136mg,75％收率)。通過HC-C18柱(Agilent,4.6×250mm,5μm)用50％含水MeOH梯度洗脫的HPLC顯示，產(chǎn)物純度為99％。C₁₅H₁₇N₅O₄S；黃色粉末；mp 134.3–135.1℃；[α]²⁴_D＝–58.6(DMSO,c＝1.0)；TLC(2-丙醇/己烷,(2:3))R_f＝0.33；¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ8.36(2H,br s),8.22(1H,s),7.43(1H,dd,J＝3,5Hz),7.28(1H,d,J＝1.6Hz),7.09(1H,d,J＝4.8Hz),5.88(1H,d,J＝6.4Hz),5.43(1H,d,J＝6.0Hz),5.38(1H,q,J＝4.6Hz),5.17(1H,d,J＝4.4Hz),4.69(2H,s),4.63–4.16(1H,m),4.14–4.13(1H,m),3.97–3.95(1H,m),3.69–3.64(1H,m),3.57–3.52(1H,m),¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ154.4,152.3,148.5,140.8,139.9,127.9,125.1,120.0,119.8,87.9,85.9,73.5,70.7,61.7,42.9；ESI-MS計(jì)算值C₁₅H₁₈N₅O₄S:364.1080,測得值:m/z 364.1079[M+H]⁺。

N⁶-(噻吩-2-基-甲基)腺苷(JMF3462)

將2-(氨基甲基)噻吩(0.25mL,2.5mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(143mg,0.5mmol)和二異丙基乙胺(2mL,12mmol)在1-丙醇(25mL)中的混合物，在80℃加熱7小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮混合物，在MeOH中重結(jié)晶，得到所需產(chǎn)品JMF3462(154mg,85％收率)。通過HC-C18柱(Agilent,4.6×250mm,5μm)用50％含水MeOH梯度洗脫的HPLC顯示，產(chǎn)物純度為99％。C₁₅H₁₇N₅O₄S；白色粉末；mp 149.2–149.7℃；[α]²⁵_D＝–68.2(DMSO,c＝1.0)；TLC(2-丙醇/己烷,(2:3))R_f＝0.35；¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ8.51(1H,br s),8.39(1H,s),8.27(1H,br s),7.32(1H,d,J＝5.2Hz),7.28(1H,d,J＝3.2Hz),6.93(1H,dd,J＝1.8,2.6Hz),5.89(1H,d,J＝6.0Hz),5.46–5.45(1H,m),5.36(1H,q,J＝4.6Hz),5.20–5.18(1H,m),4.64(2H,s),4.16–4.13(1H,m),3.97–3.95(1H,m),3.70–3.65(1H,m),3.58–3.52(1H,m),3.57–3.52(1H,m),¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ154.1,152.2,148.5,142.9,140.0,126.5,125.3,124.7,120.0,87.9,85.9,73.5,70.6,61.6,42.9；ESI-MS計(jì)算值C₁₅H₁₈N₅O₄S:364.1080,測得值:m/z 364.1081[M+H]⁺。

N⁶-[(4-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷

將(4-溴噻吩-2-基)甲胺(1152mg,6mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(214mg,0.75mmol)和二異丙基乙胺(3mL,18mmol)在1-丙醇(30mL)中的混合物，在70℃下加熱7小時。將包含所需產(chǎn)物和未反應(yīng)的(3-溴噻吩-2-基)甲胺的混合物，用含二碳酸二叔丁酯(1.4mL,6mmol)的THF(8mL)和NaHCO₃(1g,1.2mmol)在室溫下處理2小時。混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并經(jīng)快速柱層析(硅膠，MeOH/EtOAc＝1:9)純化，得到N⁶-[(4-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷。

N⁶-[(3-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷

向密封管(15mL)中，加入(3-溴噻吩-2-基)甲胺(576mg,3mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(430mg,1.5mmol)，和二異丙基乙胺(4.5mL,15.5mmol)在乙醇(10mL)中的混合物。密封管放置在聚焦型單模微波反應(yīng)器(CEM Discover)的腔內(nèi)，并在80℃下100W照射20分鐘。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除溶劑。殘留物經(jīng)快速柱層析法純化(硅膠，MeOH/EtOAc＝1:9)，得到N⁶-[(3-溴噻吩-2-基)甲基]腺苷。

N⁶-[(2-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷

向密封管(15mL)中，加入(2-溴噻吩-3-基)甲胺(384mg,2mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(287mg,1mmol)和二異丙基乙胺(3mL,17mmol)在乙醇(8mL)中的混合物。密封管放置在聚焦型單模微波反應(yīng)器(CEM Discover)的腔內(nèi)，并在80℃下100W照射20分鐘。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除溶劑。殘留物經(jīng)快速柱層析法純化(硅膠，MeOH/EtOAc＝1:9)，得到N⁶-[(2-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷。

N⁶-[(4-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷

將(4-溴噻吩-3-基)甲胺(768mg,4mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(143mg,0.5mmol)和二異丙基乙胺(2mL,12mmol)在1-丙醇(20mL)中的混合物，在70℃下加熱7小時。將包含所需產(chǎn)物和未反應(yīng)的(4-溴噻吩-3-基)甲胺的混合物，用含二碳酸二叔丁酯(0.92mL,4mmol)的THF(6mL)和NaHCO₃(672mg,8mmol)在室溫下處理2小時。混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并經(jīng)柱層析(硅膠，MeOH/EtOAc＝1:9)純化，得到N⁶-[(4-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷。

6-N-(5-溴噻吩-3-基)甲基-6-N-叔丁氧羰基-2',3'-O-亞異丙基-5'-O-(叔丁基二甲基硅基)腺苷

化合物6(360mg,0.68mmol)、(5-溴噻吩-3-基)甲醇(197mg,1.02mmol)和三苯基膦(271mg,1.02mmol)的無水THF(10mL)溶液，在氮?dú)夥障潞?5℃攪拌2分鐘。滴加偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD,0.20mL,1.02mmol)。攪拌混合物直到TLC分析顯示化合物6消失。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮混合物。粗品經(jīng)快速柱層析法(EtOAc/正己烷＝1:9)純化，得到6-N-(5-溴噻吩-3-基)甲基-6-N-叔丁氧羰基-2',3'-O-亞異丙基-5'-O-(叔丁基二甲基硅基)腺苷。

N⁶-[(5-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷

攪拌6-N-(5-溴噻吩-3-基)甲基-6-N-叔丁氧羰基-2',3'-O-亞異丙基-5'-O-(叔丁基二甲基硅基)腺苷(138mg,0.19mmol)在去離子水(5mL)和THF(1mL)中的懸浮液，并冰浴下冷卻。0℃滴加三氟乙酸(5mL)?；旌衔飻嚢?0分鐘，移除冰浴，混合物再攪拌30分鐘。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮混合物。粗品經(jīng)快速柱層析法(MeOH/EtOAc＝1:49)純化，得到N⁶-[(5-溴噻吩-3-基)甲基]腺苷。

(5-氯噻吩-2-基)甲胺

將2-(氨基甲基)噻吩(1mL,10mmol)、二碳酸二叔丁酯(2.5mL,11mmol)，和NaHCO₃(840mg,10mmol)在THF中的混合物(13mL)，在室溫下攪拌3小時，得到含淡黃色固體的懸浮液。減壓濃縮混合物，殘留物用CH₂Cl₂和H₂O萃取。有機(jī)相用MgSO₄干燥，過濾，并用EtOAc/正己烷(1:20)洗脫液進(jìn)行硅膠柱快速層析法純化，得到(噻吩-2-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(C₁₀H₁₅NO₂S,1.62g,76％收率)。

將(噻吩-2-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(106mg,0.5mmol)、N-氯代琥珀酰亞胺(73mg,0.55mmol)在苯中的混合物(0.3mL)，在80℃下攪拌。2小時后，加入醋酸(0.3mL,5mmol)，并進(jìn)一步反應(yīng)21小時?；旌衔镉肅H₂Cl₂和H₂O萃取。有機(jī)相用MgSO₄干燥，過濾，并用EtOAc/正己烷(1:20)洗脫液進(jìn)行硅膠柱快速層析法純化，得到(5-氯噻吩-2-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(C₁₀H₁₄ClNO₂S,82.6mg,67％收率)。

將上述制備的化合物(65mg,0.26mmol)和TFA(1mL,13mmol)在CH₂Cl₂中的混合物(1mL)，在室溫下攪拌3小時。減壓濃縮溶液，得到(5-氯噻吩-2-基)甲胺(～100％收率)。C₅H₆NSCl；淡黃色固體；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.07(1H,d,J＝4.0Hz),6.95(1H,d,J＝3.6Hz),4.26(2H,s)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ134.9,132.8,130.7,128.0,38.8；ESI–HRMS計(jì)算值C5H7ClNS:147.9988,測得值:m/z 147.9995[M+H]⁺。

N⁶-[(5-氯噻吩-2-基)甲基]腺苷(JMF3818)

(5-氯噻吩-2-基)甲胺(35.4mg,0.24mmol)、6-氯嘌呤呋喃核糖苷(0.12mmol)和二異丙基乙胺(0.36mL,2mmol)在乙醇(1mL)中的混合物，在封管中，通過微波輻照在80℃下攪拌30分鐘。將混合物冷卻至室溫，減壓濃縮，得到淡黃色油狀物，依次經(jīng)H₂O和MeOH洗滌，得到標(biāo)題化合物JMF3818。C₁₅H₁₆ClN₅O₄S；白色固體；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.29(1H,s),8.27(1H,s),6.88(1H,d,J＝3.6Hz),6.79(1H,d,J＝3.6Hz),5.96(1H,d,J＝6.8Hz),4.74–4.77(1H,m),4.32–4.34(1H,m),4.17(1H,d,J＝2.8Hz),3.89(1H,dd,J＝12.4,2.0Hz),3.75(1H,dd,J＝12.4,2.8Hz)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ156.0,153.6,142.8,142.0,129.9,127.0,126.6,121.7,91.5,88.4,75.6,72.9,63.7,40.4；ESI–HRMS計(jì)算值C₁₅H₁₇ClN₅O₄S:398.0690,測得值:m/z 398.0692[M+H]⁺。

藥代動力學(xué)研究?；衔镆陨睇}水的水溶液進(jìn)行給藥。雄性ICR小鼠購自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd。為了測量受試化合物(T1-11和JMF3464)口服生物利用度，在口服(10mg/kg)或靜脈內(nèi)(1mg/kg)給藥受試化合物之后，從雄性ICR小鼠(6周齡；20-25克)中采集血液樣本。對于T1-11，血液樣本在靜脈內(nèi)給藥后2、10、30、60、120、360分鐘采集，以及在口服給藥后15、30、45、60、120、360分鐘采集。對于JMF3464，血液樣本在靜脈內(nèi)給藥后2、10、30、60、120、240、360、480分鐘采集，以及在口服給藥后15、30、60、90、120、240、360、480分鐘采集。血液樣本通過含0.1％甲酸的甲醇萃取，然后將10μL的萃取樣本注入U(xiǎn)PLC–MSMS中進(jìn)行定量。

運(yùn)用藥代動力學(xué)程序WinNonlin，將數(shù)據(jù)擬合到非室模型，獲得藥代動力學(xué)參數(shù)。藥代動力學(xué)參數(shù)通過時間與對數(shù)濃度的線性回歸估算，其中包括血漿濃度與時間曲線下面積(AUC)，到最后采樣時間的曲線下面積(AUC_0–120)，到無限時間的曲線下面積(AUC_0–∞)，終末期半衰期(T_1/2)，血漿中化合物最大濃度(C_max)，C_max的時間(T_max)，以及與曲線末端部分相關(guān)的一級速率常數(shù)(k)。總血漿清除率(CL)通過劑量/AUCi.v.計(jì)算。受試化合物口服給藥的口服生物利用度(F)，根據(jù)口服劑量的AUC_0–∞除以靜脈注射劑量的AUC_0–∞計(jì)算出。

實(shí)施例2

放射性配體結(jié)合試驗(yàn)。放射性配體結(jié)合試驗(yàn)由MDS Pharma Services Taiwan(臺北，臺灣)，使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合方案進(jìn)行。對于A_2AR結(jié)合試驗(yàn)，從過表達(dá)人A_2AR的HEK293細(xì)胞中收集的膜蛋白，在含有³H-CGS21680(50nM)的反應(yīng)緩沖液[50mM Tris-HCl(pH 7.4)、10mM MgCl₂、1mM EDTA、和2U/mL腺苷脫氨酶]中，在25℃下孵育90分鐘。在50μM腺苷-5'-N-乙基甲酰胺存在下，對非特異性結(jié)合進(jìn)行評估。為了測量T1-11對A₃R的結(jié)合親和力，從過表達(dá)人A₃R的中國倉鼠卵巢(CHO)-Kl細(xì)胞中收集的膜蛋白與³H-AB-MECA(0.5nM)，在25℃下在含有25mM HEPES(pH 7.4)、5mM MgCl₂、1mM CaCl₂、和0.1％牛血清白蛋白的反應(yīng)緩沖液中孵育60分鐘。在1μM IB-MECA(Tocris Bioscience,Ellisville,MO,USA)存在下，對非特異性結(jié)合進(jìn)行評估。針對腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)合試驗(yàn)，按照前面所描述的進(jìn)行操作。從Duncan Hartley衍生的豚鼠的大腦皮層收集的膜組分，與³H-標(biāo)記的6-[(4-硝基芐基)硫代]-9-β-D-呋喃核糖基嘌呤(NBTI,0.5nM)，在25℃下在含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)的孵育緩沖液中孵育30分鐘。在5μM NBTI(一種有效的平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑)存在下，對非特異性結(jié)合進(jìn)行評估。請注意，NBTI是一種高親和力的ENT1抑制劑，并在0.5nM下僅抑制人(h)ENT1。通過GF/B玻璃纖維過濾以及經(jīng)反應(yīng)緩沖液洗滌，來終止反應(yīng)。

細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染

購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas,VA,USA)的大鼠PC12細(xì)胞，維持于在補(bǔ)加10％馬血清和5％FBS的DMEM中并在CO₂孵育器(5％)中在37℃孵育。按照制造商的方案，LIPOFECTAMINE^TM 2000(Invitrogen)被用作將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞的載體。質(zhì)粒由Pulst博士(神經(jīng)科，猶他大學(xué)，USA)友好提供。通常，5μg DNA與5μl LIPOFECTAMINE^TM2000混合，并添加于6孔板的每孔中。板接種數(shù)為(1～1.5)x10⁶細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)染6小時后，細(xì)胞用試劑再處理24小時。通過Zeiss Axiovert 200M倒置熒光顯微鏡(哥廷根，德國)進(jìn)行成像。

MTT分析。存活率通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)代謝試驗(yàn)進(jìn)行評估。簡單地說，處理后，將MTT加到培養(yǎng)基(0.5mg/ml)并在37℃下孵育2～3小時。在96孔板中的接種數(shù)為1x10⁴細(xì)胞/孔。丟棄培養(yǎng)基后，將DMSO加到孔中以溶解甲臜晶體，通過微量-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)讀取器測定每孔中在570和630nm下的吸光度。

實(shí)施例3

動物和給藥。雄性R6/2小鼠(Mangiarini等人,1996Cell.87:493-506)和同窩對照，最初來自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,ME,USA)，并與雌性對照小鼠(B6CBAFI/J)交配。后代通過對基因組DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)基因分型技術(shù)加以鑒定，以確保CAG重復(fù)元件的數(shù)量保持在大約150，其中該基因組DNA是從尾組織中提取的，并使用位于轉(zhuǎn)基因中的引物(5'-CCGCTCAGGTTCTGCTTTTA-3'；SEQ ID NO:1,和5'-GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3'；SEQ ID NO:2)進(jìn)行PCR。動物安置在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)動物護(hù)理設(shè)施研究所(Institute of Biomedical Sciences Animal Care Facility)，接受12/12小時的光亮/黑暗循環(huán)。每日記錄一次小鼠體重。在經(jīng)臺灣省臺北市中央研究院機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和利用委員會(Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Committee)批準(zhǔn)的協(xié)議下，進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)動棒行為(Rotarod performance)。采用轉(zhuǎn)動棒裝置(UGO BASILE,Comerio,Italy)，2分鐘內(nèi)以恒定速度(12rpm)，對動作協(xié)調(diào)性進(jìn)行評估(Carter等,1999J Neurosci.19:3248-3257)。所有小鼠在4周齡時訓(xùn)練2天以使它們熟悉轉(zhuǎn)動棒裝置。然后對4～12周齡的動物每周測試三次。對于每項(xiàng)測試，動物在旋轉(zhuǎn)啟動前被放置在裝置中。落下延遲(Latency to fall)被自動記錄。每只小鼠進(jìn)行三次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)最多2分鐘。

實(shí)施例4

動物。C57BL/6小鼠購自國家實(shí)驗(yàn)動物中心(臺灣)。轉(zhuǎn)基因小鼠(ATAXN2^Q127)由Pulst博士提供。小鼠被放在一個隔音房間里，處于12/12小時光亮/黑暗循環(huán)和受控的溫度(22±2℃)。食物和水可隨意獲得。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用的NIH指南的原則和指示，盡所有努力減少動物使用數(shù)量以及它們的痛苦和不適。這些實(shí)驗(yàn)也經(jīng)中國醫(yī)藥國立研究所的動物護(hù)理和使用委員會機(jī)構(gòu)審查和批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：100-15)。

過濾阻滯試驗(yàn)。此方法按照Wanker等描述的(1999Methods Enzymol.309:375-386)方法并稍作修改。簡單地說，將收獲的細(xì)胞在裂解緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 8.8),100mM NaCl,5.0mM MgCl₂,1mM EDTA,和含l x蛋白酶抑制劑混合物的0.5％(w/v)的IPGEAL(Roche Diagnostics,印第安納波利斯,IN,USA))中再懸浮，并超聲處理10s(1脈沖/秒)。每組中的同等蛋白濃縮物(15～20μg/孔)，使用Bio-Dot SF裝置(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)，通過2％十二烷基硫酸鈉(SDS)預(yù)平衡的醋酸纖維素膜(0.2μm；Whatman,梅德斯通,肯特,UK)進(jìn)行過濾。抽吸時，每個孔用200μl 0.1％SDS洗滌兩次。印跡在含3％脫脂奶粉的TBS(100mM Tris-HC1和150mM NaC1；pH 7.4)中，在室溫下被封閉1小時，然后與抗-多聚谷氨酰胺(1:5000；MAB1574)抗體在含3％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％NaN₃中孵育(4℃過夜)，以探查正常和突變的ATAXN2。隨后的方法與上文所描述的相同。

轉(zhuǎn)動棒行為。這項(xiàng)研究中使用5周齡的野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠。采用轉(zhuǎn)動棒裝置(UGO BASILE,科梅廖,意大利)，5分鐘內(nèi)以增加的速度(10至28rpm)對動作協(xié)調(diào)性進(jìn)行評估。所有小鼠在5周齡內(nèi)訓(xùn)練2天以使它們熟悉轉(zhuǎn)動棒裝置。此外，這周內(nèi)，部分轉(zhuǎn)基因小鼠通過將T1-11溶解在它們?nèi)粘ｏ嬘盟虚_始食用T1-11。然后從6周齡起每周正式測試動物2次。對于每項(xiàng)測試，動物在旋轉(zhuǎn)啟動前被放置在裝置中。落下延遲(Latency to fall)被自動記錄。每只小鼠每次進(jìn)行2次試驗(yàn)。允許小鼠在試驗(yàn)之間休息20～30分鐘。

實(shí)施例5

行為測試。小鼠的平衡和協(xié)調(diào)功能通過進(jìn)行轉(zhuǎn)動棒測試加以確定。小鼠被放置在轉(zhuǎn)動棒裝置的移動鼓狀物(drum)(加速模型，Ugo Basile Biological Research Apparatus)上，然后加速，直到小鼠從鼓狀物落到板上，并使計(jì)時器停止。在4天的過程中在四個日常試驗(yàn)中測量落下延遲。

免疫組化染色。麻醉野生型小鼠或SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠，并心臟灌注含4％多聚甲醛的PBS。大腦在Tissue-Tek包埋介質(zhì)中平衡并在液態(tài)氮中冷凍。通過低溫恒溫器切割制備的冠狀切片(20μm)，在0.1％Triton X-100中滲透化(permeabilized)，并與稀釋的抗-NeuN單克隆抗血清(Chemicon)在4℃下孵育48小時。隨后，清洗切片，并與生物素化的馬抗鼠IgG孵育，接著與親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物一起孵育。然后清洗切片并在二氨基聯(lián)苯胺溶液中顯影。在StereoInvestigator軟件(MBF Bioscience)的協(xié)助下，通過配有Retiga-2000R CCD照相機(jī)(Qlmaging)和3軸計(jì)算機(jī)控制的MAC 600電動平臺(Ludl Electronics)的Leica DM2500顯微鏡，對NeuN陽性神經(jīng)元進(jìn)行顯現(xiàn)和計(jì)數(shù)。每個分析包括對每只小鼠的15個腦切片的處理。

實(shí)施例6

動物和藥物傳送。轉(zhuǎn)基因小鼠B6SJL-Tg(Prnp-TARDBP)4Jlel/J購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，緬因州，USA)，在臺南國家實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因小鼠通過帶有正向引物5'-GGT GGT GGG ATG AAC TTT GG-3'(SEQ ID NO:3)和反向引物5'-GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGC CTA GAC-3'(SEQ ID NO:4)的PCR篩選。野生型小鼠是非轉(zhuǎn)基同窩仔畜(littermates)。6周齡小鼠接受手術(shù)，在腹部腹外側(cè)皮下嵌入含DMSO或指定的JMF1907的1004型ALZET微型滲透泵(DURECT Corporation,庫比蒂諾,CA,USA)。每28天更換泵。

握力。通過握力計(jì)量儀(TSE Systems,Inc.,MO,USA)測量握力。簡單地說，一只小鼠通過它的尾巴被用手抓出并使它抓握一個高度可調(diào)的安裝在力傳感器上的握桿(grip)。拉力通過小鼠尾巴施加到小鼠上。當(dāng)小鼠松開握桿時，最大力量顯示在一個連接控制單元的數(shù)字顯示面板上。每只小鼠重復(fù)測試3次。

旋轉(zhuǎn)桿表現(xiàn)。運(yùn)用裝置(UGO BASILE,科梅廖,意大利)，以恒定速度(40rpm)對野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性評估120秒。所有小鼠訓(xùn)練2周，每周訓(xùn)練2天。然后對小鼠從9周齡起每周正式測試2次。對于每項(xiàng)測試，動物在旋轉(zhuǎn)啟動前被放置在裝置中。落下延遲(Latency to fall)被自動記錄。每只小鼠每次進(jìn)行3次試驗(yàn)。允許小鼠在試驗(yàn)之間休息20分鐘。

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞系(NSC34)是來自Neil Cashman博士(大腦研究中心，不列顛哥倫比亞大學(xué)，加拿大)的慷慨禮物，在含10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素(Invitrogen GibcoBRL,卡爾斯巴德,CA,USA)的高葡萄糖Dulbecco氏修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，在37℃和5％CO₂下培養(yǎng)。

實(shí)施例7

小鼠。8-12周齡的雌性C57BL6N小鼠購自于BioLASCO(宜蘭,臺灣)。

酸誘導(dǎo)的慢性彌漫性疼痛模型。纖維肌痛模型是在Sluka組(Sluka等.,2003Pain.106:229-239)建立的酸誘導(dǎo)的慢性疼痛模型上改進(jìn)的。小鼠短暫地被2％氣化的異氟醚麻醉后，在左腓腸肌接受20μL染料木黃酮(1μM)肌內(nèi)注射。3分鐘后，在相同部位給予20μL酸的鹽水(pH 4.0)注射。小鼠然后發(fā)展成2周以上的持久機(jī)械性痛覺過敏。在小鼠發(fā)展成機(jī)械性痛覺過敏后4天，對T1-11(用0.9-mm/7-cm的管進(jìn)行灌胃口服)的鎮(zhèn)痛效果測試。通過測試小鼠后爪對0.2-mN von Frey細(xì)絲刺激的回縮反應(yīng)，來測定機(jī)械性痛覺過敏。

間歇冷應(yīng)激模型。纖維肌痛模型由Ueda組開發(fā)，其中小鼠經(jīng)間歇冷應(yīng)激處理2天(Nishiyori和Ueda,2008Mol Pain.4:52)。經(jīng)間歇冷應(yīng)激處理的小鼠發(fā)展成持久的(>2周)機(jī)械和熱痛覺過敏。間歇冷應(yīng)激后5天，在這些小鼠中對JMF3464(腹腔內(nèi)或口服)的鎮(zhèn)痛效果進(jìn)行測試。通過測試小鼠后爪對0.2-mN von Frey細(xì)絲刺激的回縮反應(yīng)，來測定機(jī)械性痛覺過敏。

本發(fā)明示例性實(shí)施例的上述描述僅是為了示意和說明而呈現(xiàn)，并非意味是窮盡的或?qū)⒈景l(fā)明限制于所公開的確切形式。根據(jù)上述教導(dǎo)，許多修改和變化都是可能的。

被選取和描述的實(shí)施例和例子是為了解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，以使本領(lǐng)域其它技術(shù)人員能夠利用本發(fā)明和各種實(shí)施例以及適合特定用途的各種變動形式。在不脫離本發(fā)明精神和范圍下，其他實(shí)施例對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的那些技術(shù)人員而言是明顯的。

本說明書中所引用和討論的所有文獻(xiàn)通過引用全部并入本文，如同每篇文獻(xiàn)單獨(dú)通過引用并入一般。