專利名稱：江蘺多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種江蘺多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
江蘺是多年生的大型紅藻，屬于紅藻門(mén)，真紅藻綱，杉藻目，江蘺科，
江蘺屬，世界江蘺藻種類已報(bào)道的約有100種，我國(guó)常見(jiàn)的江蘺藻主要有IO
多種。江蘺藻是我國(guó)海南、廣東、浙江、臺(tái)灣沿海藻類養(yǎng)殖品種之一，主要 作為漁業(yè)養(yǎng)殖飼料和生產(chǎn)食品膠原料，對(duì)其進(jìn)行多糖提取分析的研究報(bào)道很 少。我們經(jīng)過(guò)江蘺藻多糖提取工藝的不斷摸索以及結(jié)合以往的一些經(jīng)驗(yàn)，發(fā) 明了江蘺藻多糖。
江蘺多糖是江蘺藻中的重要生物活性成分之一，多糖是組成生物有機(jī)體 的一類是組成生物有機(jī)體的一類重要生物大分子，作為信息分子廣泛參與細(xì) 胞間配體與受體的相互識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程，與細(xì)胞活化、增 殖、分化及產(chǎn)生細(xì)胞因子等有關(guān)。隨著天然藥物研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn) 海藻多糖具有抗感染、抗腫瘤、抗凝血、抗輻射、清除氧自由基和延緩衰老 的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種江蘺多糖的制備方法，簡(jiǎn)單、安全、環(huán)保、低 成本。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是 一種江蘺多糖的制備方 法，包括以下步驟
(1) 、將采集的江蘺藻沖洗干凈，棄去雜藻和污物，5(TC 10(TC烘干、粉 碎成藻粉；藻粉加入5倍量以上的水進(jìn)行加熱提取，6(TC以上提取30分鐘以 上，降至室溫，過(guò)濾，得濾液①；
(2) 、在濾液中按每公斤江蘺藻粉加入10 20萬(wàn)國(guó)際單位比活力的裂解酶 進(jìn)行酶解，pH值為6.0 9.0，酶解溫度為30°C 60°C，酶解時(shí)間為30 210分鐘；酶解結(jié)束后調(diào)pH值至3.0 4.0，按每公斤江蘺藻粉加入10 20萬(wàn)國(guó) 際單位比活力的蛋白酶進(jìn)行酶解，攪勻后，維持pH值在3.0 4.0， 45°C 50 。C的條件酶解，酶解時(shí)間為450 510分鐘，酶解結(jié)束后加熱至9(rC 10(TC 進(jìn)行酶滅活，酶滅活時(shí)間為5 20分鐘；
(3) 、降至室溫，過(guò)濾，收集濾液；對(duì)濾液調(diào)節(jié)pH值至5.5 7.0;加入 95%的乙醇至乙醇的體積濃度為10% 20%，室溫靜置3.0小時(shí)以上；
(4) 、離心，過(guò)濾，收集濾液，加入95%乙醇醇沉至乙醇的體積濃度為 40% 95%，室溫靜置3.0小時(shí)以上；
(5) 、醇沉后的溶液過(guò)濾，取沉淀物，沉淀物分別用95%乙醇和丙酮洗2 次，真空干燥，即得江蘺多糖。
該制備方法還包括以下步驟-
(6) 、取步驟(5)所制得的江蘺多糖，加入10倍量以上的水?dāng)嚢柽M(jìn)行溶解， 離心，過(guò)濾，取過(guò)濾液；
(7) 、將過(guò)濾液用DEAE層析柱進(jìn)行層析分離，用10 3Ommol/L， pH5.5 7.0磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫；
(8) 、收集層析分離后的目標(biāo)物，用截留分子量為5 100KD的超濾膜進(jìn) 行超濾，收集截留液；
(9) 、截留液加入95%乙醇醇沉至乙醇的體積濃度為40% 95%，室溫靜 置3.0小時(shí)以上；
(10) 、醇沉后的溶液進(jìn)行離心，過(guò)濾，沉淀分別用95%乙醇和丙酮洗2次， 進(jìn)行真空干燥，即得江蘺多糖。
所述步驟(l)還包括有濾渣加入4倍重量以上的水進(jìn)行酶解提取，按每 公斤江蘺藻粉加入10 30萬(wàn)國(guó)際單位比活力的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，所述復(fù)合酶 含有重量比為2 1 : 1 2的纖維素酶和半纖維素酶；維持pH值在3.0 5.5， 酶解溫度為30°C 60°C，時(shí)間為60 250分鐘；酶解結(jié)束后加熱進(jìn)行酶滅活， 酶滅活溫度為卯。C 100。C，酶滅活時(shí)間為5 20分鐘，降溫，過(guò)濾，得濾 液②；所述步驟(2)中裂解酶酶解的為濾液①和濾液②的合并濾液。
所述歩驟(2)中的裂解酶為褐藻膠裂解酶、海藻酸裂解酶、果膠酸裂解酶或果膠酸酯裂解酶。
所述的步驟(3)中過(guò)濾包括，先用濾布進(jìn)行粗過(guò)濾，再用高速冷凍離心機(jī) 進(jìn)行離心，再進(jìn)行抽濾。
所述步驟(6)中的過(guò)濾過(guò)程為用高速冷凍離心機(jī)離心，倒出上清液，收
集沉淀至容器中，用95%的乙醇來(lái)洗，用抽濾器抽干。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過(guò)對(duì)江蘺藻進(jìn)行酶解處理，經(jīng)過(guò)分級(jí)醇沉
及酒精醇沉的方法，第一步分離純化除去其他雜質(zhì)，再經(jīng)過(guò)DEAE層析柱進(jìn) 行層析分離，然后用分子截留為5 10KD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集截留液，
再經(jīng)過(guò)酒精醇沉，第二步分離純化除去其他雜質(zhì)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)如下
1、 江蘺藻直接經(jīng)酶解等生產(chǎn)工藝提取江蘺藻多糖，具有簡(jiǎn)單、安全、環(huán) 保、低成本等優(yōu)點(diǎn)。
2、 本發(fā)明的制備江蘺藻多糖的方法所制備的江蘺藻多糖純度高，收率高，
成色好，可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
3、 本發(fā)明的江蘺藻多糖的制備方法所用的復(fù)合酶對(duì)江蘺藻渣進(jìn)行第二次 酶解浸提，使得江蘺藻細(xì)胞壁破裂，促進(jìn)多糖的溶出，以期達(dá)到提高提取率、 縮短提取時(shí)間、減少能耗等目的。
4、 本發(fā)明的江蘺藻多糖的制備方法所用的裂解酶酶解法，可以裂解糖苷 鍵，得到分子量比較低的低聚糖，提高江蘺藻多糖的生物學(xué)活性。
5、 本發(fā)明的江蘺藻多糖的制備方法所用的蛋白酶酶解法，可以分解糖蛋 白，有利于提高多糖的最終純度。
6、 制備工藝簡(jiǎn)單易行，原料易得，反應(yīng)條件溫和，收率高，穩(wěn)定性好， 對(duì)制備設(shè)備及場(chǎng)所要求也很低，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例1
取2000g江蘺藻粉加入10L的去離子水進(jìn)行加熱提取，提取溫度為85 。C，提取時(shí)間為4h，提取結(jié)束后溫度降至室溫，過(guò)濾，得濾液①8.5L。濾渣 加入10L去離子水，加入0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，加熱至溫度為50°C±2°C。按每kg江蘺藻粉加入20萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)復(fù)合酶的比例進(jìn) 酶解，加入40萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)復(fù)合酶，復(fù)合酶含有重量比為2 1 : l 2的纖維素酶和半纖維素酶；攪勻后，維持pH4.8、溫度5(TC士2。C的條件水 解120min。酶解結(jié)束后加熱進(jìn)行酶滅活，降溫，過(guò)濾，得濾液②9.0L。
合并濾液①和濾液②共得17.5L濾液，用18% (重量百分比)的氫氧化 鈉溶液將pH值調(diào)為6.8，溫度為50。C士2。C，按每kg江蘺藻粉加入18萬(wàn)國(guó) 際單位(比活力)裂解酶(如褐藻膠裂解酶、海藻酸裂解酶、果膠酸裂解 酶或果膠酸酯裂解酶)的比例進(jìn)酶解，加入36萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)裂解酶， 攪勻后，維持pH 6.8、溫度5(TC士2。C的條件水解90min。酶解結(jié)束后用 0.5mol/L的鹽酸調(diào)pH值至3.2，溫度為50°C±2°C，按每kg江蘺藻粉加入 15萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)蛋白酶的比例，加入30萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)蛋 白酶，攪勻后，維持pH3.2、 5(TC士2。C的條件水解480min。酶解結(jié)束后加 熱進(jìn)行酶滅活；
降溫至室溫，過(guò)濾，收集濾液17.0L;濾液加入用18% (重量百分比)的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5;調(diào)過(guò)pH值的濾液加入95%的乙醇至醇濃度為 20%，室溫靜置；離心，過(guò)濾，收集濾液，加入95%乙醇至乙醇體積濃度為 70%，室溫靜置；離心，過(guò)濾，取沉淀，沉淀分別用95%乙醇和丙酮洗2次， 真空干燥，即得江蘺藻多糖粗品243.16g;
取江蘺藻多糖粗品200g，加入8L水?dāng)嚢柽M(jìn)行溶解，離心，過(guò)濾，得濾 液7.5L。用注射用水將DEAE調(diào)成糊狀，采用淤漿式法裝柱，裝柱壓力 0.5Mpa。裝柱后先用400mmol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液清洗，再用20mmol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡，將上述濾液上DEAE層析柱進(jìn)行吸附，用20mmol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液洗脫。收集目標(biāo)物得7.0kg，用對(duì)分子截留為100K的濾 膜進(jìn)行超濾，收集截留液得6.0L。離心，過(guò)濾，加入95%的酒精至醇濃度為 70%,靜置過(guò)夜。離心，過(guò)濾，取沉淀，沉淀分別用95。/。乙醇和丙酮洗2次， 抽干，置真空干燥箱中干燥，即得江蘺藻多糖精品6.41g。取樣測(cè)定其分子量 顯示江蘺多糖的分子量在500 50000道爾頓之間。另外取樣進(jìn)行其它檢測(cè)， 結(jié)果如下1. 多糖鑒別苯酚一硫酸試劑反應(yīng)(陽(yáng)性)
2. 多糖含量98.62% (用苯酚一硫酸法測(cè)定)
實(shí)施例2
取2000g江蘺藻粉加入20L的去離子水進(jìn)行加熱提取，提取溫度為95 °C，提取時(shí)間為6h，提取結(jié)束后溫度降至室溫，過(guò)濾，得濾液①17.0L。濾 渣加入15L去離子水，加入0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，加熱至溫度 為55。C士2。C。按每kg江蘺藻粉加入15萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)復(fù)合酶的比 例進(jìn)酶解，加入30萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)復(fù)合酶，復(fù)合酶含有重量比為2 1 : 1 2的纖維素酶和半纖維素酶；攪勻后，維持pH3.5、溫度45。C士2。C的 條件水解150min。酶解結(jié)束后加熱進(jìn)行酶滅活，降溫，過(guò)濾，得濾液②13.0L。
合并濾液①和濾液②共得30.0L濾液，用18% (重量百分比)的氫氧化 鈉溶液將pH值調(diào)為8.0，溫度為45'C土2'C，按每kg江蘺藻粉加入IO萬(wàn)國(guó) 際單位(比活力)裂解酶的比例進(jìn)酶解，加入20萬(wàn)國(guó)際單位(比活力)裂解 酶(如褐藻膠裂解酶、海藻酸裂解酶、果膠酸裂解酶或果膠酸酯裂解酶)， 攪勻后，維持pH 8.0、溫度45。C士2。C的條件水解120min。酶解結(jié)束后用 0.5mol/L的鹽酸調(diào)pH值至3.8，溫度為45°C±2°C，按每kg江蘺藻粉加入 20萬(wàn)國(guó)際單位比活力蛋白酶的比例，加入40萬(wàn)國(guó)際單位比活力的蛋白酶， 攪勻后，維持pH3.8、 45。C土2。C的條件水解450min。酶解結(jié)束后加熱進(jìn)行 酶滅活；
降溫至室溫，過(guò)濾，收集濾液28.0L;濾液加入用18% (重量百分比)的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0;調(diào)過(guò)pH值的濾液加入95%的乙醇至乙醇體積 濃度為15%，室溫靜置3.0小時(shí)以上；離心，過(guò)濾，收集濾液，加入95%乙 醇至乙醇體積濃度為80%，室溫靜置3.0小時(shí)以上；離心，過(guò)濾，取沉淀， 沉淀分別用95%乙醇和丙酮洗2次，真空干燥，即得江蘺藻多糖粗品268.33g;
取江蘺藻多糖粗品200g，加入10L水?dāng)嚢柽M(jìn)行溶解，離心，過(guò)濾，得濾 液9.5L。用注射用水將DEAE調(diào)成糊狀，采用淤漿式法裝柱，裝柱壓力 0.5Mpa。裝柱后先用400mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液清洗，再用20mmol/LpH6.0磷酸鹽緩沖液平衡，將上述濾液上DEAE層析柱進(jìn)行吸附，用20mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液洗脫。收集目標(biāo)物得9.0kg，用對(duì)分子截留為100K的濾 膜進(jìn)行超濾，收集截留液得8.0L。離心，過(guò)濾，加入95%的酒精至乙醇體積 濃度為80%，靜置過(guò)夜。離心，過(guò)濾，取沉淀，沉淀分別用95%乙醇和丙酮 洗2次，抽干，置真空干燥箱中干燥，即得江蘺藻多糖精品6.23g。取樣測(cè)定 其分子量顯示江蘺多糖的分子量在500 50000道爾頓之間。另外取樣進(jìn)行其 它檢測(cè)，結(jié)果如下
1. 多糖鑒別苯酚一硫酸試劑反應(yīng)(陽(yáng)性)
2. 多糖含量97.71% (用苯酚一硫酸法測(cè)定)
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限 制，雖然本發(fā)明己以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何 熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭 示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離 本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn) 單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1、一種江蘺多糖的制備方法，包括以下步驟(1)、將采集的江蘺藻沖洗干凈，棄去雜藻和污物，50℃～100℃烘干、粉碎成藻粉；藻粉加入5倍量以上的水進(jìn)行加熱提取，60℃以上提取30分鐘以上，降至室溫，過(guò)濾，得濾液①；(2)、在濾液中按每公斤江蘺藻粉加入10～20萬(wàn)國(guó)際單位比活力的裂解酶進(jìn)行酶解，pH值為6.0～9.0，酶解溫度為30℃～60℃，酶解時(shí)間為30～210分鐘；酶解結(jié)束后調(diào)pH值至3.0～4.0，按每公斤江蘺藻粉加入10～20萬(wàn)國(guó)際單位比活力的蛋白酶進(jìn)行酶解，攪勻后，維持pH值在3.0～4.0，45℃～50℃的條件酶解，酶解時(shí)間為450～510分鐘，酶解結(jié)束后加熱至90℃～100℃進(jìn)行酶滅活，酶滅活時(shí)間為5～20分鐘；(3)、降至室溫，過(guò)濾，收集濾液；對(duì)濾液調(diào)節(jié)pH值至5.5～7.0；加入95％的乙醇至乙醇的體積濃度為10％～20％，室溫靜置3.0小時(shí)以上；(4)、離心，過(guò)濾，收集濾液，加入95％乙醇醇沉至乙醇的體積濃度為40％～95％，室溫靜置3.0小時(shí)以上；(5)、醇沉后的溶液過(guò)濾，取沉淀物，沉淀物分別用95％乙醇和丙酮洗2次，真空干燥，即得江蘺多糖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的江蘺多糖的制備方法，其特征在于該制備方法還包括以下步驟(6) 、取步驟(5)所制得的江蘺多糖，加入10倍量以上的水?dāng)嚢柽M(jìn)行溶解， 離心，過(guò)濾，取過(guò)濾液；(7) 、將過(guò)濾液用DEAE層析柱進(jìn)行層析分離，用10 3Ommol/L， pH5.5 7.0磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫；(8) 、收集層析分離后的目標(biāo)物，用截留分子量為5 100KD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集截留液；(9) 、截留液加入95%乙醇醇沉至乙醇的體積濃度為40% 95%，室溫靜 置3.0小時(shí)以上；(10) 、醇沉后的溶液進(jìn)行離心，過(guò)濾，沉淀分別用95%乙醇和丙酮洗2次，進(jìn)行真空干燥，即得江蘺多糖。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的江蘺多糖的制備方法，其特征在于所述步驟(1) 還包括有濾渣加入4倍重量以上的水進(jìn)行酶解提取，按每公斤江蘺藻粉 加入10 30萬(wàn)國(guó)際單位比活力的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，所述復(fù)合酶含有重量比為2 1 : 1 2的纖維素酶和半纖維素酶；維持pH值在3.0 5.5，酶解溫度為 3(TC 6(TC，時(shí)間為60 250分鐘；酶解結(jié)束后加熱進(jìn)行酶滅活，酶滅活溫 度為9(TC 10(TC，酶滅活時(shí)間為5 20分鐘，降溫，過(guò)濾，得濾液②；所 述步驟(2)中裂解酶酶解的為濾液①和濾液②的合并濾液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的江蘺多糖的制備方法，其特征在于所述步驟(2) 中的裂解酶為褐藻膠裂解酶、海藻酸裂解酶、果膠酸裂解酶或果膠酸酯裂 解酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的江蘺多糖的制備方法，其特征在于所述的步 驟(3)中過(guò)濾包括，先用濾布進(jìn)行粗過(guò)濾，再用高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，再 進(jìn)行抽濾。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的江蘺多糖的制備方法，其特征在于所述步驟 (6)中的過(guò)濾過(guò)程為用高速冷凍離心機(jī)離心，倒出上清液，收集沉淀至容器中，用95%的乙醇來(lái)洗，用抽濾器抽干。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種江蘺多糖的制備方法，該江蘺多糖是從紅藻門(mén)，真紅藻綱，杉藻目，江蘺科，江蘺屬(Gracilaria)的常見(jiàn)江蘺中分離提取所得，其分之量為500-50000道爾頓之間，固態(tài)呈淡黃色至白色。該制品可開(kāi)發(fā)成新型抗腫瘤、抗癌藥物。其制備方法可靠易行，適合大規(guī)模生產(chǎn)，不污染環(huán)境，成本低。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101475651SQ20091000126
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者伍曾利, 吳家強(qiáng), 王海生 申請(qǐng)人:伍曾利