專利名稱：：從含蛋白質(zhì)的溶液中分離細(xì)菌脂多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從含蛋白質(zhì)的溶液中分離細(xì)菌脂多糖的方法，并涉及脂多糖的檢測(cè)方法。眾所周知，細(xì)菌脂多糖(LPS)被認(rèn)為是內(nèi)毒素，在給動(dòng)物和人使用時(shí)可以引起(嚴(yán)重的)熱源反應(yīng)。因此，已認(rèn)識(shí)到LPS引起的休克、發(fā)燒、白細(xì)胞減少、高血糖、血管內(nèi)血凝固以及其它生物效應(yīng)。為此，當(dāng)高于某一閾濃度的LPS時(shí)，將不準(zhǔn)許藥品或生物制品給動(dòng)物和人使用。在溶液中，LPS按雙層方式排列，類似于磷脂的雙層。二價(jià)陽(yáng)離子例如Ca++能穩(wěn)定所述雙層。這些龐大的雙層結(jié)構(gòu)的大小可以通過(guò)使用洗滌劑或膽汁鹽來(lái)降低。由此形成的LPS和洗滌劑或膽汁鹽的混合膠束的分子量較小，這提供了用超濾法(ultrafiltration)或微量過(guò)濾法(microfiltration)將所述膠束結(jié)合LPS從產(chǎn)品中分出來(lái)的可能。利用細(xì)菌LPS的基本特性，還有一些其它方法被描述用來(lái)從感興趣的產(chǎn)品中除去LPS。其中有方法利用有機(jī)物質(zhì)例如苯酚、三氯乙酸或苯酚/氯仿/石油醚混合物或用內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(ENP)中和LPS。后一個(gè)方法適宜于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模除去LPS，但蛋白質(zhì)明顯損失。此外，LPS已通過(guò)利用樹(shù)脂、荷電過(guò)濾器(chargedfilters)、硫酸鋇、洗滌劑和膽汁酸或其衍生物來(lái)去除(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4315919和Sweadner等人，Appl.andEnv.Microbiology34，1977，382-385)，它們與或不與螯合劑合用。盡管上述方法在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模能不同程度地從含蛋白質(zhì)的溶液中去除LPS，但這些方法均不適于在工業(yè)規(guī)模上以低成本和高效率的方式從這樣的溶液中分離LPS。本發(fā)明的目的是提供從含蛋白質(zhì)的溶液中去除LPS的簡(jiǎn)單而可靠的方法，該方法完全可以在工業(yè)上使用。在一些場(chǎng)合需要定量或定性測(cè)定溶液中細(xì)菌LPS的診斷方法(LAL試驗(yàn))。用于該目的經(jīng)典試驗(yàn)是凝膠凝塊試驗(yàn)(gelclottest)和有關(guān)的顯色試驗(yàn)。但為了準(zhǔn)確，這兩個(gè)試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件的要求高。因此常常難于得出結(jié)果，尤其是在LPS濃度在低的檢測(cè)范圍內(nèi)的時(shí)候，因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供對(duì)溶液、特別是含干擾化合物的溶液中的LPS進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的方法。已出人意料的發(fā)現(xiàn)，采用下述方法可將LPS高效率地從含蛋白質(zhì)的溶液中分離出來(lái)，即將至少一種合適的增溶劑加到所述溶液中并使該溶液與玻璃表面接觸，然后從該含量蛋白質(zhì)的溶液中分離載有LPS的玻璃表面。本發(fā)明的方法能從含水溶性蛋白質(zhì)以及膜結(jié)合蛋白質(zhì)的溶液中基本上去除LPS。業(yè)已證明，本發(fā)明方法特別適于從LPS嚴(yán)重污染的含蛋白質(zhì)的溶液中除去LPS。本發(fā)明方法非常簡(jiǎn)便，可容易地應(yīng)用到工業(yè)上。用在本發(fā)明方法中的適宜增溶劑是洗滌劑，這樣的洗滌劑包括非離子和離子表面活性物質(zhì)兩者。非離子表面活性物質(zhì)也包括膽汁酸鹽，例如膽酸鹽，離子表面活性物質(zhì)也包括具有偶極離子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。所選擇的增溶劑應(yīng)不影響含蛋白質(zhì)溶液所需的生物活性。玻璃表面應(yīng)理解為也包括透明的表面，即透明材料如陶瓷材料的表面，但優(yōu)選玻璃，特別是常規(guī)未預(yù)處理的玻璃。用在本發(fā)明中的玻璃表面的適宜例子有玻璃珠、小玻璃瓶、玻璃管、玻璃片和玻璃濾器。本發(fā)明方法優(yōu)選根據(jù)含蛋白質(zhì)溶液的組成及其成分特別是蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和/或污染LPS的特性在某些有利的條件下進(jìn)行。所選擇的條件應(yīng)不影響含蛋白質(zhì)溶液的所需的生物活性。優(yōu)選使用低離子強(qiáng)度基本上是水的溶液。在處理期間，溶液的溫度不十分嚴(yán)格，但一般約室溫是很合適的。優(yōu)選溶液具有足夠高的pH，例如在約8-9.5的范圍內(nèi)。pH可以通過(guò)加適當(dāng)?shù)木彌_劑如磷酸鹽緩沖劑、HEPES緩沖劑或TRIS緩沖劑來(lái)調(diào)節(jié)。盡管所述溶液可以用所述玻璃表面處理(培養(yǎng))過(guò)夜，但培養(yǎng)時(shí)間一般少于1小時(shí)，甚至大約10分鐘就已經(jīng)足夠了。此外，按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)結(jié)合到玻璃表面而從溶液中分離出的LPS的量可以例如采用商品凝膠凝塊試驗(yàn)或顯色試驗(yàn)成套儀器在該儀器供應(yīng)廠商推薦的反應(yīng)的條件下來(lái)準(zhǔn)確地檢測(cè)和測(cè)定。因此，本發(fā)明方法具有廣泛的用途，其使用范圍從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用到無(wú)LPS的生物制品的生產(chǎn)。例如，來(lái)自動(dòng)物的蛋白質(zhì)(例如白蛋白)常常是LPS污染的，可將其在進(jìn)一步使用例如作為組織培養(yǎng)成分前純化。因此為臨床或?qū)嶒?yàn)作為組織培養(yǎng)成分前純化。因此為臨床或?qū)嶒?yàn)室的目的而指定的單克隆抗體、治療蛋白質(zhì)、酶、病毒疫苗和細(xì)菌疫苗通訊生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(生長(zhǎng)因子等)可以從例如來(lái)自組織培養(yǎng)介質(zhì)或細(xì)菌的細(xì)胞壁或來(lái)自培養(yǎng)后處理的LPS污染中純化得到。例如卵誘導(dǎo)的(egg-derived)疫苗如滅活的疫苗可被容易地消除污染。本發(fā)明可以進(jìn)一步解釋如下首先使LPS游離，并優(yōu)選在前述有利的條件下采用下述方法使其成為小膠束一部分添加至少一種增溶劑，一般是洗滌劑，或者使用幾種增溶劑，例如洗滌劑與螯合劑合用。適宜的金屬離子螯合劑是多(乙酸化胺)，例如EDTA、DTPA等，以及可任選的羥基化多酸，例如檸檬酸、草酸、酒石酸等，以及它們的堿金屬鹽。優(yōu)選使用形成小膠束且因而可被容易地從基本上是水的溶液中去除的洗滌劑，例如膽酸鹽(例如去氧膽酸鹽(DOC)或其類似物)。于是LPS通過(guò)吸附至適宜的玻璃表面而被從本體溶液中去除，載有LPS的玻璃表面接著被去除，下一步，可以例如通過(guò)(透析)(dia)過(guò)濾或與樹(shù)脂(例如Amberlite)結(jié)合將洗滌劑除去。得到的蛋白質(zhì)溶液幾乎完全沒(méi)有LPS。已發(fā)現(xiàn)，玻璃表面，例如以玻璃珠(例如直徑5mm，表面74.2mm2)形成的玻璃表面結(jié)合至少10μgLPS或≥105EU(＝用LAL試驗(yàn)測(cè)定的內(nèi)毒素單位，lngLPS＝約10EU)。洗滌劑DOC可以容易地通過(guò)用截留值(cut-offvalue)至少為30或50Kd的膜超濾被容易地除去。若采用合適的熟知的用于除去洗滌劑的方法和材料，蛋白質(zhì)的回收率≥95%是可能的。由從含血細(xì)胞凝集素的溶液去除內(nèi)毒素獲得了有說(shuō)服力的數(shù)據(jù);參見(jiàn)實(shí)施例。在除去洗滌劑之前用蛋白質(zhì)法和采用單一輻射擴(kuò)散(singleRadialDiffusion)法的免疫化學(xué)測(cè)定法測(cè)定，所述病毒膜蛋白的回收率為100%，這表明未能檢測(cè)到由于吸附到玻璃上造成的蛋白質(zhì)損失。本發(fā)明用以下具體實(shí)施例更詳細(xì)地加以說(shuō)明。實(shí)施例1在實(shí)施例中，采用下述通法。將下列物質(zhì)混合并溶于水來(lái)制備磷酸鹽緩沖溶液EDTA·2Na(1860mg/l)，NaCl(877.5mg/l)，Na2HPO4(710mg/l)。通過(guò)加入0.5mol/lNaOH將pH調(diào)至9.5。通過(guò)按上述相同方法將10%(V/V)脫氧膽酸鹽(DOC)的水溶液調(diào)至pH9.5來(lái)制備脫氧膽酸儲(chǔ)液。其它的洗滌劑儲(chǔ)液按相應(yīng)的方法來(lái)制備。將含蛋白質(zhì)例如被細(xì)菌LPS嚴(yán)重污染(例如大約300000EU/ml)的流感血細(xì)胞凝集素起始溶液用9體積上述緩沖溶液稀釋。得到的蛋白質(zhì)濃度為125μg/ml。將DOC儲(chǔ)液加至終濃度為1%，并將混合物于20℃培養(yǎng)至少1小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)均在不銹鋼管中進(jìn)行。然后加入玻璃珠(直徑5mm，表面74.2mm)。將混合物于20℃輕輕地回蕩過(guò)夜。然后用LAL試驗(yàn)法測(cè)定未結(jié)合到所述玻璃珠上的游離內(nèi)毒素的量。欲加玻璃的最小量可以由原LPS含量和上面得到的信息來(lái)計(jì)算。過(guò)量的玻璃不影響LPS的去除。通過(guò)將溶液轉(zhuǎn)移至另一容器中而將溶液與玻璃珠分離可以獲得幾乎沒(méi)有LPS的蛋白質(zhì)溶液(例如0.5-50EU/ml)。玻璃結(jié)合LPS的量可以通過(guò)顯色試驗(yàn)法來(lái)檢測(cè)。在以上低離子強(qiáng)度和pH7以上的條件下，DOC可容易地通過(guò)超濾例如用適宜分子量截留值(MWCO)的過(guò)濾器來(lái)去除。顯然，所用過(guò)濾器的選擇主要取決于感興趣的蛋白質(zhì)的大小和洗滌劑膠束的大小。例如用MWCO50Kd的膜以所需的緩沖劑透析過(guò)濾可有效地從流感血細(xì)胞凝集素制劑中除去DOC?；蛘?，可將DOC與適宜的樹(shù)脂(例如AmberliteXAD-4)結(jié)合。各種洗滌劑的使用在以上通法的條件下用2顆玻璃珠在各種洗滌劑存在下處理含流感血細(xì)胞凝集素(HA-蛋白質(zhì))被內(nèi)毒素嚴(yán)重污染(自大腸桿菌(E.coli)0111/B4的外膜)的溶液。使用的洗滌劑是脫氧膽酸鹽(DOC)、正辛基葡糖甙(N-oct-gl.)、十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)和TritonX100。得到下列結(jié)果<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">洗滌劑濃度細(xì)菌LPS---N-oct.-glCTABTriton×100DOC0%1%1%1%1%96,000EU/ml＜3,000EU/ml＜1,500EU/ml＜1,500EU/ml＜50EU/ml</table></tables>實(shí)施例Ⅱ洗滌劑濃度的變化在實(shí)施例1所述的相同條件下試驗(yàn)各洗滌劑濃度。在本實(shí)施例中使用HA-蛋白質(zhì)，所得結(jié)果如下<tablesid="table2"num="002"><tablealign="center">洗滌劑濃度細(xì)菌LPS---DOCDOC0%0.5%1%96,000EU/ml3,000EU/ml＜300EU/ml</table></tables>實(shí)施例Ⅲ蛋白質(zhì)的變化在實(shí)施例1所述的相同條件下，將本發(fā)明方法用于各種蛋白質(zhì)的去污染。所用蛋白質(zhì)如下血細(xì)胞凝集素(HA)、牛血清白蛋白(BSA)和兔免疫球蛋白(ⅠgG)。所得結(jié)果如下<tablesid="table3"num="003"><tablealign="center">洗滌劑濃度蛋白質(zhì)細(xì)菌LPS---DOCDOCDOC0%1%1%1%HA+BSA+lgGHABSAlgG6,000EU/ml＜50EU/ml＜300EU/ml＜1,500EU/ml</table></tables>實(shí)施例Ⅳ內(nèi)毒素污染的改變?cè)趯?shí)施例1所述的相同條件下，用本發(fā)明方法研究被各種內(nèi)毒素污染的HA-蛋白質(zhì)，所述內(nèi)毒有大腸肝菌0111∶B4，明尼蘇達(dá)沙門氏菌Re595(Re突變體)和綠膿假單胞菌10。所得結(jié)果如下>實(shí)施例Ⅴ玻璃表面的存在與否將4ml內(nèi)毒素嚴(yán)重污染的HA-蛋白質(zhì)(125μg/ml)、0%或1.1%DOC和磷酸鹽緩沖劑的溶液在實(shí)施例1所述的相同條件下以及有或無(wú)玻璃珠存在的情況下進(jìn)行處理。所得結(jié)果如下<<p>用明尼蘇達(dá)沙門氏菌污染的HA蛋白質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)，結(jié)果如下權(quán)利要求1.從含蛋白質(zhì)溶液中分離細(xì)菌脂多糖(LPS)的方法，其中所述LPS通過(guò)使用至少一種合適的增溶劑被釋入所述溶液，所述方法的特征在于使所述溶液與玻璃表面接解，然后從所述含蛋白質(zhì)溶液中分離出載有LPS的玻璃表面。2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于LPS通過(guò)加入適當(dāng)?shù)南礈靹﹣?lái)釋放。3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于LPS通過(guò)加入適當(dāng)?shù)南礈靹┖徒饘匐x子螯合劑的混合物來(lái)釋放。4.按照權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于去氧膽酸鹽或其類似物被用作洗滌劑。5.按照權(quán)利要求2、3或4的方法，其特征在于該方法在低離子強(qiáng)度且pH在約8-9.5范圍內(nèi)的基本上是水的溶液中實(shí)施。6.按照權(quán)利要求1至5之任一的方法，其特征在于將LPS釋入溶液中的試劑在去除載有LPS的玻璃表面后被從所述含蛋白質(zhì)溶液中去除。7.在溶液中測(cè)定細(xì)菌LPS的方法，其特征在于使LPS結(jié)合至玻璃表面，接著分離載有LPS的玻璃表面，然后用本身已知的方法測(cè)定結(jié)合至玻璃表面的LPS的量。全文摘要本發(fā)明涉及從含蛋白質(zhì)溶液中分離細(xì)菌脂多糖(LPS)的方法，其中LPS通過(guò)使用至少一種合適的增溶劑被釋入到所述溶液中，并使所述溶液與玻璃表面接觸，然后從所述含蛋白質(zhì)溶液中分離出載有LPS的玻璃表面。此外，按照本發(fā)明方法，溶液中的LPS可以容易地通過(guò)常規(guī)方法，通過(guò)首先使所述LPS按上述方法結(jié)合到玻璃表面來(lái)檢測(cè)。文檔編號(hào)C07K1/14GK1106021SQ9410816公開(kāi)日1995年8月2日申請(qǐng)日期1994年7月22日優(yōu)先權(quán)日1993年7月26日發(fā)明者R·康皮埃,J·B·施盧特哈克,G·J·M·范沙倫堡,B·C·布雷施奈德,R·布蘭斯申請(qǐng)人:杜法爾國(guó)際研究公司